本發(fā)明涉及高分子藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應性聚合物藥物載體及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

兩親性嵌段聚合物可在水溶液中自組裝成膠束，并已被廣泛應用于包封疏水性抗癌藥物。與小分子抗癌藥相比，聚合物載藥膠束能夠改善藥物的藥代動力學和提高藥物在腫瘤部位的富集從而顯著提高藥物的生物利用度，減少毒副作用。具有生物相容性的可降解聚合物膠束在藥物運載方面取得了巨大的成功，有些已被批準進入臨床應用或者正在進行臨床試驗。例如，相比于溶劑型紫杉醇(ptx)，genexol-pm(聚乙二醇-b-聚d，l-丙交酯)(peg-pdlla)聚合物負載的ptx制劑顯示出了更好的療效和較低的毒性，在韓國已被批準用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和非小細胞肺癌。此外，還有其他的兩親性嵌段聚合物膠束正在臨床試驗中，如nk105，nk911，nk012，sp1049c，bind014。

然而，另一方面，聚合物膠束的血液長循環(huán)和較高的腫瘤富集(例如peg-覆蓋的表面)也阻礙了腫瘤細胞的內(nèi)吞作用。這對于大多數(shù)需要被細胞內(nèi)吞才能起作用的抗癌藥物來講是個不利的方面。為了解決這個問題，各種響應性的智能聚合物藥物遞送系統(tǒng)被設(shè)計來進一步提高療效，但目前為止進入臨床階段的聚合物藥物遞送系統(tǒng)仍然十分稀少。聚合物本身復雜的結(jié)構(gòu)和未知的系統(tǒng)毒性限制了其進一步的臨床化。因此，提供一種毒性小，易得且療效好的聚合物藥物是目前需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)響應性聚合物藥物載體及其制備方法和應用，本發(fā)明提供的聚合物藥物載體不僅易得，而且擔載藥物后得到的聚合物藥物療效高且毒性小。

本發(fā)明提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應性高分子藥物載體，具有式(i)所示結(jié)構(gòu)，

其中，m為40～230，n為30～120；

所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg。

優(yōu)選的，所述m為80～150。

優(yōu)選的，所述n為50～100。

本發(fā)明還提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應性高分子藥物載體的制備方法，包括：

1)將peg-n3與alkynyl-pep反應，得到末端為氨基的peg-pep，

所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg；

2)將末端為氨基的peg-pep與d，l-丙交酯反應，得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體；

其中，m為40～230，n為30～120。

優(yōu)選的，所述步驟1)反應的催化劑為溴化亞銅和n，n，n′，n，′n″-五甲基二亞乙基三胺(pmdeta)。

優(yōu)選的，所述步驟2)反應的催化劑為辛酸亞錫、乙酸亞錫、二氧化鈦和氯化鋁中的一種或幾種。

本發(fā)明還提供了一種高分子藥物，包括高分子藥物載體和抗腫瘤藥物；

其中，所述高分子藥物載體為本發(fā)明所述的高分子藥物載體。

優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物為紫杉醇、喜樹堿、順鉑、氮芥和阿霉素中的一種或幾種。

本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的高分子藥物的制備方法，包括：

將本發(fā)明所述的高分子藥物載體、抗腫瘤藥物、溶劑和緩沖溶液反應，得到高分子藥物。

優(yōu)選的，所述緩沖溶液為ph為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體，本發(fā)明提供的聚合物藥物載體用于擔載藥物，得到的高分子藥物能夠增加腫瘤藥物對于藥物的內(nèi)吞，提高藥效，而且生物安全性較高；實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的高分子藥物與現(xiàn)有的該分子藥物相比，療效提高了16倍；且藥物安全。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的聚合物載體的合成路線圖；

圖2為實施例制備得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc圖；

圖3為peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的¹hnmr圖；

圖4為以芘作為熒光探針，高分子藥物濃度與其在激發(fā)光光譜中波長在339nm和332nm處的強度的比值(i339/i332)的相關(guān)圖；

圖5為本發(fā)明提供的聚合物藥物的粒子尺寸表征結(jié)果；

圖6為用1μg/ml的mmp-2和p1共同培養(yǎng)不同時間的凝膠滲透色譜(gpc)結(jié)果；

圖7為p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子與mmp-2分別共同培養(yǎng)后的peg釋放結(jié)果；

