本發(fā)明屬于化學(xué)改性的縮聚物領(lǐng)域，具體涉及一種具有ph響應(yīng)的去鐵胺接枝聚乙二醇，還涉及其作為鐵離子螯合劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵離子過載與許多臨床疾病有關(guān)，比如地中海貧血，中風(fēng)，阿茨海默、帕金森病等神經(jīng)退變性疾病。

去鐵胺是臨床上通用的一種鐵離子螯合劑，對鐵離子過載相關(guān)的疾病具有治療作用。但是其具有明顯的缺陷：1、血液中的去鐵胺會被體內(nèi)的酶快速降解，其體內(nèi)半衰期不足30分鐘，導(dǎo)致藥效不佳，需要加大用藥劑量或者延長用藥時間；2、具有毒性，會引起許多不良反應(yīng)，如，低血壓和心動過速(參見俞天驥，去鐵胺——老藥新毒性，國外醫(yī)學(xué)：藥學(xué)分冊，1991.p249,)，特別是在高劑量的時候，其不良反應(yīng)特別明顯。為了兼顧藥效和安全，目前通常的治療方式低劑量長時間的靜脈注射，以維持體內(nèi)濃度以達(dá)到一定效果，但是該種治療方法十分不便，患者依從性差。

因此，急需對去鐵銨進(jìn)行改進(jìn)，提高其半衰期，降低其毒性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本專利針對去鐵胺在治療鐵過載相關(guān)疾病中存在的半衰期短和藥物載體修飾可能產(chǎn)生的積累毒性等問題，本發(fā)明提供了一種具有ph響應(yīng)的長循環(huán)鐵離子螯合劑。

一種化合物，它是由聚乙二醇與去鐵胺通過ph敏感的化學(xué)鍵鏈接后組成。

上述化合物具有下述式(ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)：

其中，rn表示聚乙二醇鏈，dfo表示去鐵胺基，結(jié)構(gòu)如下：

上述化合物中，所述的聚乙二醇為聚乙二醇單甲醚，分子質(zhì)量為1kda～20kda。

上述化合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)聚乙二醇單甲醚與對醛基苯甲酸在催化劑作用下通過酯化反應(yīng)得到中間產(chǎn)物；

(2)將上述中間產(chǎn)物與去鐵胺通過西佛堿反應(yīng)制備得到具有ph響應(yīng)的長循環(huán)鐵離子螯合劑。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)的酯化反應(yīng)溫度為-5～5℃。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)的酯化反應(yīng)時間為40～72h。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)的酯化反應(yīng)時間為48h。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，對醛基苯甲酸與聚乙二醇單甲醚的質(zhì)量比為0.08～0.4:1；4-二甲氨基吡啶(dmap)與聚乙二醇單甲醚的質(zhì)量比為0.05～0.3:1；n,n'-二環(huán)己基碳酰(dcc)與聚乙二醇單甲醚的質(zhì)量比為0.25～1.3:1。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)的溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二甲亞砜、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)的溶劑為二氯甲烷。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)的溶劑選自甲醇、二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)的溶劑為甲醇。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中三乙胺與中間產(chǎn)物的體積質(zhì)量比為1～5.2ml：1g。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中所述去鐵胺為甲磺酸去鐵胺。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中甲磺酸去鐵胺與中間產(chǎn)物的質(zhì)量比為1.2～6：1。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間為12h。

上述化合物作為鐵離子螯合劑的應(yīng)用。

與去鐵銨相比，本發(fā)明鐵離子螯合劑的半衰期顯著延長、毒性大大降低，而且其螯合鐵離子的能力沒有變化，因此，將其注入體內(nèi)，藥效會明顯提高，同時毒性大大減小，安全性明顯提升，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。本發(fā)明公開的鐵離子螯合劑與去鐵胺相比還具有長效和病灶部位酸性微環(huán)境響應(yīng)的特點。

