抗-vegf抗體的制作方法
【專利摘要】提供了一種抗體。在某些情況下，該抗體包含：a）重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括與選定抗體的重鏈CDR區(qū)基本上相同的CDR區(qū)和b）輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括與選定抗體的輕鏈CDR區(qū)基本上相同的CDR區(qū)，其中該抗體結(jié)合選定的靶。
【專利說明】抗-VEGF抗體
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年10月8日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880128968.5、發(fā)明名稱為“抗-VEGF抗體”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]背景
[0003]抗體是結(jié)合特異性抗原的蛋白質(zhì)。通常，抗體對(duì)于其靶是特異性的，具有介導(dǎo)免疫效應(yīng)物機(jī)制的能力，并且在血清中具有長半衰期。這樣的特性使得抗體成為有力的治療劑。在治療上使用單克隆抗體，用于治療各種病癥，包括癌癥、炎癥和心血管疾病。目前在市場上存在十種以上的治療性抗體產(chǎn)品，并且有上百種在研發(fā)中。
[0004]對(duì)新的抗體存在持續(xù)的需求。
[0005]發(fā)明概述
[0006]提供了一種抗體。在某些情況下，該抗體包含:a)包括與圖1中所示的選定抗體的重鏈⑶R區(qū)基本上相同的⑶R區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和b)包括與選定抗體的輕鏈⑶R區(qū)基本上相同的CDR區(qū)的輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域，其中該抗體結(jié)合選定的靶。在某些實(shí)施方案中，抗體的CDR區(qū)相對(duì)于選定抗體的CDR區(qū)，總地可以含有，例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或至多10個(gè)氨基酸差異(例如，氨基酸置換、缺失或插入)。在某些情況下，本發(fā)明抗體的⑶R區(qū)可以具有由源自幾個(gè)相關(guān)抗體分析的共有序列限定的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗體的CDR區(qū)可以與選定抗體的CDR區(qū)相同。
[0007]在特定的實(shí)施方案中，所述抗體可以包含:可變結(jié)構(gòu)域，其包括:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.氨基酸序列與圖1選定抗體的重鏈⑶Rl區(qū)相同的⑶Rl區(qū)；i1.氨基酸序列與選定抗體的重鏈⑶R2區(qū)相同的⑶R2區(qū)；和ii1.氨基酸序列與選定抗體的重鏈⑶R3區(qū)相同的CDR3區(qū)；和b)輕鏈可變區(qū)，其包括:1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDRl區(qū)相同的⑶Rl區(qū)；i1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈⑶R2區(qū)相同的⑶R2區(qū)；和ii1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；其中抗體特異性地結(jié)合選定的靶。
[0008]在某些實(shí)施方案中，抗體包含:a)可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.氨基酸序列與圖1選定抗體的重鏈⑶Rl區(qū)相同的⑶Rl區(qū)氨基酸序列與選定抗體的重鏈⑶R2區(qū)相同的⑶R2區(qū)，和ii1.氨基酸序列與選定抗體的重鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；和b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDRl區(qū)域相同的CDRl區(qū)；i1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDR2區(qū)相同的CDR2區(qū)；和ii1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；或b)部分a)的可變結(jié)構(gòu)域的變體，該變體除了在CDR區(qū)中有一定數(shù)量(例如，
1、2、3、4、5、6、7或8個(gè))的氨基酸置換，其他與部分a)的可變區(qū)相同，其中該抗體結(jié)合選定的靶，并且在某些實(shí)施方案中，結(jié)合選定靶的活性。
[0009]在某些實(shí)施方案中，抗體可以包含選自表1的⑶R共有組的⑶R。在某些實(shí)施方案中，抗體可以包含:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.包括選自表1的CDR共有組的CDRl氨基酸序列的⑶Rl區(qū)；i1.包括選定⑶R共有序列的⑶R2氣基酸序列的⑶R2區(qū)；和ii1.包括選定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3區(qū)；和b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.包括選定⑶R共有序列的⑶Rl氨基酸序列的⑶Rl區(qū)；i1.包括選定⑶R共有序列的⑶R2氨基酸序列的⑶R2區(qū)；和ii1.包括選定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3區(qū)；其中所述抗體特異性地結(jié)合選定的靶，在某些實(shí)施方案中，結(jié)合選定靶的活性。