圖8為在mmp-2的存在下p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子的大小的變化圖；

圖9為mmp-2處理之前和之后的p1納米粒子的透射電子顯微鏡(tem)圖像；

圖10為mmp-2不存在下的ptx釋放曲線；

圖11為mmp-2存在下的ptx釋放曲線；

圖12為4t1細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果；

圖13為本發(fā)明所述的高分子藥物的激光共聚焦顯微鏡(clsm)圖像；

圖14為空白膠束的細胞毒性評價結(jié)果；

圖15為在不同ptx濃度的不同高分子藥物的細胞毒性的評價；

圖16為靜脈注射ptx負載的p1，p2或p3后，在血液中與ptx含量在不同時間下的變化；

圖17為12和24小時靜脈注射后ptx在主要器官和腫瘤內(nèi)的定量分析結(jié)果；

圖18為負載1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindotricarbocyanineiodide(dir)熒光分子的納米粒子靜脈注射后在體內(nèi)生物分布圖；

圖19為靜脈注射ptx負載的納米粒子和小分子ptx后腫瘤大小的變化結(jié)果；

圖20為在第24天從不同處理組收集的典型腫瘤的照片；

圖21為腫瘤切片的蘇木精-伊紅(h&e)染色的結(jié)果和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶染色(tunel)熒光圖像；

圖22為小鼠體重變化；

圖23為心臟，肝，脾，肺，腎h&e染色，分別對應于pbs，ptx，p1，p2和p3的靜脈注射。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種高分子藥物載體，具有式(i)所示結(jié)構(gòu)，

其中，m為40～230，n為30～120；

所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸)或gplgvrg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸-甘氨酸)。

按照本發(fā)明，所述pep的氨基酸序列為gplgvrg或gplgvrgdg；所述m優(yōu)選為80～150，更優(yōu)選為100～140，最優(yōu)選為110～130，最優(yōu)選為113～120；所述n優(yōu)選為50～110，更優(yōu)選為60～100。

本發(fā)明還提供了一種高分子藥物載體的制備方法，包括：

1)將端基疊氮化化的聚乙二醇與炔基功能化的多肽反應，得到末端為氨基的peg-pep；

所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg；

2)將末端為氨基的peg-pep與d，l-丙交酯反應，得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體；

其中，m為40～230，n為30～120。

按照本發(fā)明，本發(fā)明還將端基疊氮化化的聚乙二醇(peg-n3)與炔基功能化的多肽(alkynyl-pep，其中炔基連接在初始的甘氨酸上)反應，得到末端為氨基的peg-pep，；本發(fā)明對反應的條件沒有特殊要求，本領(lǐng)域公知的方法均可；其中，所述反應的催化劑優(yōu)選為溴化亞銅和n，n，n′，n，′n″-五甲基二亞乙基三胺(pmdeta)；所述反應的溶劑優(yōu)選為dmf；所述反應的溫度優(yōu)選為30～60℃；更優(yōu)選為40～50℃；此外，本發(fā)明中，pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg。

本發(fā)明還將末端為氨基的peg-pep與d，l-丙交酯反應，得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體；其中，所述反應的催化劑優(yōu)選為辛酸亞錫；所述反應的溶劑優(yōu)選為四氫呋喃；所述反應的溫度優(yōu)選為60～100℃，更優(yōu)選為80～90℃。

本發(fā)明還提供了一種高分子藥物，包括高分子藥物載體和抗腫瘤藥物；

其中，所述高分子藥物載體為本發(fā)明所述的高分子藥物載體；所述抗腫瘤藥物優(yōu)選為紫杉醇、喜樹堿、疏水性鉑類藥物、氮芥和阿霉素中的一種或幾種；更優(yōu)選為紫杉醇。

本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的高分子藥物的制備方法，包括：

將本發(fā)明所述的高分子藥物載體、抗腫瘤藥物、溶劑和緩沖溶液反應，得到高分子藥物。其中，所述緩沖溶液為ph為7.4的磷酸鹽緩沖溶液；所述溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯；所述反應優(yōu)選為超聲反應；所述超聲的功率優(yōu)選為90～120w；所述超聲的時間優(yōu)選為60～100秒。

本發(fā)明提供了一種具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體，本發(fā)明提供的聚合物藥物載體用于擔載藥物，得到的高分子藥物能夠在mmp高表達的腫瘤組織中增加腫瘤藥物對于藥物的內(nèi)吞，提高藥效，而且生物安全性較高，具有很好的應用前景。

