一種殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體及制備方法
【專利摘要】一種殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，其包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性成分，該長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的脂質(zhì)體，該活性成分為蟛蜞菊內(nèi)酯，將蟛蜞菊內(nèi)酯包封于脂質(zhì)體雙層膜之間。該納米脂質(zhì)體的制備方法主要是：將蟛蜞菊內(nèi)酯、大豆卵磷脂和膽固醇溶解于無水乙醇中，恒溫磁力攪拌得到均一的油相，再將聚乙二醇-2000和殼聚糖加入到水化介質(zhì)磷酸緩沖液中恒溫磁力攪拌得到水相；將上述油相逐滴滴入水相中，得脂質(zhì)懸液；去除無水乙醇，采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲。本發(fā)明可在常溫常壓及溫和的條件下完成，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)易于控制，得到的脂質(zhì)體具理想的形貌，提高其生物利用率。
【專利說明】一種殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物的脂質(zhì)體及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膨蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone, WL),分子式C16H1007,分子量314.25,屬于呋喃香豆素類，在植物中分布較局限，大都從金盞蟛蜞菊和墨旱蓮中提取分離而得，它可以抗大鼠的四氯化碳、氨基半乳糖和毒傘素誘導(dǎo)肝毒，并能刺激肝細(xì)胞再生。在Mors W B和合作伙伴Melo P A的研究中發(fā)現(xiàn)，蟛蜞菊內(nèi)酯具備抗蛇毒的作用。此外，它的免疫調(diào)節(jié)，消炎，選擇性的酶抑制等作用為人類的新藥研發(fā)提供了更多的選擇。[0003]研究發(fā)現(xiàn)，蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa的抑制作用，能夠阻礙DNA的合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。近期，中科院上海藥物研究所俞強(qiáng)課題組在美國《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)上發(fā)表的最新科研成果表明，蟛蜞菊內(nèi)酯具有顯著增強(qiáng)干擾素-Y (IFN-Y)信號(hào)，并且提高其抗腫瘤活性的作用。報(bào)道稱，干擾素-Y作為一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，不僅在控制人類微生物感染方面起著重要作用，還具有良好的抗腫瘤活性。蟛蜞菊內(nèi)酯在不影響干擾素-Y和其受體的結(jié)合的情況下，通過延長(zhǎng)STATl (信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)的酪氨酸磷酸化以增強(qiáng)干擾素-Y信號(hào)?；谝陨狭信e的科研成果，我們認(rèn)為蟛蜞菊內(nèi)酯將成為一種優(yōu)異的抗腫瘤候選化合物。蟛蜞菊內(nèi)酯無明顯細(xì)胞毒作用，因此具有較好的開發(fā)前景。
[0004]然而，蟛蜞菊內(nèi)酯在水中極低的溶解度，不利于人體對(duì)該藥物的吸收，生物利用率低，致使其用藥量大，用藥次數(shù)頻繁，限制了其藥理作用的充分發(fā)揮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能增加蟛蜞菊內(nèi)酯在水中溶解度的殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體及制備方法。本發(fā)明的方法主要是以大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用改進(jìn)的乙醇注入法結(jié)合超聲法制備蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性成分，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的脂質(zhì)體，所述活性成分為蟛蜞菊內(nèi)酯，將蟛蜞菊內(nèi)酯包封于脂質(zhì)體雙層膜之間。
[0006]本發(fā)明的制備方法具體如下:
[0007]1、原料:蟛蜞菊內(nèi)酯(WL)，大豆卵磷脂(SPC)，膽固醇(Chol)，殼聚糖(CS)，聚乙二醇-2000 (PEG-2000)。
[0008]2、制備方法:
[0009](I)將蟛蜞菊內(nèi)酯、大豆卵磷脂和膽固醇以1:50~80:2~10的質(zhì)量比,最好以1:65:6的質(zhì)量比,溶解于無水乙醇中，并且Img膨蜞菊內(nèi)酯溶解于2~5ml無水乙醇中，在38~48°C恒溫磁力攪拌得到均一的油相，即脂質(zhì)乙醇溶液；[0010](2)將與蟛蜞菊內(nèi)酯質(zhì)量比均為1:1~10，最好為1:2，的聚乙二醇-2000和殼聚糖加入到38~48°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.5)中，其中殼聚糖用0.1~0.5%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4左右，于38~48°C水化溫度，最好38°C，恒溫磁力攪拌得到水相；
[0011](3)將步驟(1)獲得的脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入步驟(2)獲得的水相中，得脂質(zhì)體懸液；
[0012](4)將上述脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇去除，旋蒸去除或是攪拌足夠的時(shí)間去除，
(5)采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲，超聲功率500~600w，超聲時(shí)間2~5s，間隔時(shí)間2~5s,總時(shí)間9~15min,得到小單層膨蜞菊內(nèi)酯脂質(zhì)體；
[0013](6)將得到的小單層蟛蜞菊內(nèi)酯脂質(zhì)體置于4°C保存。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0015]1、本發(fā)明的納米脂質(zhì)體具理想的形貌，包封率可達(dá)90%以上，粒徑分布在50-150nm，不僅具有一般納米藥物所具有的多種優(yōu)點(diǎn)，如比小尺寸效應(yīng)，比表面積大，吸收效率高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是一方面極大地提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，改善蟛蜞菊內(nèi)酯的給藥方式，提高其生物利用率，降低用藥量，提高治療效果；另一方面可發(fā)揮其緩釋作用。
