Ndm-1 dna探針修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了NDM-1 DNA探針修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用，NDM-1 DNA探針修飾的電極是在金電極表面固定NDM-1 DNA探針，再封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得，并且電極的制備方法簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高；以該電極為工作電極、鉑電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、pH 7.4含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的磷酸鹽緩沖液(PBS)為實(shí)驗(yàn)電解液組建電化學(xué)生物傳感器，可以快速、特異、靈敏地檢測(cè)NDM-1基因，為臨床藥物和食品中潛在耐藥細(xì)菌的檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異、高通量的工具，具有較好的市場(chǎng)價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】NDM-I DNA探針修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及NDM-I DNA探針修飾的電極，還涉及該電極的制備 方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] NDM-I多重耐藥菌是指攜帶NDM-I耐藥基因的細(xì)菌，屬于革蘭陰性耐藥菌。NDM-I 的全稱(chēng)是"新德里金屬-目-內(nèi)醜胺酶"，是1種高效耐藥酶。研究顯示，目前多重耐藥菌正 在全球快速傳播，其感染病例在全球均有分布，帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大，并且已經(jīng)在人類(lèi)重要 的致病菌志賀氏菌中發(fā)現(xiàn)了 NDM-1，預(yù)示了全球NDM-I多重耐藥菌防控形勢(shì)極為嚴(yán)峻。該病 菌可通過(guò)飲水等途徑傳染，表現(xiàn)癥狀為腸道感染，攜帶NDM-I耐藥基因的細(xì)菌幾乎對(duì)目前 臨床上使用的大多數(shù)抗生素都具有抗藥性，其感染后死亡率很高?？股貫E用是NDM-I耐 藥基因出現(xiàn)的首要原因，并且NDM-I基因可W在細(xì)菌之間傳播，從而使對(duì)抗生素敏感的細(xì) 菌獲得耐藥性。因此，研發(fā)NDM-I直接快速特異的檢測(cè)方法，對(duì)NDM-I在臨床早診早治具有 非常重要的意義。
[0003] 目前，NDM-I多重耐藥菌的診斷主要包括表型篩查、表型確認(rèn)和基因確證等3個(gè)步 驟。表型篩查是在細(xì)菌藥物敏感性測(cè)定中，W美洛培南或亞胺培南紙片法化-B法）或最低 抑菌濃度one)測(cè)定法對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步篩查；表型確認(rèn)是采用雙紙片協(xié) 同實(shí)驗(yàn)或亞胺培南（美洛培南）/邸TA復(fù)合紙片，進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)來(lái)判定產(chǎn)金屬酶；基 因確證是采用NDM-I的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定菌株是否攜帶NDM-I 基因。但該些診斷方法存在著費(fèi)時(shí)煩瑣、敏感性和特異性較低及檢測(cè)成本高等缺陷。
[0004] 在眾多的檢測(cè)技術(shù)中，傳感器技術(shù)是最具發(fā)展前景的檢測(cè)手段之一。生物傳感器 主要是由生物膜與物理化學(xué)的換能器有機(jī)結(jié)合的一口交叉型學(xué)科，是一種先進(jìn)的生物技術(shù) 檢測(cè)方法，也是分子水平的微量、快速的分析方法，目前已經(jīng)在生物工程和醫(yī)療等多個(gè)領(lǐng)域 得到迅速的發(fā)展。電化學(xué)DNA生物傳感器是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型生物傳感器，主要是 利用單鏈DM作為敏感元件通過(guò)共價(jià)鍵合或化學(xué)吸附固定在固體電極表面，通過(guò)測(cè)定識(shí)別 雜交信息的電活性物質(zhì)從而達(dá)到檢測(cè)祀序列的目的。