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例中式(i)化合物用縮寫peg-pep-pdlla表示。

實施例

一、高分子藥物的制備及表征

1)聚合物載體的制備方法

peg-gplgvrgdg-nh2的制備

將peg-n3(0.3g，0.06mmol)，alkynyl-pep(0.062g，0.072mmol)，dmf(3ml)和pmdeta(31mg，0.18mmol)一起至于5ml的封管中，冷凍-循環(huán)抽氣三次后在氮氣的保護下加入溴化亞銅(26mg，0.18mmol)，再次冷凍-循環(huán)抽氣兩次，在真空下封住，置于40℃下反應24小時。反應完成后將反應物加入50ml乙醚中沉淀，得到的產(chǎn)物干燥后溶解在去離子水中，加入到分子量為3500的透析膜內(nèi)，在流動的去離子水中透析24小時。凍干后得到白色粉末狀產(chǎn)物，即為peg-gplgvrgdg-nh2；產(chǎn)量為0.22g，產(chǎn)率為62.7％。

將peg-gplgvrgdg-nh2引發(fā)劑溶解在約0.5ml的ch2cl2中，然后加入過量的苯。凍干后得到無水白色粉末。然后，凍干的peg-gplgvrgdg-nh2(0.117g，0.02mmol)，d，l-丙交酯(0.288g，2mmol)，辛酸亞錫(30μl，10mg/ml苯溶液)溶于1ml無水四氫呋喃和4ml無水苯中，加入10ml封管中，凍干后加入4ml無水四氫呋喃，封住封管，在80℃下反應18小時。然后將得到的聚合物沉淀到50ml冷乙醚中。產(chǎn)品通過離心收集。重復上述溶解-沉淀循環(huán)兩次。將最終產(chǎn)物干燥，得到白色固體粉末，即為聚合物載體peg-gplgvrgdg-pdlla，產(chǎn)量為0.26g，產(chǎn)率為64％。

同樣，用類似的合成方法合成peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla聚合物載體。

聚合物載體的具體制備方法見圖1，圖1為本發(fā)明所述的聚合物載體的合成路線圖。

對得到的聚合物載體進行檢測，結(jié)果見圖2～圖3，圖2為實施例制備得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc圖；圖3為peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的¹hnmr圖。

2)高分子藥物(載藥膠束)的制備

將peg-gplgvrgdg-pdlla(10mg)和紫杉醇(1mg)溶解在乙酸乙酯(0.2ml)中，然后加入磷酸鹽緩沖溶液(ph7.4)1ml，在90w的功率下超聲乳化60秒，減壓出去有機溶劑，在離心除去未包埋的紫杉醇后得到載藥的納米粒子，即高分子藥物(又稱p1納米粒子或p1)。

同樣，用類似的合成方法在peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla上擔載紫杉醇，分別得到高分子藥物p2和p3。此外，尼羅紅和dir包埋的納米粒子(高分子藥物)的制備是通過將上述ptx換成相應的分子實現(xiàn)的。

通過以芘作為熒光探針，溶液中芘的濃度為1×10^-7m，熒光測試的發(fā)射波長為475nm，測試高分子藥物在339nm和332nm激發(fā)光強度的比值對聚合物濃度作圖，結(jié)果見圖4，圖4為以芘作為熒光探針，高分子藥物濃度與其在激發(fā)光光譜中波長在339nm和332nm處的強度的比值(i339/i332)的相關(guān)圖；從同種可以看出，本發(fā)明所述的高分子藥物的臨界膠束濃度分別為2.1×10^-3mg/ml(p1).2.5×10^-3mg/ml(p2)和3.3×10^-3mg/ml(p3)。

通過動態(tài)光散射表征聚合物藥物，結(jié)果見圖5，圖5為本發(fā)明提供的聚合物藥物的粒子尺寸表征結(jié)果；從圖中可以看出，本發(fā)明得到的納米粒子的平均粒徑均為80nm左右，該尺寸便于納米粒子在腫瘤組織部位富集。而且測得p1，p2和p3納米粒子的載藥率和包封率都是差不多的。這說明在嵌段聚合物中間引入多肽的序列后對于聚合物藥物的相關(guān)性質(zhì)沒有產(chǎn)生大的影響。