[0016]2、本發(fā)明在常溫、常壓及溫和條件下完成，制備方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)易控制，重復(fù)性高，產(chǎn)率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明例I所得蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體透射電子顯微鏡TEM圖。
[0018]圖2是本發(fā)明例2所得蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體透射電子顯微鏡TEM圖。
[0019]圖3是本發(fā)明例3所得蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體透射電子顯微鏡TEM圖。
[0020]圖4是本發(fā)明蟛蜞菊內(nèi)酯最大吸收峰位置測(cè)定圖。
[0021]圖5是本發(fā)明測(cè)定前繪制的蟛蜞菊內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0022]圖6是本發(fā)明殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體與蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]例I
[0024]取I毫克蟛蜞菊內(nèi)酯(購自上海展舒化學(xué)科技有限公司)、50毫克大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)和10毫克膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)溶解于2毫升的無水乙醇中，43°C恒溫溫度磁力攪拌得到均一的油相，即脂質(zhì)乙醇溶液。取10毫克聚乙二醇-2000 (購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)和10毫克殼聚糖，該殼聚糖用0.1%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，將上述聚乙二醇-2000和殼聚糖乙酸溶液加入到48°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.5)中，48°C恒溫磁力攪拌得到水相。將上面獲得的脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入獲得的水相中，得脂質(zhì)體懸液。將上述脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇旋蒸去除，采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲，超聲功率500W，超聲5s，間隔5s，共9min，得到小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，將得到的小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體置于4°C保存。
[0025]例2
[0026]取I毫克蟛蜞菊內(nèi)酯(購自上海展舒化學(xué)科技有限公司)、65毫克大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)和6毫克膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)溶解于2毫升的無水乙醇中，38°C恒溫溫度磁力攪拌得到均一的油相，即脂質(zhì)乙醇溶液。取2毫克聚乙二醇-2000 (購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)和2毫克殼聚糖，該殼聚糖用0.1%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，將上述聚乙二醇-2000和殼聚糖乙酸溶液加入到38°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液(0.1M，pH6.5)中，38°C恒溫磁力攪拌得到水相。將上面獲得的脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入獲得的水相中，得脂質(zhì)體懸液。將上述脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇旋蒸去除，采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲，超聲功率600W，超聲5s，間隔5s，共lOmin，得到小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，將得到的小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體置于4°C保存。
[0027]例3
[0028]取I毫克蟛蜞菊內(nèi)酯(購自上海展舒化學(xué)科技有限公司)、80毫克大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)和2毫克膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)溶解于5毫升的無水乙醇中，48°C恒溫溫度磁力攪拌得到均一的油相，即脂質(zhì)乙醇溶液。取10毫克聚乙二醇-2000 (購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)和10毫克殼聚糖，該殼聚糖用0.5%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，將上述聚乙二醇-2000和殼聚糖乙酸溶液加入到43°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液(0.現(xiàn)，？?jī)?cè).5)中，431:恒溫磁力攪拌得到水相。將上面獲得的脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入獲得的水相中，得脂質(zhì)體懸液。將上述脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇旋蒸去除，采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲，超聲功率500W，超聲3s，間隔3s，共15min，得到小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，將得到的小單層蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體置于4°C保存。