相對(duì)于其他類(lèi)型傳感器而言，電化學(xué) DNA生物傳感器具有分析時(shí)間短、設(shè)備微型化、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低、操作簡(jiǎn)捷、成 本低廉及無(wú)特殊場(chǎng)地要求等優(yōu)點(diǎn)，目前電化學(xué)傳感器已有應(yīng)用于一些病原菌的檢測(cè)，但尚 未見(jiàn)用電化學(xué)DNA生物傳感器檢測(cè)病原菌耐藥基因的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供NDM-I DNA探針修飾的電極；本發(fā)明的目 的之二在于提供NDM-I DNA探針修飾的電極的制備方法；本發(fā)明的目的之H在于提供檢 測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器；本發(fā)明的目的之四在于上述電極或電化學(xué)生物傳感器的應(yīng) 用；本發(fā)明的目的之五在于提供利用檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-I基因的方 法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] UNDM-I DNA探針修飾的電極，所述電極是在金電極表面固定NDM-I DNA探針，再 封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得。
[000引優(yōu)選的，所述NDM-I DNA探針的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 2、所述NDM-I DNA探針修飾電極的制備方法，包括如下步驟：
[0010] a.將金電極打磨，拋光，清潔，干燥，得清潔的金電極，備用；
[0011] b.向步驟a所得清潔的金電極表面滴加含NDM-I DNA探針的溶液，固定后用琉基 己醇溶液封閉，清洗得NDM-I DNA探針修飾的電極。
[0012] 優(yōu)選的，步驟a是將金電極分別用0. 3 U m、0. 05 U m的Al2〇3粉末打磨拋光，每次打 磨后用水洗凈，再分別于硝酸、丙麗和水中各超聲洗涂，干燥，備用。
[0013] 優(yōu)選的，步驟b是向步驟a所得清潔的金電極表面滴加NDM-I DNA探針濃度為 0. 5?2. 5 y M的溶液，固定后用濃度為Immol/L的琉基己醇溶液封閉，清洗得NDM-I DNA探 針修飾的電極。
[0014] 優(yōu)選的，溶液中NDM-I DNA探針濃度為1. 5 y M。
[0015] 優(yōu)選的，所述固定的條件為37C下恒溫1小時(shí)。
[001引 3、檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器，包括工作電極、對(duì)電極、參比電極和實(shí)驗(yàn)電解 液；所述工作電極為所述NDM-I DNA探針修飾的電極，所述對(duì)電極為笛電極，所述參比電極 為飽和甘隸電極，所述實(shí)驗(yàn)電解液為抑7. 4的含2mmol/L Ks化(CN)e-K4Fe(CN)e和5mmol/L KCl的磯酸鹽緩沖液（PBS)。
[0017] 4、所述NDM-I DNA探針修飾的電極或所述檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè) NDM-I基因中的應(yīng)用。
[0018] 5、利用所述檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-I基因的方法，包括如 下步驟：將NDM-I DNA探針修飾的電極與樣品溶液雜交反應(yīng)，然后W NDM-I DNA探針修 飾的電極為工作電極，笛電極為對(duì)電極，飽和甘隸電極為參比電極，pH 7.4的含2mmol/ LKjFe (CN) e-K/e (CN) e和5mmol/L KCl的PBS為實(shí)驗(yàn)電解液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用循 環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0. 3V?0. 7V，電位掃描速率為50mv/s，根據(jù)雜交 前后峰電流變化檢測(cè)NDM-I基因濃度。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于；本研究利用探針的高特異性，針對(duì)NDM-I基因組序列，設(shè) 計(jì)NDM-I基因的特異性探針，將NDM-I基因的特異性探針修飾金電極后獲得NDM-I DNA探 針修飾的電極，然后與電化學(xué)技術(shù)相融合獲得檢測(cè)NDM-I基因的電化學(xué)生物傳感器，從而 構(gòu)建檢測(cè)NDM-I基因的平臺(tái)，為多重耐藥菌的檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異的工具。