3)聚合物藥物對于mmp-2的響應性評估。

本發(fā)明所用的多肽(gplgvrgdg)已經(jīng)證實會被活化的mmp-2在g和v之間的位點被切斷。將p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子分別和mmp-2共培養(yǎng)不同時間后，進行了gpc表征，結(jié)果見圖6～圖7，圖6為用1μg/ml的mmp-2和p1共同培養(yǎng)不同時間的凝膠滲透色譜(gpc)結(jié)果；圖7為p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子與mmp-2分別共同培養(yǎng)后的peg釋放結(jié)果；從圖6可以看出，培養(yǎng)1個小時后gpc曲線顯示一個新的肩峰，位于16.08分鐘，這對應于peg峰。這一結(jié)果證明了mmp-2導致peg的從納米粒子的去除。隨著mmp-2處理時間的增加，肩峰變得越來越強，且從圖7可以看出超過70％peg在8個小時內(nèi)脫離，最后，大約20％peg仍然在納米粒子表面上。

在mmp-2培養(yǎng)的同時，我們也采用動態(tài)光散射(dls)來研究納米粒子的尺寸變化，結(jié)果見圖8～圖9，圖8為在mmp-2的存在下p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子的大小的變化圖；圖9為mmp-2處理之前和之后的p1納米粒子的透射電子顯微鏡(tem)圖像；從圖8中可以看出，納米粒子尺寸在24小時內(nèi)沒有顯著的變化；tem測量進一步證實，如圖9所示，除了極少數(shù)相對大的顆粒外，去peg化后的納米粒子依然保持著較為均一的尺寸。這種現(xiàn)象可能是因為mmp-2培養(yǎng)24小時仍然有20％peg留在納米粒子的表面上足以穩(wěn)定納米粒子。對照組p2也顯示出peg的脫離，而p3沒有對mmp-2的響應性(圖7)。上述結(jié)果表明，mmp-2能夠有效地切斷肽鍵，但不會導致顯著的聚集?？梢酝茰y，殘留的肽vrgdg是保留在納米粒子的表面的，這對于腫瘤細胞的內(nèi)吞具有極大的優(yōu)勢。

此外，為了評估m(xù)mp-2的存在對于藥物釋放的影響，我們研究了在mmp-2存在和不存在下ptx的釋放行為。如圖10和圖11，圖10為mmp-2不存在下的ptx釋放曲線；圖11為mmp-2存在下的ptx釋放曲線；從圖中可以看出，負載ptx的p1，p2，和p3無論有沒有mmp-2的存在都表現(xiàn)出類似的釋放行為，在72小時內(nèi)約80％的ptx釋放。

4)微弱的尺寸變化和有效mmp-2導致的peg脫離有可能促進細胞攝取。此外，殘留的肽vrgdg殘留在納米粒子表面上能夠作為一種靶向配體，進一步促進納米粒子和腫瘤細胞之間的相互作用。為了研究在mmp-2存下納米粒子的細胞攝取行為，等量的負載尼羅紅的納米粒子和4t1細胞在mmp-2存在下共培養(yǎng)。然后進行流式細胞術(shù)測量以研究納米粒子的內(nèi)吞。結(jié)果見圖12～圖13，圖12為4t1細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果；圖13為本發(fā)明所述的高分子藥物的激光共聚焦顯微鏡(clsm)圖像；從圖12中可以看出，p1的納米粒子相比p3的納米粒子表現(xiàn)出幾乎高三倍的細胞攝取，而p2的納米粒子僅表現(xiàn)出1.2倍攝取增加，在mmp-2作用下，p2的納米粒子雖然顯示出去聚乙二醇化而p1的納米粒子不僅表現(xiàn)出去聚乙二醇化，而且rgd殘基被留下納米粒子的表面上。因此，p1的納米粒子顯示的最高的細胞攝取。此外，從圖13可以看出，相比于p2和p3納米粒子，p1納米粒子顯著更強尼羅紅的熒光強度表現(xiàn)出更有效的細胞內(nèi)化，因此，mmp-2導致的peg去除和p1納米粒子表面上殘余的vrgdg肽協(xié)同促進了細胞攝取。

