一種聚乙二醇修飾的人干擾素與人抗菌肽融合蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域
【背景技術(shù)】
[0002] 化thelicidin家族是一類在哺乳動(dòng)物、禽類、魚類及爬行動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的保守的 抗菌膚。化-37是人體唯一合成的化thelicidin家族抗菌膚，主要由免疫細(xì)胞和上皮細(xì) 胞表達(dá)合成。Lk37的序列為L(zhǎng)LGDFF服SKEKIGKEFKRIVQRI邸化RNLVPRTES，因前兩個(gè)均為 LL(亮氨酸）且序列長(zhǎng)度為37而得名。α-37通過(guò)結(jié)構(gòu)中形成的正6個(gè)正電荷的雙親超螺 旋與細(xì)菌細(xì)胞膜磯脂的親水部結(jié)合，然后其疏水部翻轉(zhuǎn)插入磯脂雙分子層，從而引起細(xì)胞 膜的破壞。Lk37對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有效果，其抗菌譜廣，受到研究與應(yīng)用領(lǐng)域的廣 泛重視。
[0003] 干擾素是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫的作用， 在臨床上獲得廣泛應(yīng)用。干擾素在臨床上使用存在的主要問(wèn)題是由于其分子量小，容易被 血清中的蛋白酶降解和被腎小球過(guò)濾掉。克服干擾素使用過(guò)程中缺陷的有效手段，一是通 過(guò)融合表達(dá)，增加分子量；二是通過(guò)表面修飾，防止蛋白酶的降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 1PEG表觀質(zhì)量檢測(cè)
[0005] 陽(yáng)G5000、PEG10000、陽(yáng)G20000用測(cè)酸-測(cè)砂緩沖液（pH9. 0)溶解成終濃度lOmg/ mL。進(jìn)行SDS-PAGE分析，采用而礙染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0006] 2PEG分子量對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0007] 配制蛋白濃度〇.6mg/mL3份，按蛋白：陽(yáng)G(摩爾比）=1 : 10分別加入 mPEG5000-SS、陽(yáng)G10000-SS和陽(yáng)G20000-SS，反應(yīng)條件為 4°C、6h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0008] 3融合蛋白濃度對(duì)產(chǎn)物修飾率的影響
[0009]按濃度梯度 0. 2mg/mL、0. 4mg/血、0. 6mg/血、0. 8mg/血、1.Omg/血、1. 2mg/mL,蛋 白：mPEG-SS(摩爾比）=1 : 10修飾反應(yīng)液，反應(yīng)條件為4°C、6h，取樣分析融合蛋白修飾 率。
[0010] 4蛋白與mPEG-SS摩爾比對(duì)產(chǎn)物修飾率的影響
[0011] 在上述確定的最佳蛋白濃度下，分別取蛋白：mPEG-SS(摩爾比）=1 : 5、1 : 10、 1 : 15、1 : 20、1 : 25制備修飾反應(yīng)液，反應(yīng)條件為4°C、6h，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0012] 5反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物修飾率的影響
[0013] 在前述確定的蛋白濃度、蛋白PEG摩爾比、溫度條件下，制備7份反應(yīng)液，分別反應(yīng) 化、地、化、她、lOh、12h、1地，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0014] 6反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物修飾率的影響
[0015] 在前述確定的蛋白濃度與蛋白PEG摩爾比的條件下，制備4份修飾反應(yīng)液，分別在 4°C、1(TC、2(TC、3(TC條件下反應(yīng)化，取樣分析融合蛋白修飾率。
[0016] 7抑對(duì)融合蛋白修飾率的影響
[0017] 在前述確定的最優(yōu)條件下，制備10份反應(yīng)液，分別調(diào)節(jié)抑為5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5,取樣分析融合蛋白修飾率。
[0018] 8聚己二醇修飾的人干擾素與人抗菌膚融合蛋白