[0010]還提供了包括本發(fā)明抗體和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
[0011]還提供了一種方法。在某些實(shí)施方案中，該方法可以包括在適于抗體與靶結(jié)合以產(chǎn)生復(fù)合物的條件下，使本發(fā)明抗體與抗體的靶接觸。
[0012]還提供了阻斷配體結(jié)合其受體的方法。在特定的實(shí)施方案中，該方法可以包括:將本發(fā)明抗體給予受治療者，其中所述抗體結(jié)合所述患者體內(nèi)的受體或配體并且阻斷所述配體及其受體的結(jié)合。
[0013]選定的靶可以是VEGF。
[0014]附圖簡述
[0015]圖1顯示了選定的VEGF-阻斷抗體的氨基酸序列。圖1的第I頁顯示了重鏈的氨基酸序列。圖1的第2頁顯示了相應(yīng)輕鏈的氨基酸序列。每個(gè)抗體的CDR的氨基酸序列是框起來的。圖1中顯示的氨基酸序列是特異性結(jié)合VEGF并中和VEGF活性的抗體。從上至下，圖1 (第 1/2 頁)SEQ ID NO: 1-38 和圖1 (第 2/2 頁)SEQ ID NO:39-76。
[0016]定義 [0017]在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的特定實(shí)施方案，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解在此所用的術(shù)語只是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將只由所附權(quán)利要求來限制。
[0018]除非另外限定，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。盡管與在此所述那些相似或相等的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，但現(xiàn)在將描述優(yōu)選的方法和材料。在此提及的所有出版物引入文中作為參考，以公開和描述與所引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料。
[0019]必須注意到如在此和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中另外清楚地指出。因此，例如，對(duì)“抗體”的提及包括多個(gè)這樣的抗體，對(duì)“構(gòu)架區(qū)”的提及包括一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價(jià)物，諸如此類。
[0020]在此所討論的出版物僅僅是為了在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_內(nèi)容而提供的。在此沒有構(gòu)成承認(rèn)由于現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)明而本發(fā)明有權(quán)先于這些出版物。此外，所提供出版物的日期可以不同于實(shí)際出版日期，這可能需要單獨(dú)證實(shí)。
[0021 ] 術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在此可互換使用。這些術(shù)語是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的，并且指的是由一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合抗原的多肽組成的蛋白質(zhì)。一種形式的抗體組成抗體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單位。這種形式是四聚物，由兩個(gè)相同對(duì)的抗體鏈組成，每對(duì)具有一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈。在每對(duì)中，輕鏈和重鏈可變區(qū)一起負(fù)責(zé)與抗原的結(jié)合，并且恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)物功能。
[0022]所識(shí)別的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈以及a、y (IgG1UgG2UgG3UgG4Xδ、ε和μ重鏈，或其他物種中的等價(jià)物。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25kDa或約214個(gè)氨基酸)包括NH2-末端的約110個(gè)氨基酸的可變區(qū)和COOH-末端的K和λ恒定區(qū)。全長免疫球蛋白“重鏈”(約50kDa或約446個(gè)氨基酸)，相似地包括可變區(qū)(約116個(gè)氨基酸)和上述之一的重鏈可變區(qū),例如Y (約330個(gè)氨基酸)。
[0023]術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同種型的抗體或免疫球蛋白，保持特異性結(jié)合抗原的抗體片段，包括，但不限于，F(xiàn)ab、Fv、scFv和Fd片段,嵌合抗體,人源化抗體,單鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白的融合蛋白?？贵w可以是可檢測標(biāo)記的，例如，使用放射性同位素、產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶、熒光蛋白等?？梢赃M(jìn)一步將抗體綴合其他部分，如特異性結(jié)合對(duì)的成員，例如，生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結(jié)合對(duì)的成員)等。還可以將抗體結(jié)合固體支持物，支持物包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等。術(shù)語還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和或保持特異性結(jié)合抗原的其他抗體片段，以及單克隆抗體?？贵w可以是單價(jià)的或雙價(jià)的。