5)有效的細胞攝取對抗癌藥物療效提高具有關(guān)鍵作用。通過mtt法，測定了不同的藥物治療后4t1細胞的細胞活性。具體方法如下：

將4t1細胞以在1×10⁴/孔的密度種在96孔板中，含有fbs(10％)dmem培養(yǎng)基100μl，在37℃下，co2氣氛中(5％)培養(yǎng)24個小時。然后，用100μl新鮮培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基，空白或負載ptx的納米粒子以不同的濃度加入，并加入酶活化劑apma活化的mmp-2，培養(yǎng)24個小時后將培養(yǎng)基完全吸出，加入100μl新鮮培養(yǎng)基，再通過另外48小時的培養(yǎng)。細胞活性通過3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide(mtt)測定。20μlmtt溶液(5mg/mlpbs溶液)加入到每個孔中并培養(yǎng)在37℃下在黑暗放置4小時。再吸取培養(yǎng)基加入dmso(200μl)放置30分鐘使得所形成的紫色甲臜晶體溶解。用酶標儀測量在490nm處的吸光度。半數(shù)最大抑制濃度(ic50)值根據(jù)mtt結(jié)果的通過graphpadprism軟件計算。

結(jié)果見圖14～圖15，圖14為空白膠束的細胞毒性評價結(jié)果；圖15為在不同ptx濃度的不同高分子藥物的細胞毒性的評價，其中，*p＜0.05。從圖14可以看出，在mmp-2的存在下，空白的納米粒子即使在相當高的濃度下也幾乎沒有顯示出毒性，表明這些嵌段共聚物良好的生物相容性。從圖15可以看出，相比負載ptx的p2和p3的納米粒子以及小分子ptx，負載ptx的p1納米粒子表現(xiàn)出顯著增強的細胞毒性。負載ptx的p1半抑制濃度(ic50)值是85ng/ml，小分子ptx為(147ng/ml)，負載ptx的p2納米粒子(560ng/ml)，或p3納米粒子(1080ng/ml)。

二、藥代動力學的評價

高分子藥物的藥代動力學在雌性6周齡的cd-1(icr)小鼠體內(nèi)進行評價。具體的：

雌性6周齡cd-1(icr)小鼠隨機分成三組(n＝3)。ptx負載的p1，p2，或p3納米粒子通過尾靜脈注射，ptx劑量為10mg/kg。在不同的時間間隔，從小鼠眶收集100μl血液樣品裝入肝素化的試管中并加入10ml乙酸乙酯。隨后在10000×g下離心5分鐘，分離有機溶劑并在n2下干燥。通過反相高效液相色譜(rp-hplc)測定紫杉醇的含量，(流動相為：乙腈/h2o(3∶7v/v)，流速1ml/min，uv-vis檢測波長固定在217nm)。

結(jié)果如圖16所示，圖16為靜脈注射ptx負載的p1，p2或p3后，在血液中與ptx含量在不同時間下的變化；從圖16可以看出，靜脈注射后，負載ptx的p1，p2和p3的納米粒子顯示了類似的相對較長的血液循環(huán)時間。p1，p2和p3的半衰期t1/2分別為3.36h，4.82h和3.92h。長血液循環(huán)能夠提高腫瘤位置抗癌藥物的富集。

三、h22小鼠腫瘤模型的構(gòu)建

考慮到mmp酶在各種腫瘤的發(fā)展過程中的重要性，我們選擇雌性cd-1(icr)小鼠的h22腫瘤模型進行抗腫瘤效果的研究。為了定量ptx量在腫瘤部位和主要器官的分布，靜脈注射不同的藥物制劑后，腫瘤組織和主要器官內(nèi)ptx被萃取出來，用hplc系統(tǒng)進行分析。具體的，懸浮于200μlpbs中的h22細胞(3×10⁶)通過皮下注射到雌性6周齡cd-1(icr)小鼠的右下肢腋窩。使用數(shù)字游標卡尺監(jiān)測腫瘤的大小，而且腫瘤體積(v)從方程v＝a×b²/2計算，其中a和b分別表示腫瘤的最長和最短直徑。

此外，h22荷瘤小鼠用于研究的納米粒子的體內(nèi)分布。當腫瘤體積達到100mm³時，dir負載的p1，p2或p3納米粒子通過靜脈注射，劑量為1mg/kg。在不同的時間間隔(1，12，24，48和72小時)，將小鼠麻醉并用ivis小動物成像系統(tǒng)來獲取圖像。