同時(shí) 本發(fā)明通過(guò)將電化學(xué)領(lǐng)域的檢測(cè)手段引入到生物醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，并探索了 NDM-I電化學(xué)生物 傳感器在液相中的響應(yīng)機(jī)理，為檢測(cè)NDM-I基因的電化學(xué)生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的 應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖： [002U 圖1為不同修飾電極的循環(huán)伏安圖。a;裸電極在抑7.4含2mmol/L K3[Fe(CN)J/ KJFe (CN) e]和5mmol/l KCl的PBS中的循環(huán)伏安曲線；b ;電極表面修飾探針在抑7. 4含 2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)J 和 5mmol/l KCl 的 PBS 中的循環(huán)伏安曲線；C ;琉基己醇 封閉電極在抑7. 4含2mmol/L Ks田e (CN)日]/? [Fe (CN)日]和5mmol/l KCl的PBS中的循環(huán) 伏安曲線；d ;檢測(cè)液是大腸桿菌/金黃色葡萄桿菌溶液在抑7. 4含2mmol/L Ks [Fe (CN) J/ KJFe (CN) e]和5mmol/l KCl的PBS中的循環(huán)伏安曲線；e ;檢測(cè)液中加入NDM-I祀序列后， 電極在抑7. 4 含 2mmol/L Ks [Fe (CN) e]/? [Fe (CN) e]和 5mmol/l KCl 的 PBS 中的循環(huán)伏安曲 線；f:裸電極在抑7.4 不含 2mmol/L Ks田e (CN)6]/?田e (CN)S]和 SmmoVl KCl 的 PBS 中的 循環(huán)伏安曲線。
[0022] 圖2為不同濃度探針修飾電極的循環(huán)伏安圖。
[0023] 圖3為不同檢測(cè)物質(zhì)對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響。
[0024] 圖4為電化學(xué)生物傳感器定量檢測(cè)NDM-I線性回歸（C =NDM-I祀序列濃度（y g/ L)，LgC =NDM-I祀序列濃度的對(duì)數(shù)）。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0026] 本發(fā)明在長(zhǎng)期壓電傳感器和漏聲表面波傳感器研究的基礎(chǔ)上，將電化學(xué)分析方法 與生物檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，自主創(chuàng)建了能夠快速、特異、靈敏地檢測(cè)NDM-I基因的電化學(xué)生物 傳感器。
[0027] 實(shí)施例1、NDM-I DNA探針合成及修飾電極
[0028] 本發(fā)明針對(duì)NDM-I全基因組，設(shè)計(jì)NDM-I DNA探針，探針的具體序列為： 5' -gcttttggtggctgcctgat-3' (SEQ ID NO. 1)〇
[0029] NDM-I DNA探針修飾的電極，具體步驟如下：
[0030] a.金電極的清洗：取直徑為3mm的金電極，分別用0. 3 y m、0. 05 y m的AI2O3粉末 打磨拋光成鏡面，每次打磨后均用超純水沖洗，再分別于硝酸、丙麗及超純水中各超聲洗涂 Smin，干燥，得清洗的金電極，備用。
[0031] b.NDM-1 DNA探針的固定；取20yL NDM-I DNA探針濃度為1.5ymol/L的溶 液滴加于已清洗的金電極表面，然后于37C下恒溫箱中恒溫1小時(shí)，再將電極浸入濃度 為Immol/L的琉基己醇溶液中封閉非特異性吸附位點(diǎn)1小時(shí)，封閉后用水清洗電極，即得 NDM-I DNA探針修飾的電極，4°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 實(shí)施例2、組建檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器
[003引 WNDM-I DNA探針修飾的電極作為工作電極，飽和甘隸電極為參比電極，笛電極作 為對(duì)電極組建檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器。將制備好的電化學(xué)傳感器聯(lián)入電化學(xué)工作 站，W pH 7. 4 的含 2mmol/L KsFe(CN)B-KJe(CN)B 和 5mmol/L KCl 的 PBS 為實(shí)驗(yàn)電解液，然 后在室溫下利用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，工作電位為-0. 3V?0. 7V，掃描速度為50mV/s。 