[0019] 8. 1相對(duì)分子質(zhì)量與修飾率的測(cè)定
[0020] 通過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)獲得凝膠圖譜，用系統(tǒng)軟件進(jìn)行掃描分析。根據(jù)蛋白 Marker估計(jì)PEG及其修飾產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量，并按下式計(jì)算蛋白修飾率：
[0021]
[0022] 8. 2修飾產(chǎn)物的體外活性檢測(cè)
[0023] 修飾產(chǎn)物的干擾素活性按《中國(guó)藥典》Η部（2010版）附錄中干擾素將從測(cè)定方 法檢測(cè)其體外活性，并對(duì)照原料蛋白活性，計(jì)算活性保留率。
[0024] 修飾產(chǎn)物的抗菌活性用大腸桿菌ATCC25922作為檢測(cè)菌種，用雙層瓊脂糖打孔法 測(cè)定。底層培養(yǎng)基上打直徑3mm的圓孔，每孔加10μL發(fā)酵液，37°C賠化化后，在底層上覆 蓋一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37°C繼續(xù)培養(yǎng)20h，測(cè)量無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈直徑。并對(duì)照原料蛋白活性，計(jì) 算活性保留率。
[0025] 8. 3修飾產(chǎn)物半衰期的測(cè)定
[0026] 從皮下給SD大鼠單劑量注射人IFN-α2a或經(jīng)PEG修飾的人IFN-α2a與人化-37 融合蛋白，注射劑量分別為2. 5μg/kg和5μg/kg。選取不同的時(shí)間點(diǎn)抽取SD大鼠的血液 樣品，肝素抗凝，離必后用人IFNαELISA試劑盒測(cè)定血漿中融合蛋白的量。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖 1 陽(yáng)G日。。。、陽(yáng)Gi。。。。與陽(yáng)Gw。。。的SDS-PAGE圖譜
[0028] 圖2PEG分子量對(duì)化-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響
[002引注；圖中Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）；0為未修飾的融合蛋白；1為PEGs。。。 修飾的融合蛋白；2為PEGi。。。。修飾的融合蛋白；3為PEG2。。。。修飾的融合蛋白。
[0030]圖3融合蛋白濃度對(duì)產(chǎn)物修飾率的影響[003。圖4蛋白與PEG摩爾比對(duì)融合蛋白修飾率的影響
[0032] 圖5反應(yīng)時(shí)間對(duì)融合蛋白修飾率的影響
[0033] 圖6反應(yīng)溫度對(duì)融合蛋白修飾率的影響
[0034] 圖7抑對(duì)融合蛋白修飾率的影響
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于此。
[0036] 1PEG的表觀分子量
[0037]Η種分子量的陽(yáng)G的SDS-PAGE結(jié)果見圖1。
[00測(cè)與蛋白Marker相比，陽(yáng)Gs。。。的分子量約為14000,陽(yáng)Gi。。。。的分子量約為29000，PEG2。。。。的分量約為40000，送與其實(shí)際的分子量均偏大。PEG日?qǐng)A與PEGw。。。約偏大3倍， PEGw。。。約偏大2倍。偏大的原因與SDS-PA(iE測(cè)量分子大小是依據(jù)鏈長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。在 相同鏈長(zhǎng)條件下，組成鏈長(zhǎng)單元的平均氨基酸分子量要比己二醇大，故在W蛋白為標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 照的體系中，PEG的表觀分子量就顯得偏大。
[0039] 2PEG分子量對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0040]PEG分子量對(duì)化-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響見圖2。
[0041] 從圖中可W看出，對(duì)比未修飾的融合蛋白條帶，Η種分子量PEG修飾的融合蛋白 均未完全修飾，其中PEGg。。。修飾后殘留的未修飾所占比重最小，約為12%。在PEGg。。。所修 飾的條帶中，依次出現(xiàn)了Η條帶，對(duì)應(yīng)分子量分別為約39000、53000和67000,送與PEGs。。。 單分子修飾、雙分子修飾和Η