附圖說明

圖1為鐵離子螯合劑的合成示意圖。

圖2為實施例1產(chǎn)品的核磁譜圖。

圖3為實施例1和2的鐵離子螯合能力圖

圖4為去鐵胺和螯合劑的半衰期。

圖5為實施例3中得到的產(chǎn)品在ph＝6.0條件下酸性響應(yīng)后產(chǎn)物的核磁譜圖。

圖6為實施例2和3得到的產(chǎn)品與去鐵胺的細(xì)胞毒性mtt實驗結(jié)果。

具體實施方式

所用原料和試劑均來自于市售的商品。

聚乙二醇單甲醚、去鐵胺、n,n'-二環(huán)己基碳酰亞胺(dcc)、4-二甲氨基吡啶(dmap)均購于sigma，對醛基苯甲酸購于成都科龍試劑公司。

本發(fā)明鐵離子螯合劑的合成步驟如圖1所示。

實施例1

1克聚乙二醇單甲醚(分子量1kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.4g對醛基苯甲酸，0.3gdmap和1.3gdcc，在5℃下反應(yīng)36小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到中間產(chǎn)物mpeg1k-ph-cho。

稱取0.5g中間產(chǎn)物mpeg1k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入3g甲磺酸去鐵胺和2.6毫升三乙胺，在60℃下反應(yīng)12小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到最終產(chǎn)物mpeg1k-ph-dfo。

核磁氫譜：40mg樣品溶于1mld2o中，25℃檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。

特征峰歸屬為：8.2和8.07ppm為苯環(huán)中的h；8.1ppm為ch＝n鍵中的h；3.6和3.3ppm分別對應(yīng)聚乙二醇單甲醚中甲氧基和亞甲基中的氫；3.5ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-5,h-12和h-19；3.1ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-1,h-8和h-15；2.8ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-6和h-13，2.4ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-14和h-7；2.0ppm對應(yīng)–ch3；1.5ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-2,h-4，h-11和h-18；1.4ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-9和h-16；1.2ppm對應(yīng)去鐵胺分子中的h-3,h-10和h-17。

以上核磁氫譜結(jié)果證明了合成產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

實施例2

1克聚乙二醇單甲醚(分子量2kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.2g對醛基苯甲酸，0.15gdmap和0.63gdcc，在-5℃下反應(yīng)72小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到中間產(chǎn)物mpeg2k-ph-cho。

稱取0.5g中間產(chǎn)物mpeg2k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入1.5g甲磺酸去鐵胺和1.3毫升三乙胺，在60℃下反應(yīng)12小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到最終產(chǎn)物mpeg2k-ph-dfo。

實施例3

1克聚乙二醇單甲醚(分子量5kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g對醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反應(yīng)40小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到中間產(chǎn)物mpeg5k-ph-cho。

稱取0.5g中間產(chǎn)物mpeg5k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去鐵胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反應(yīng)12小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到最終產(chǎn)物mpeg5k-ph-dfo。

實施例4

1克聚乙二醇單甲醚(分子量10kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g對醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反應(yīng)48小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到中間產(chǎn)物mpeg10k-ph-cho。

稱取0.5g中間產(chǎn)物mpeg10k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去鐵胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反應(yīng)12小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到最終產(chǎn)物mpeg10k-ph-dfo。

實施例5

1克聚乙二醇單甲醚(分子量20kda)溶于10毫升二氯甲烷溶液中，加入0.08g對醛基苯甲酸，0.06gdmap和0.25gdcc，在冰浴下反應(yīng)72小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到中間產(chǎn)物mpeg20k-ph-cho。

稱取0.5g中間產(chǎn)物mpeg20k-ph-cho溶于20毫升甲醇中，加入0.6g甲磺酸去鐵胺和0.5毫升三乙胺，在60℃下反應(yīng)12小時后，經(jīng)硅膠柱提純，得到最終產(chǎn)物mpeg20k-ph-dfo。

下面通過試驗說明本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明作為鐵離子螯合劑的應(yīng)用

(1)鐵離子螯合能力檢測

鐵離子螯合能力采用紫外吸收光譜法檢測(tian,etal.,carbohydratepolymers,2016,144,522-530)。如圖3所示，去鐵胺螯合鐵離子的特征吸收峰在429nm。實施例1和例2的產(chǎn)品螯合鐵離子后的吸收峰也在429nm，并根據(jù)去鐵胺濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算實施例1和例2產(chǎn)品中的去鐵胺含量，結(jié)果表明與其分子結(jié)構(gòu)式中的理論含量是一致的。上述結(jié)果表明，實施例1和實施例2制備的螯合劑與相同摩爾濃度的去鐵胺螯合鐵離子的能力相同，去鐵胺接枝上聚乙二醇并不影響其對鐵離子的螯合能力。