NDM-I的電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)原理為：利用NDM-I DNA探針修飾的電極表面發(fā)生核酸 雜交反應(yīng)后，生成的雜交復(fù)合物阻礙了電極表面的電子傳遞，使傳感器響應(yīng)電流變化值增 大。該信號(hào)變化的大小A I與電極表面核酸雜交反應(yīng)的程度成正相關(guān)，A I值越大，表明電 極表面修飾的NDM-I DNA探針與待測(cè)物結(jié)合的量越多。制備好的NDM-I DNA探針修飾的電 極測(cè)定的初始還原峰電流記為I。；核酸雜交反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定的還原峰電流并記為I ;則峰 電流在核酸雜交反應(yīng)前后變化A I = I - I。。W下W此原理為依據(jù)對(duì)NDM-I進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0034] 實(shí)施例3、檢測(cè)NDM-I固定不同修飾金電極的電化學(xué)特性
[0035] 利用循環(huán)伏安法表征電極在修飾及檢測(cè)過(guò)程中的電化學(xué)特性，具體檢測(cè)方法為： 將不同修飾的電極按實(shí)施例2的方法組建電化學(xué)生物傳感器后，分別將電極浸泡在150 U L NDM-I祀序列終濃度為100 y g/L的溶液（pH7. 40. Imol/Lro巧中，在38°C恒溫箱中雜交45 分鐘后取出，利用循環(huán)伏安法表征電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)固定不同修飾物金電極的電化學(xué) 特性。雜交過(guò)程中傳感器采用H電極體系測(cè)量傳感器電流，獲得的循環(huán)伏安曲線（CV)如圖 1所示。其中，曲線a為裸金電極在抑7. 4含有2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)e]和5mmol/ I KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，由于PBS溶液中加入了氧化還原探針K3[Fe (CN)e]/ KJFe (CN) 6]，因此出現(xiàn)了一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；曲線b為NDM-I DNA探針修飾電極在 口^.4含2111111〇1/11(3的(0腳6]/1(4的(0腳6]和5111111〇1/11((：1的？85溶液中的循環(huán)伏安曲線， 由于NDM-I DNA探針是非導(dǎo)電性物質(zhì)，在一定程度上阻礙了電子傳遞，所W氧化還原峰的峰 電流有所降低；曲線C為琉基己醇封閉后的循環(huán)伏安曲線，可見(jiàn)琉基己醇在封閉非特異性 吸附位點(diǎn)的同時(shí)也阻礙了電子傳遞，因此峰電流值進(jìn)一步減?。磺€d為NDM-I DNA探針修 飾電極與含有干擾物質(zhì)（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）的溶液反應(yīng)后的循環(huán)伏安曲線，與曲 線C相比，電極在賠育前后響應(yīng)電流基本保持不變；曲線e為NDM-I DNA探針修飾電極在含 有IOOy g/LNDM-1的溶液中賠育后的循環(huán)伏安曲線，由于電極表面的核酸雜交復(fù)合物是沒(méi) 有電活性的生物大分子，進(jìn)一步阻礙了電極表面的電子傳輸，因此氧化還原峰的峰電流較 曲線d明顯降低。曲線f為NDM-I DNA探針修飾電極在抑7.4不含2mmol/LK3[Fe(CN)e]/ KJFe(CN)J和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，由于體系中缺少氧化還原活性 物質(zhì)，在-0.3V?0.7V掃描范圍內(nèi)，NDM-I DNA探針修飾電極在PBS溶液中未出現(xiàn)氧化還 原峰。W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NDM-I DNA探針修飾電極能夠檢測(cè)NDM-I祀序列，W其為工作電 極組建的NDM-I電化學(xué)生物傳感器可檢測(cè)NDM-I祀序列。
[0036] 實(shí)施例4、NDM-I DNA探針最佳濃度的優(yōu)化