結(jié)果見圖17和圖18，圖17為12和24小時靜脈注射后ptx在主要器官和腫瘤內(nèi)的定量分析結(jié)果；圖18為負載dir熒光分子的納米粒子靜脈注射后在體內(nèi)生物分布圖；從圖17可以看出，在24個小時腫瘤部位p1納米粒子的藥物富集顯著得到加強，比p2的納米粒子增加1.47倍，p3納米粒子2.01倍(*p＜0.05)，而藥物在主要器官的分布顯示沒有顯著的差別。為了能夠看到體內(nèi)納米粒子的情況，疏水性的近紅外熒光發(fā)射染料(dir)被包埋到的納米粒子內(nèi)進行從而實現(xiàn)實時監(jiān)控。如圖18所示，從圖18可以看出，三個dir負載的納米粒子的靜脈注射1個小時后，腫瘤位置表現(xiàn)出明顯的dir的熒光，24個小時達到最大值。而且，對于dir負載的p1納米粒子在48小時顯示出稍強的熒光。

四、體內(nèi)的分布

同時使用h22荷瘤小鼠對負載ptx的納米粒子的療效進行了評價。將25只小鼠分為5組，包括pbs，小分子ptx，ptx負載的p1，p2，和p3納米粒子。當腫瘤生長至約100mm³時，將不同的藥物制劑每兩天靜脈注射一次，劑量為10mg/kg，總共三次注射。

為了量化ptx在主要器官和腫瘤的積累，靜脈注射10mg/kg劑量的ptx后，收集相應的器官和腫瘤組織。然后將樣品用pbs洗滌，之后干燥稱重，加入0.5毫升ch3cn，并在10000×g離心10分鐘，然后，將上清液進一步用1mlchcl3萃取。將有機相在氮氣流下干燥，并將殘余物溶解于100μl甲醇中，通過rp-hplc確定ptx的量。

結(jié)果見圖19～圖20，圖19為靜脈注射ptx負載的納米粒子和小分子ptx后腫瘤大小的變化結(jié)果；數(shù)據(jù)表示為平均值±sd，n＝5，*p＜0.05。圖20為在第24天從不同處理組收集的典型腫瘤的照片。從圖19和圖20可以看出，24天后用pbs處理的腫瘤顯示出近40倍體積增加，小分子ptx為25倍，p3的納米粒子為16倍，p2的納米粒子為10倍。對比鮮明的是，負載ptx的p1納米粒子有效地抑制了腫瘤生長，腫瘤大小只是增加了1.9倍。

五、動物體內(nèi)抗腫瘤效果的評價

h22荷瘤小鼠隨機分為5組(n＝5)。當腫瘤體積達到100mm³時，小分子ptx，負載ptx的p1，p2和p3納米粒子通過尾靜脈注射，ptx劑量為10mg/kg。每兩天注射一次，共三次注射。腫瘤大小通過使用數(shù)字游標卡尺測量監(jiān)測。同時，每兩天記錄一次小鼠的體重。在治療(24天)結(jié)束后，所有的小鼠處死，并收集主要臟器(心臟，肝，脾，肺，腎)和腫瘤。記錄腫瘤的重量，然后將腫瘤和器官包埋在石蠟中，并制備5μm的石蠟切片。將切片用蘇木精和伊紅(h&e)進行染色。此外，腫瘤切片進一步用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dutp缺口末端標記(tunel)測定試劑盒染色以鑒定凋亡細胞。

腫瘤切片用h&e和tunel進行染色評價凋亡細胞。

結(jié)果見圖21～圖23，圖21為腫瘤切片的蘇木精-伊紅(h&e)染色的結(jié)果和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶染色(tunel)熒光圖像；圖22為的小鼠體重變化；圖23為心臟，肝，脾，肺，腎h&e染色，分別對應于pbs，ptx，p1，p2和p3的靜脈注射；其中，白色箭頭指示肝臟損傷。從圖中可以看出，與ptx負載的p1納米粒子治療的腫瘤表現(xiàn)出最強的綠色熒光，這表明最多的細胞凋亡。h&e染色也證實了最顯著的療效是通過注射負載ptx的p1納米粒子實現(xiàn)的。此外，五組小鼠的體重在治療期間沒有顯著改變；而且，從圖13可以看出，器官的h&e染色的結(jié)果主要表現(xiàn)出小分子ptx導致的肝損傷，而負載ptx的納米粒子治療組無明顯器官損傷；這些結(jié)果顯示p1，p2和p3納米粒子的生物安全性較高。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。