[0024]抗體可以以各種其他形式存在，包括，例如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab和(Fab’)2，以及雙功能(即，雙特異性)雜交抗體(例如，Lanzavecchia等,Eur.J.1mmunol.17,105 (1987))和單鏈形式(例如，Huston 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,85, 5879-5883, (1988)和 Bird 等，Science,242,423-426 (1988)，在此將其引入作為參考)。(參見，總地，Hood等，“Immunology”,Benjamin, N.Y.,第 2 版，(1984),和 Hunkapiller 和 Hood, Nature, 323,15-16 (1986)。
[0025]免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由被三個(gè)超變量區(qū)隔斷的“構(gòu)架”區(qū)(FR)組成，這三個(gè)超變量區(qū)也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”。之前已經(jīng)限定了構(gòu)架區(qū)和⑶R的范圍(參見，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，E.Kabat 等，U.S.Department ofHealth and Human Services, (1991))。在此討論了所有抗體氨基酸序列的編號(hào)遵照Kabat系統(tǒng)進(jìn)行。不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)的序列在物種內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的構(gòu)架區(qū)，是組成的輕鏈和重鏈的組合構(gòu)架區(qū)，用于定位和比對(duì)⑶R。⑶R主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。
[0026]嵌合抗體是其輕鏈和重鏈基因通常是通過遺傳工程從屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)建的抗體。例如，可以將來自非人單克隆抗體的基因的可變片段結(jié)合人的恒定片段，如Yl和Y3。治療性嵌合抗體的一個(gè)實(shí)例是由來自兔抗體的可變區(qū)或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來自人抗體的恒定區(qū)或效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域組成的雜交蛋白(例如，由A.T.C.C.保藏號(hào)CRL9688的細(xì)胞制得的抗-Tac嵌合抗體)，盡管可以使用其他哺乳動(dòng)物物種。 [0027]如在此所用的，術(shù)語“人源化抗體”或“人源化免疫球蛋白”指的是含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)由來自人抗體的相應(yīng)位置的氨基酸置換的非人(例如，小鼠或大鼠)抗體。在一些情況中，與相同抗體的非人源化形式相比，人源化抗體在人宿主中產(chǎn)生降低的免疫響應(yīng)。
[0028]將理解通過本發(fā)明方法設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的人源化抗體具有對(duì)抗原結(jié)合或其他抗體功能基本上沒有影響的氨基酸置換。
[0029]“相似的氨基酸”如下定義:gly，ala ；val, ile, leu ；asp, glu ；asn, gin ；ser, thr ；lys, arg ;和phe, tyr。換句話說，gly和ala是相似的氨基酸；val, ile和Ieu是相似的氨基酸；asp和glu是相似的氨基酸；asn和gin是相似的氨基酸；ser和thr是相似的氨基酸；lys和arg是相似的氨基酸；phe和tyr是相似的氨基酸。用相似氨基酸的氨基酸取代在此稱為“保守性氨基酸置換”。不存在上述相同組中的氨基酸是“不相似”的氨基酸。
[0030]術(shù)語“特異性結(jié)合”指的是抗體優(yōu)先結(jié)合不同分析物的均質(zhì)混合物中存在的特定分析物的能力。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合的相互作用將區(qū)分出樣品中所需的和不需要的分析物，在一些實(shí)施方案中，相互作用超過約10至100倍，或更高(例如，超過約1000或 10，000 倍)。
[0031]在某些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體及其靶在捕獲劑/分析物復(fù)合物中特異性結(jié)合時(shí)，它們之間的親和性特征在于低于10_6m的Kd (解離常數(shù))，低于10_7M，低于10_8M，低于10_9M，低于IQ-9M,低于IQ-11M,或低于約IQ-12M或更低。[0032]重鏈或輕鏈抗體鏈的“可變區(qū)”是鏈的N-末端成熟區(qū)?；谛蛄斜葘?duì)和結(jié)構(gòu)知識(shí)來指定所有結(jié)構(gòu)域、⑶R和殘基編號(hào)。按照Kabat, Chothia (Chothia, Structuraldeterminants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Bioll998 ；278:457-79)等所述的來進(jìn)行構(gòu)架區(qū)和⑶R殘基的鑒定和編碼。