[0037] 為了確定NDM-I DNA探針的最佳濃度，本實(shí)施例對(duì)NDM-I DNA探針的濃度進(jìn)行了 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。首先將NDM-I DNA探針溶液配制成濃度分別為0. 5 y M、1. 0 y M、1. 5 y M、2. 0 y M、 2. 5 y M的溶液，然后分另Ij將它們修飾于金電極表面，巧Ij備成不同濃度NDM-I DNA探針修飾 的電極，并測(cè)定其循環(huán)伏安響應(yīng)電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，修飾NDM-I DNA探針前后 NDM-I DNA探針修飾的電極的循環(huán)伏安曲線有明顯的差別，說(shuō)明探針已成功固定于電極上。 從圖2還可W看出，NDM-I DNA探針修飾電極的電流響應(yīng)變化值隨NDM-I DNA探針濃度的 增大呈先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NDM-I DNA探針濃度由0. 5 y M依次增至1. 5 y M時(shí)，響應(yīng)電 流變化值呈上升的趨勢(shì)；而當(dāng)NDM-I DNA探針濃度從1. 5 y M遞增至2. 5 y M時(shí)，響應(yīng)電流變 化值則呈遞減趨勢(shì)；其中，當(dāng)NDM-I DNA探針濃度為1. 5 y M時(shí)，傳感器的響應(yīng)電流變化值最 大。因此，NDM-I DNA探針的最佳濃度為1. 5 y M。
[003引實(shí)施例5、NDM-I電化學(xué)生物傳感器的特異性和靈敏度試驗(yàn) [00測(cè) （1)特異性試驗(yàn)
[0040] 將NDM-I DNA探針修飾電極分別與W下溶液共賠育30分鐘；溶液①含有100 y g/ L NDM-I祀序列；溶液②含有IOOy g/L NDM-I祀序列及干擾物質(zhì)（大腸桿菌、金黃色葡萄球 菌濃度分別為Img/L);③只含有干擾物質(zhì)（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌濃度分別為Img/L); 溶液④PBS溶液。賠育完成后，將NDM-I DNA探針修飾電極與笛電極、飽和參比電極按實(shí)施 例2的方法構(gòu)建成電化學(xué)生物傳感器，W抑7. 4含有2mmol/L Ks [Fe KN) e]/?的KN) e]和 5mmol/l KCl的PBS為實(shí)驗(yàn)電解液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍 為-0. 3V?0. 7V，電位掃描速率為50mv/s。分別記錄響應(yīng)電流值，并將所得峰電流值進(jìn)行 比較，評(píng)價(jià)電化學(xué)生物傳感器的特異性，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，在溶液①及溶液②中 賠育的電極在賠育前后響應(yīng)電流變化值（A I)分別為7. 9 y A和7. 3 y A，而在僅含有干擾物 質(zhì)的溶液③和空白溶液④中賠育的電極在賠育前后響應(yīng)電流基本保持不變。W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，本發(fā)明構(gòu)建的NDM-I電化學(xué)生物傳感器抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)NDM-I具有良好的選擇性， 并能對(duì)NDM-I進(jìn)行精確檢測(cè)。
[0041] (2)靈敏度（Sensitivity)實(shí)驗(yàn)
[004引利用檢測(cè)NDM-I祀序列后的NDM-I DNA探針修飾電極再進(jìn)行檢測(cè)NDM-I祀序列 終濃度分別為 10-5 U g/L，10-4 y g/L，10-3 y g/L，10-2 y g/L，10-1 y g/L，1. 0 y g/L，101 y g/L， l02yg/L溶液，操作步驟相同與上述相同，然后檢測(cè)反應(yīng)前后響應(yīng)電流的變化，檢測(cè)進(jìn)行雜 交反應(yīng)所引起的電流響應(yīng)差值A(chǔ) I及反應(yīng)所需時(shí)間，并對(duì)響應(yīng)電流變化差值A(chǔ) I與NDM-I 濃度做線性回歸，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，在雜交反應(yīng)初始階 段，由于大分子核酸雜交復(fù)合物部分阻塞了電極表面的電子傳輸通道，與空白對(duì)照相比，其 氧化還原峰電流值明顯降低。隨著NDM-I濃度從ICT 5U g/L增加到IO2U g/L，雜交反應(yīng)引起 的相位變化值呈先上升后趨于飽和的曲線方式，且W IO2U g/L NDM-I濃度為飽和點(diǎn)。從圖 4還可W看出，NDM-I濃度在ICT5U g/L?IO2U g/L的范圍內(nèi)時(shí)，其濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流 呈良好的線性關(guān)系。其中線性回歸方程為；y = 1. 1452X巧.8954,相關(guān)系數(shù)為0.9934。產(chǎn) 生上述結(jié)果原因是在NDM-I濃度逐漸升高的過(guò)程中，電極表面固定的特異性探針也逐漸結(jié) 合上更多的NDM-1，從而引起更大的響應(yīng)電流變化值，當(dāng)NDM-I濃度升高至IO 2U g/L時(shí)，電 極表面固定的特異性探針與NDM-I的結(jié)合已全部飽和，因此當(dāng)繼續(xù)增加NDM-I濃度時(shí)，已經(jīng) 無(wú)法引起更大的響應(yīng)電流變化值。同樣，當(dāng)NDM-I濃度低于g/L時(shí)，由于電極表面固 定的特異性探針無(wú)法結(jié)合到足夠數(shù)量的NDM-I而無(wú)法進(jìn)行精確檢測(cè)。上述結(jié)果表明我們自 主構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限。