[0029]為證明制備產(chǎn)物為蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，對(duì)其進(jìn)行透射電子顯微鏡(TEM表征，采用高效液相色譜儀測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯的包封率，操作如下:
[0030]室溫下取上面獲得的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體分散液用適量去離子水稀釋，取1-2滴納米脂質(zhì)體分散液置于300目的銅網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，于透射電子顯微鏡(TEM)下觀察納米脂質(zhì)體的形態(tài)，如圖1、圖2和圖3所示。由電鏡照片可知，表面修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體微球分散性好，粒度分布窄，輪廓清晰，形態(tài)規(guī)整。
[0031]殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體包封率的測(cè)定:測(cè)定包封率之前首先需采用紫外可視光譜儀測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯最大吸收峰位置，測(cè)定結(jié)果如圖4所示，然后采用葡聚糖凝膠法將脂質(zhì)體懸液中游離的蟛蜞菊內(nèi)酯、殼聚糖、聚乙二醇分離出來，上樣量為ImL,洗脫速度為1.0mL/min,最大吸收峰設(shè)定為350nm,當(dāng)?shù)鞍准兓到y(tǒng)顯示出峰時(shí)進(jìn)行收集，然后精密地吸取該液體ImL置于5mL容量瓶，用色譜純甲醇溶解并定容，高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其峰面積，計(jì)算包封率。高效液相色譜條件為:色譜柱，AngilentZORBA X 300SB-C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m);流動(dòng)相為甲醇:0.5% 的醋酸溶液(55:45, V/V);流速選為1.0mL/min ;柱溫為30°C ;采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)350nm ;進(jìn)樣量為20 μ L。繪制蟛蜞菊內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示，測(cè)定各樣品包封率，最終結(jié)果為:例I樣品包封率為58.4%，例2樣品包封率為92.2%，例3樣品包封率為69.8%。[0032]采用例2所得蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，圖6即為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，結(jié)果表明蟛蜞菊內(nèi)酯脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率可達(dá)80%,明顯優(yōu)于單純采 用蟛蜞菊內(nèi)酯的抑制效果。
【權(quán)利要求】
1.一種殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體，其特征在于:該載藥脂質(zhì)體包括長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和包裹于其中的藥物活性成分，所述長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為脂質(zhì)體表面被殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的脂質(zhì)體，所述活性成分為蟛蜞菊內(nèi)酯，將蟛蜞菊內(nèi)酯包封于脂質(zhì)體雙層膜之間。
2.權(quán)利要求1的殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于: (1)將蟛蜞菊內(nèi)酯、大豆卵磷脂和膽固醇以1:50~80:2~10的質(zhì)量比溶解于無水乙醇中，并且Img蟛蜞菊內(nèi)酯溶解于2~5ml無水乙醇中，在38~48°C恒溫磁力攪拌得到均一的油相，即脂質(zhì)乙醇溶液； (2)將與蟛蜞菊內(nèi)酯質(zhì)量比均為1:1~10的聚乙二醇-2000和殼聚糖加入到38~48°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.5)中，其中殼聚糖用0.1~0.5%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4左右，于38~48°C恒溫磁力攪拌得到水相； (3)將步驟(1)獲得的脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入步驟(2)獲得的水相中，得脂質(zhì)懸液； (4)將上述脂質(zhì)懸液中的無水乙醇去除； (5)采用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)冰浴下將其間隔性超聲，超聲功率500~600w，超聲時(shí)間2~5s,間隔時(shí)間2~5s,總時(shí)間9~15min,得到小單層膨蜞菊內(nèi)酯脂質(zhì)體； (6)將得到小單層脂質(zhì)體置于4°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于:蟛蜞菊內(nèi)酯、大豆卵磷脂和膽固醇以1:65:6的質(zhì)量比溶解于無水乙醇中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于:將與蟛蜞菊內(nèi)酯質(zhì)量比均為1:2的聚乙二醇-2000和殼聚糖加入到38~48°C的水化介質(zhì)磷酸緩沖液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖和聚乙二醇聯(lián)合修飾的蟛蜞菊內(nèi)酯納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于:水化溫度為38°C。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK103919729SQ201410106387
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】高大威, 李楠, 劉艷平, 邊艷紅, 趙婷婷 申請(qǐng)人:燕山大學(xué)