[0033]VH是抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。VL是抗體輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，其可能是K (K)或入同種型。K-1抗體具有K-1同種型，而Κ-2抗體具有K-2同種型，并且V λ是可變?chǔ)溯p鏈。
[0034]如在此所用的，術(shù)語“測定”、“測量”和“測試”和“試驗(yàn)”可以互換使用，并包括定
量和定性測定。
[0035]術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”，在此可互換使用，指的是任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括編碼的和非編碼的氨基酸，化學(xué)或生化上修飾或衍生的氨基酸和具有修飾的肽主鏈的多肽。術(shù)語包括融合蛋白，包括，但不限于，具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合體，具有或不具有N-末端甲硫氨酸殘基；免疫學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)；具有可檢測融合伴侶的融合蛋白，例如，包括作 為融合伴侶的熒光蛋白、β_半乳糖苷酶、熒光素酶等；等等。多肽可以是任何大小的，并且術(shù)語“肽”指的是8-50個(gè)殘基(例如，8-20個(gè)殘基)長的多妝。
[0036]如在此所用的，術(shù)語“分離的”，在分離的抗體內(nèi)容中使用時(shí)，指的是至少60%，至少75%，至少90%，至少95%，至少98%，甚至至少99%的本發(fā)明抗體從純化之前與其相連的其他成分中游離出來。
[0037]在此所用的術(shù)語“治療”、“治療中”等指的是哺乳動(dòng)物(例如，特別是人或小鼠)中任何疾病或病癥的任何治療，并包括:a)防止疾病、病癥，或疾病或病癥的癥狀在易患病但尚未診斷出患病的患者中的發(fā)生；b)抑制疾病、病癥，或疾病或病癥的癥狀，例如，阻止其在患者中的發(fā)展和/或延遲其發(fā)作或呈現(xiàn)；和/或c)緩解疾病、病癥，或疾病或病癥的癥狀，例如，引起病癥或疾病和/或其癥狀的消退。
[0038]術(shù)語“受治療者”、“宿主”、“患者”和“個(gè)體”在此可互換使用，指的是需要診斷或治療的任何哺乳動(dòng)物患者，特別是人。其他患者可以包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。
[0039]“相應(yīng)的氨基酸”是兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列比對(duì)時(shí)，相同位置(即，它們彼此相對(duì)排列的位置)的氨基酸殘基。將抗體序列比對(duì)和編碼的方法更詳細(xì)地列于上文的Kabat中以及其他的文獻(xiàn)中。如本領(lǐng)域所知的(參見，例如，Kabat 1991, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時(shí)候，為了完成比對(duì)，可以形成一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)缺口和/或至多一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)殘基，或至多約15個(gè)殘基的插入(特別是在L3和H3CDR中)。
[0040]“天然”抗體是其中抗體的重鏈和輕鏈免疫球蛋白是通過多細(xì)胞生物體的免疫系統(tǒng)自然選擇的抗體，與通過例如噬菌體展示制得的非天然配對(duì)抗體或人源化抗體相對(duì)。因此，特定的抗體不含有任何病毒(例如，噬菌體M13)-衍生的序列。脾臟、淋巴結(jié)和骨髓是產(chǎn)生天然抗體的組織的實(shí)例。
[0041]“親本”抗體是氨基酸置換目標(biāo)的抗體。在某些實(shí)施方案中，氨基酸可以由“供體”抗體“捐贈(zèng)”給親本抗體，以產(chǎn)生改變了的抗體。[0042]“相關(guān)抗體”是具有相似序列并由具有通用B細(xì)胞祖先的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。這樣的B細(xì)胞祖先含有具有重排輕鏈VJC區(qū)和重排重鏈VDJC區(qū)的基因組，并產(chǎn)生尚未經(jīng)受親和性成熟的抗體。脾臟組織中存在的“天然”或“原始”B細(xì)胞是示例性的B細(xì)胞通用祖先。相關(guān)抗體結(jié)合抗原的相同表位，并且序列通常是非常相似的，特別是在其L3和H3CDR中。相關(guān)抗體的H3和L3CDR具有相同的長度和接近相同的序列(例如，有0-4個(gè)殘基不同)。相關(guān)抗體通過通用抗體祖先來互相關(guān)聯(lián)，通用抗體祖先是天然B細(xì)胞祖先中產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“相關(guān)抗體”不是用于描述一組不具有由B-細(xì)胞產(chǎn)生的通用抗體祖先的抗體。在某些情況下，相關(guān)抗體:1.結(jié)合相同的抗原；i1.各自包括相對(duì)彼此具有至少90%整體氨基酸序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii1.各自包括相對(duì)彼此具有至少90%整體氨基酸序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有相對(duì)彼此長度相同和序列相同(除了 0、1或2個(gè)氨基酸置換)的H3⑶R ;和V.具有相對(duì)彼此長度相同和序列相同(除了 0、1或2個(gè)氨基酸置換)的L3⑶R。