[0043] 最后說(shuō)明的是，W上優(yōu)選實(shí)施例僅用W說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. NDM-1DNA探針修飾的電極，其特征在于，所述電極是在金電極表面固定NDM-1DNA探 針，再封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述NDM-1DNA探針修飾的電極，其特征在于：所述NDM-1DNA探針 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述NDM-1DNA探針修飾電極的制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： a. 將金電極打磨，拋光，清潔，干燥，得清潔的金電極，備用； b. 向步驟a所得清潔的金電極表面滴加含NDM-1DNA探針的溶液，固定后用巰基己醇溶 液封閉，清洗得NDM-1DNA探針修飾的電極。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a是將金電極分別用0. 3 μ m、 0. 05 μ m的A1203粉末打磨拋光，每次打磨后用水洗凈，再分別于硝酸、丙酮和水中各超聲洗 漆，干燥，備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟b是向步驟a所得清潔的金電 極表面滴加 NDM-1DNA探針濃度為0. 5?2. 5 μ Μ的溶液，固定后用濃度為lmmol/L的巰基 己醇溶液封閉，清洗得NDM-1DNA探針修飾的電極。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：溶液中NDM-1DNA探針濃度為 1. 5 μ M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述固定的條件為37°C下恒溫1小 時(shí)。
8. 檢測(cè)NDM-1DNA的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于：包括工作電極、對(duì)電極、參比電 極和實(shí)驗(yàn)電解液；所述工作電極為權(quán)利要求1或2所述NDM-1DNA探針修飾的電極，所述 對(duì)電極為鉬電極，所述參比電極為飽和甘汞電極，所述實(shí)驗(yàn)電解液為pH 7.4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6 和 5mmol/L KC1 的磷酸鹽緩沖液。
9. 權(quán)利要求1?2任一項(xiàng)所述NDM-1DNA探針修飾的電極或權(quán)利要求8所述檢測(cè)NDM-1 的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)NDM-1基因中的應(yīng)用。
10. 利用權(quán)利要求8所述檢測(cè)NDM-1的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-1基因的方法，其 特征在于，包括如下步驟：將NDM-1DNA探針修飾的電極與樣品溶液雜交后，然后NDM-1DNA 探針修飾的電極為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，pH 7. 4的含 2mmol/L 1(和_)6-1(如_)6和5_〇1/1 KC1的磷酸鹽緩沖液為實(shí)驗(yàn)電解液構(gòu)建電化學(xué)生 物傳感器，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-〇. 3V?0. 7V，電位掃描速率為 50mv/s，根據(jù)雜交前后峰電流變化檢測(cè)NDM-1基因濃度。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK104237354SQ201410557704
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】張立群, 王云霞, 府偉靈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院