聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域，涉及聚乙二醇修飾的蛋白類藥物，特別是聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]尿激酶(Urokinase，簡寫為UK)是由人腎合成人尿釋放的一種血纖溶酶原激活劑(Plasminogen Activator),也稱雙鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(tcu-PA)，是尿激酶原(pro-UK,也稱單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑，scu-PA)在纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶等作用下，Lys15s-1le159間的肽鍵斷裂后形成的有激活纖溶酶原功能的酶。由于Lys 158-1le159間的肽鍵斷裂后形成的A鏈和B鏈仍通過二硫鍵CyS148-CyS279連接，分子量與Pro-UK相同，故稱為高分子量尿激酶(High-Molecular-Weight Urokinase, HMff-UK),分子量約為54000道爾頓。纖溶酶繼續(xù)水解HWK-UK，在Lys135-Lys136斷裂失去EGF-1ike區(qū)和Kringle區(qū)，成為低分子量尿激酶(Low-Molecular-Weight Urokinase, LMW-UK)，分子量約為33000道爾頓。尿激酶是臨床上重要的溶栓藥物，廣泛用于心腦血管和外周血管等處血栓性疾病的治療，但由于低分子量尿激酶缺乏纖維蛋白特異性，容易引起系統(tǒng)性出血等副反應(yīng)，臨床使用受到限制，因此，藥典要求尿激酶原料藥中HMW-UK比例需大于90%，在尿激酶純化過程中需要去除低分子量尿激酶。
[0003]高分子量尿激酶與低分子量尿激酶的溶栓作用機制有所不同，它們本身并不直接用于血塊本身，而是首先激活體內(nèi)的纖溶酶原，成為有活性的纖溶酶，纖溶酶降解纖維蛋白凝塊，亦能降解血循環(huán)中的纖維蛋白原、凝血因子V和凝血因子VID等，使其分解成可溶性多肽，高分子量的尿激酶能特異結(jié)合病變的組織，但低分子量尿激酶沒有特異性識別功能。在用于提取純化尿激酶的粗品中，LMff-UK的比例高達30%，目前在醫(yī)藥研發(fā)中沒有得到充分利用，本專利將著重開發(fā)其溶解纖維蛋白原的功能，開發(fā)有效治療高纖維蛋白原血癥的藥物。
[0004]纖維蛋白原(Fibrinogen, Fg)又稱凝血因子I，是由人肝細胞合成并分泌的一種糖基化蛋白，是促進血小板聚集的最主要的血液蛋白質(zhì)，80%存在于血漿中，正常血漿含量為2?4 g/Lo目前研究大都將空腹血漿纖維蛋白原水平>4.0g/L者稱為高纖維蛋白原血癥(Hyperfibrinogenemia)。在各種病理狀態(tài)下，血楽纖維蛋白原的異常升高會增加血液黏度、促進血小板聚集、參與調(diào)控與炎癥細胞、內(nèi)皮細胞以及其他蛋白質(zhì)的結(jié)合，通過改變血液流變學(xué)、損傷血管內(nèi)皮、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及參與血栓形成等多種途徑參與機體多種疾病的病理過程。大量研究表明，血漿纖維蛋白原水平升高是動脈粥樣硬化(AS)、血栓栓塞并發(fā)癥和糖尿病血管并發(fā)癥的重要危險因素，在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展上也起重要作用，嚴格控制這些危險因素是預(yù)防和延緩血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的重要措施。
[0005]目前，對于高纖維蛋白原血癥患者，臨床治療方案主要有:①應(yīng)用抗血栓藥物如阿司匹林或氯吡格雷來治療高纖維蛋白原血癥；②采用降纖酶等纖維蛋白溶解劑、tPA等降纖制劑來降低纖維蛋白原水平采用低分子肝素治療，但只能短期用于高危病人；④對于嚴重的高纖維蛋白原血癥，常采用體外血漿脂類過濾器治療，JX-DELP體外脂類過濾器降脂治療，有效的降低甘油三脂、脂肪肝、高粘血、高脂血等，安全可控。但是，以上的這些治療方法都存在一定的缺陷和局限性，研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林或氯吡格雷等藥物在治療糖尿病并發(fā)的高纖維蛋白血癥的過程中，患者易出現(xiàn)過敏、梗死和出血等副反應(yīng)；而在一些興奮性毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡模型和卒中模型中，tPA會促進神經(jīng)元死亡，還會增加腦出血的風(fēng)險；降纖酶類藥物由于來源問題，免疫原性較高，副作用較大。因此，開發(fā)長效、高效且免疫原性低的降纖藥物，對延緩高纖維蛋白原血癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，降低這些疾病的發(fā)病和死亡風(fēng)險有著重要意義。
[0006]尿激酶，尤其是低分子量尿激酶，能夠有效、快速的激活纖溶酶原，降解血漿中高水平的纖維蛋白原，是治療高纖維蛋白原血癥、動脈粥樣硬化(AS)、血栓栓塞并發(fā)癥和糖尿病血管并發(fā)癥的潛在治療藥物。它能有效激活纖溶酶原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘睦w溶酶，進而作用于血栓中的纖維蛋白原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白及多肽而溶栓。也能直接作用于纖維蛋白原α鏈，釋放α鏈物質(zhì)，使血凝塊分解為多肽，多肽物質(zhì)在血液中被清除。而且，尿激酶是從人尿中提取，免疫原性低，但低分子量尿激酶藥物存在半衰期短、穩(wěn)定性不高等缺點，研究者都在積極探索提高這些藥物藥效的有效途徑，其中聚乙二醇修飾被認為的一種行之有效的方法。
[0007]聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，迄今聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)和其他化合物至少有四十余種。FDA已批準的PEG修飾產(chǎn)品有:聚乙二醇化腺苷脫氨酶、聚乙二醇化天冬酰胺酶、聚乙二醇化干擾素、聚乙二醇化粒細胞集落刺激因子等。