[0043]“阻斷抗體”、“中和抗體”或“中和……的抗體”或其任何語法等價(jià)物指的是其與靶的結(jié)合導(dǎo)致將與靶的結(jié)合或靶的生物活性抑制例如至少約20%、30%、40%、50%、80%、95%或99%的抗體。通過測量靶生物活性的一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)來測定這種靶生物活性的抑制，這些指標(biāo)如受到靶影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活、結(jié)合或細(xì)胞改變?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)試驗(yàn)中的一個(gè)或多個(gè)來測定在此所述的靶的生物活性。
[0044]如在此所用的術(shù)語“VEGF”或其非縮寫形式“血管內(nèi)皮生長因子”指的是由VEGF基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。VEGF涉及血管發(fā)生(胚胎循環(huán)系統(tǒng)的重新形成)和血管生成(血管從預(yù)先存在的脈管系統(tǒng)開始的生長)。VEGF家族的所有成員通過結(jié)合細(xì)胞表面上的酪氨酸激酶受體(VEGFR)來刺激細(xì)胞響應(yīng)，使它們二聚化并通過轉(zhuǎn)磷酸作用得到激活。VEGF受體具有包含7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的胞外部分、單個(gè)跨膜橫跨區(qū)和包含分裂酪氨酸-激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)部分。VEGF-A 結(jié)合 VEGFR-1 (Flt-1)和 VEGFR-2 (KDR/Flk-1)。VEGFR-2 看來似乎介導(dǎo)幾乎全部已知的對(duì)VEGF的細(xì)胞響應(yīng)。VEGF，其生物活性及其受體都得到了充分的研究并在 Matsumoto 等(VEGF receptor signal transduction (VEGF 受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))，SciSTKE.2001: RE21)和 Marti 等(Angiogenesis in ischemic disease(缺血性疾病中的血管生成)Thromb Haemost.1999增補(bǔ)1:44-52)的論文中有描述。術(shù)語VEGF用于包括重組的VEGF分子，其可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)方法來制備或商業(yè)購買(R&D Systems, Catalog N0.210-TA,Minneapolis, Minn.)，以及含有VEGF分子的融合蛋白。在此可以使用的示例性VEGF的氨基酸序列可以在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中找到，并且人VEGF的全部描述及其在各種疾病和病癥中的作用可以在Man數(shù)據(jù)庫的NCBI’ s Online Mendelian Inheritance中找到。
[0045]發(fā)明詳述
[0046]提供了一種抗體。在某些情況下，該抗體包含:a)包括與圖1中所示的選定抗體的重鏈⑶R區(qū)基本上相同的⑶R區(qū)的重量可變結(jié)構(gòu)域和b)包括與選定抗體的輕鏈⑶R區(qū)基本上相同的CDR區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中該抗體結(jié)合選定的靶。在某些實(shí)施方案中，抗體的⑶R區(qū)相對(duì)于選定抗體的⑶R區(qū)，總地可以含有，例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)至至多10個(gè)氨基酸差異(例如，氨基酸置換、缺失或插入)。在一些實(shí)施方案中，抗體的CDR區(qū)可以與選定抗體的CDR區(qū)相同。如顯而易見的，這樣的抗體進(jìn)一步含有決定CDR的位置的構(gòu)架序列。 [0047]在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體可以具有:a)具有與圖1中所示的選定抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)橹辽?0%同一性(例如，至少90%，至少95%或至少98%或99%同一性)的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和b)具有與選定抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)橹辽?0%同一性(例如,至少90%，至少95%或至少98%或99%同一性)的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0048]在特定的實(shí)施方案中，抗體可以包含:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.氨基酸序列與圖1的選定抗體的重鏈CDRl區(qū)相同的CDRl區(qū)；i1.氨基酸序列與選定抗體的重鏈CDR2區(qū)相同的⑶R2區(qū)；和ii1.氨基酸序列與選定抗體的重鏈⑶R3區(qū)相同的⑶R3區(qū)；和b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDRl區(qū)相同的CDRl區(qū)；i1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDR2區(qū)相同的CDR2區(qū)；和ii1.氨基酸序列與選定抗體的輕鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；其中該抗體特異性地結(jié)合選定的靶。