(2)半衰期檢測

半衰期采用代謝實驗檢測(meyer-brunot&keberle，biochem.pharmaco.l,1967,16,527-535)。步驟為：樣品采用實施例1-5中得到的產(chǎn)品，分別為mpeg1k-ph-dfo，mpeg2k-ph-dfo，mpeg5k-ph-dfo，mpeg10k-ph-dfo和mpeg20k-ph-dfo。樣品和去鐵胺對照(dfo)分別溶于10毫升krb緩沖液后加入2毫升新鮮血漿，然后在37℃，95％氧氣和5％二氧化碳?xì)夥罩姓鹗?，每隔一定時間吸出1毫升反應(yīng)液，經(jīng)處理后采用紫外-可見光譜在429nm檢測吸光度。對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出孵化不同時候后孵化液中的有效去鐵胺濃度。然后將時間和對應(yīng)濃度作圖，曲線經(jīng)擬合后計算半衰期。

根據(jù)圖4所示，去鐵胺的半衰期為0.8小時，而螯合劑的半衰期分別為16.3，18.4,28.2,36.9和42.9小時。本發(fā)明制備的螯合劑大幅度延長了去鐵胺的半衰期。

(3)螯合劑的ph響應(yīng)性

樣品為實施例3中得到的產(chǎn)品，40mg樣品溶于1mlpbs溶液中，調(diào)節(jié)溶液ph至6.0搖床震蕩24h后冷凍干燥，產(chǎn)品溶于1mldmso-d6中，25℃檢測核磁氫譜，如圖5。

特征峰歸屬為：10.1ppm處出現(xiàn)了對醛基苯甲酸中的cho中的h的吸收峰，表明在酸性條件下產(chǎn)物分子中的ch＝n鍵發(fā)生了斷裂，生成了-cho。該結(jié)果表明產(chǎn)物具有ph響應(yīng)性。

(4)細(xì)胞毒性

采用mtt法檢測細(xì)胞毒性。樣品采用實施例2和3中得到的產(chǎn)品，分別為mpeg2k-ph-dfo和mpeg5k-ph-dfo。各樣品分別溶于磷酸緩沖液pbs中配制成含10mm等效dfo濃度的溶液，用于細(xì)胞試驗時，再用培養(yǎng)基稀釋成含0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.005mm等效dfo濃度的溶液。對照組采用等體積的pbs加入培養(yǎng)基。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞按3×10³的密度種于96孔板，24小時后吸棄培養(yǎng)基，加入上述含不同濃度的螯合劑培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后采用mtt法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性(tian,etal.,carbohydratepolymers,2010,79,137-144)。

細(xì)胞活率mtt測試結(jié)果依次如圖6所示。

去鐵胺具有劑量依賴性的細(xì)胞毒性，從圖中看出當(dāng)dfo的濃度高于0.05mm時培養(yǎng)48小時后細(xì)胞活率低于60％。相對比，產(chǎn)品2和3的各實驗組的等效dfo濃度在0.5mm下均表現(xiàn)出大于80％的細(xì)胞活率。

以上結(jié)果表明：螯合劑的細(xì)胞毒性明顯小于對照組去鐵胺的細(xì)胞毒性，

本發(fā)明公開的具有ph響應(yīng)的鐵離子螯合劑，具有長效低毒的作用。具體的，本發(fā)明通過去鐵胺與乙二醇鏈接，克服了去鐵胺在體內(nèi)半衰期短的問題，同時，等效去鐵胺濃度的鐵離子螯合劑細(xì)胞毒性比去鐵胺的細(xì)胞毒性小，降低了去鐵胺的毒副作用，明顯優(yōu)于單獨的去鐵胺。本發(fā)明公開的鐵離子螯合劑與去鐵胺相比還具有長效和病灶部位酸性微環(huán)境響應(yīng)的特點。