[0008]聚乙二醇(PEG)是中性、無毒、無免疫原性、有良好生物相容性的高分子聚合物，具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學(xué)體積，當耦連到藥物分子表面時，可改變其生物分配行為和溶解性，產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中被快速消除。因此，將蛋白多肽類藥物進行PEG修飾，可以提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，以改善體內(nèi)半衰期。
[0009]蛋白質(zhì)多肽的PEG化通常以其分子中的氨基、羧基和巰基等官能團為活性位點選擇相應(yīng)類型的PEG進行修飾。氨基修飾是最為常用的PEG修飾方法，早期PEG修飾主要針對賴氨酸的α或ε氨基，這類修飾劑反應(yīng)所需要條件較為溫和，對藥物穩(wěn)定性影響相對較小。但其反應(yīng)選擇性低、交聯(lián)度不均一、副產(chǎn)物多、鍵結(jié)合不穩(wěn)定且PEG自身雜質(zhì)干擾較為嚴重，使蛋白的分離純化和鑒定很困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因而逐漸被新一代PEG所替代。新一代PEG修飾位點更加明確，典型代表是mPEG-丙醛，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，醛基和伯胺通過Schiff堿，形成一個穩(wěn)定的伯胺，在pH值相對較低時，N末端的α氨基與醛基有很高的選擇性。相對于隨機修飾，定點修飾能夠針對特定基團或?qū)Ｒ晃稽c進行修飾，有利于保持蛋白質(zhì)藥物的活性，產(chǎn)物易于表征，產(chǎn)品質(zhì)量更容易控制，已成為PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的研究熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具藥學(xué)上長效、高效、低免疫原性的聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶采用的技術(shù)方案是:
一種聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶，由聚乙二醇和低分子量尿激酶以共價鍵連接，低分子量尿激酶的N-末端通過共價鍵連接聚乙二醇。
[0012]聚乙二醇分子通過共價鍵連接低分子量尿激酶分子亞基構(gòu)成。
[0013]所述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。
[0014]單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺羧酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。
[0015]單甲氧基聚乙二醇分子為直鏈型或分支型。
[0016]單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇醛。
[0017]所述的聚乙二醇分子量為5kDa~60kDa。作為優(yōu)選，所述的聚乙二醇分子量為5kDa~40kDa。作為再優(yōu)選，所述的聚乙二醇分子量為20kDa~40kDa。
[0018]所述的低分子量尿激酶是天然提取的低分子量尿激酶或通過基因工程技術(shù)獲得的重組的低分子量尿激酶。作為優(yōu)選，所述的低分子量尿激酶是從健康人尿液中提取、純化獲得。
[0019]本發(fā)明還提供一種聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的制備方法，該方法步驟簡單，易于實現(xiàn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0020]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的制備方法采用技術(shù)方案是:
一種所述的聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)配制修飾反應(yīng)緩沖液，離子強度為10~500mmol/L，pH值為4~9;
(2)低分子量尿激酶與活化聚乙二醇在步驟(I)提供的條件反應(yīng)2~48小時，反應(yīng)溫度為4?60。。；
(3)經(jīng)步驟(2)反應(yīng)得到的修飾產(chǎn)物經(jīng)陽離子離子交換層析進行分離純化，洗脫收集所述的聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶洗脫峰，經(jīng)濃縮后得到所述的聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶。
[0021]步驟(3)中，(a)陽離子層析凝膠為SP-SepharoseFast F1WnCM-Sepharose FastFlowNSP-High Performance 或 Mono-S，優(yōu)選 SP-Sepharose Fast Flow ; (b)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值和電導(dǎo)，用已經(jīng)平衡好的SP柱上樣，再用平衡液沖洗；(c)繼續(xù)用沖洗液進行沖洗，收集沖洗峰；(d)最后用洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰。
[0022]步驟(b)中，SP層析柱平衡液為0.01~0.2M醋酸鹽緩沖液(pH4.0-8.0),氯化鈉濃度為0~0.2M氯化鈉。優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為OM、pH5.5。
[0023]步驟(b)中，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為4.0-8.0，電導(dǎo)l~10mS/cm。優(yōu)選條件pH5.5，電導(dǎo) 5mS/cm。
[0024]步驟(c)為沖洗步驟，使用pH4.0-8.0,0.01-0.2M醋酸鹽緩沖液，含有0.05M-0.3M氯化鈉。優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，含有0.05M氯化鈉，pH5.5進行沖洗。
[0025]步驟(d)為洗脫步驟，使用pH4.0-8.0,0.01-0.2M醋酸鹽緩沖液，含有0~1.0M氯化鈉。優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，加入0.1M氯化鈉，pH5.5進行洗脫。
[0026]步驟(b)中，收集上樣和平衡穿透，主要含有未參與修飾的游離的PEG-ALD ；
步驟(C)中，收集沖洗液，主要含有未參與修飾的低分子量尿激酶； 步驟(