[0049]用單個(gè)抗原使兔免疫產(chǎn)生多重抗體，這些抗體可以通過它們序列的關(guān)聯(lián)性來分組。每組內(nèi)的抗體彼此相關(guān)，因?yàn)樗鼈兪怯删哂泄餐烊籅細(xì)胞祖先的細(xì)胞產(chǎn)生的。由祖先B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體尚未經(jīng)受親和性成熟，而相關(guān)抗體已經(jīng)經(jīng)受親和性成熟和B-細(xì)胞發(fā)育的最后階段，并從通用B-細(xì)胞祖先抗體的“發(fā)展”而來，因?yàn)樗鼈兒杏捎H和性成熟過程中發(fā)生的體細(xì)胞超突變、基因轉(zhuǎn)變和其他細(xì)胞突變事件引起的氨基酸置換。
[0050]可以將相關(guān)抗體的氨基酸序列進(jìn)行比較(例如，通過比對(duì)那些序列)，并且根據(jù)它們彼此的相似性將抗體歸類，以鑒定相關(guān)組的抗體。相關(guān)抗體組的抗體通常含有接近相同的序列，具有長度相同的CDR區(qū)，并在構(gòu)架和/或CDR區(qū)中具有氨基酸序列的差異。這些差異表示可以在任一相關(guān)抗體中被置換的氨基酸。在某些情況下，一個(gè)位置上的氨基酸可以是不相似的氨基酸，例如，在該情況下，在該位置的氨基酸可以由任何其他氨基酸置換。在其他情況下，一個(gè)位置上的氨基酸可以是相似的氨基酸，在該情況下，該位置上的氨基酸可以由相似的氨基酸置換，其中相似氨基酸如上所定義。在某些情況下，如果氨基酸不同，可以將來自一個(gè)相關(guān)抗 體的氨基酸替換成另一個(gè)的。
[0051]因?yàn)樽畛跬ㄟ^免疫過的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生并有效測試了特定共有組的每個(gè)CDR，用一個(gè)氨基酸替換成另一個(gè)共有氨基酸應(yīng)當(dāng)是抗體充分耐受的。將圖1的抗體進(jìn)行比對(duì)，鑒定相關(guān)的抗體組，并鑒定出共有序列。在某些情況下，抗體可以包括CDR共有組的⑶R，其中⑶R共有組源自相關(guān)抗體的序列比對(duì)。圖1抗體的共有序列顯示于表1中。表1表示本發(fā)明抗體中的可置換位置，其中例如，置換可以是任何其他氨基酸、相似氨基酸(即，保守性氨基酸置換)或來自一個(gè)抗體的置換另一個(gè)的。這樣的方法在美國專利申請(qǐng)10/984, 473 (作為US-2006-0099204公開)中有進(jìn)一步的描述，為了那些方法的公開內(nèi)容，將其引入作為參考。
[0052]在某些實(shí)施方案中，所述抗體可以包含選自表1的⑶R共有組的⑶R。在特定的實(shí)施方案中，所述抗體可以包含:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.包括選自表1的CDR共有組的⑶Rl氣基酸序列的⑶Rl區(qū)；i1.包括選定⑶R共有序列的⑶R2氣基酸序列的⑶R2區(qū)；和ii1.包括選定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3區(qū)；和b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括:1.包括選定⑶R共有序列的⑶Rl氨基酸序列的⑶Rl區(qū)；i1.包括選定⑶R共有序列的⑶R2氨基酸序列的⑶R2區(qū)；和ii1.包括選定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3區(qū)；其中所述抗體特異性地結(jié)合選定的靶。
[0053]例如，這樣的抗體可以包含:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其具有:1.通式NNA/DVMC(SEQ IDNO:77)的 CDRl，通式 CMTTDVVTE/AYANWAKS (SEQ ID NO:78)的 CDR2 和通式 DSVGSPLMSFDL(SEQ ID NO:79)的 CDR3，和；b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域,其具有：通式 QASQN/SL/VYN/GNNELS (SEQ ID NO: 80 )的 CDRl，通式 W/RASTLAS (SEQ ID NO: 81)的 CDR2 和通式 A/S/GGYKSYS/YND/GGN/ SG (SEQ ID NO:82)的 CDR3，其中抗體阻斷 VEGF。
【權(quán)利要求】
1.一種抗體，其包含: a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括與圖1中所示的選定抗體的重鏈CDR區(qū)基本上相同的CDR區(qū)和 b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包括與選定抗體的輕鏈CDR區(qū)基本上相同的CDR區(qū)， 其中該抗體結(jié)合選定的靶。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單價(jià)抗體。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是二價(jià)抗體。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是人源化的。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
7.一種方法，其包括: 在適于所述抗體與所述靶結(jié)合以產(chǎn)生復(fù)合物的條件下，使權(quán)利要求1的抗體與所述抗體的靶接觸。
8.—種阻斷配體 與其受體結(jié)合的方法，其包括: 將權(quán)利要求1的抗體給予受治療者，其中所述抗體與所述受治療者體內(nèi)的受體或配體結(jié)合并阻斷所述受體與所述配體的結(jié)合。
9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的抗體和藥物學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103992405SQ201410106341
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2008年3月26日
【發(fā)明者】柯耀煌, 朱偉民, 余國良 申請(qǐng)人:宜康公司