重組人透明質酸酶及其制備方法和采用聚乙二醇共價修飾的化合物和方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用生物醫(yī)藥領域，尤其涉及重組人透明質酸酶及其制備方法和采用聚 乙二醇共價修飾的化合物和方法。
【背景技術】
[0002] 透明質酸酶（hyaluronidase,HAase)主要專一性水解透明質酸，廣泛存在于真核 和原核生物中，在動物機體內參與許多重要的生物學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、 生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生， 是一種重要的生理活性物質。且于1928年被DuranReynals首次發(fā)現(xiàn)并稱為"擴散因子"， 1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質酸酶。
[0003] 其作用機理是通過催化透明質酸的水解，從而降低透明質酸的黏度，由此提高組 織通透性，因此其作為一種重要的藥物擴散劑，在臨床上被廣泛應用；除此之外，在美容領 域也有廣泛的應用，如整形修復，低分子量透明質酸生產(chǎn)等。
[0004]目前國內透明質酸酶基本來源是動物組織提取獲得，存在純度低（1-5% )、免疫 原性強、易產(chǎn)生過敏反應等問題。
[0005]目前國外已有各種形式的透明質酸酶被制備和批準用于人的治療用途。例如，源 于動物的透明質酸酶制備品包括純化的羊睪丸透明質酸酶Vitrase?(ISTAPharmaceutical s)和牛睪丸透明質酸酶Amphadase?(AmphastarPharmaceuticals)。Hylenex?(Halozy meTherapeutics)是人重組透明質酸酶，其通過經(jīng)遺傳工程修改的中國倉鼠卵巢（CH0)細 胞產(chǎn)生，所述CH0細胞含有編碼可溶性rHuPH20的核酸。經(jīng)FDA批準的對于透明質酸酶的 治療用途包括作為佐劑使用以提高用于皮下注入（皮下液體施用）的其它所注射的藥物的 吸收和分散，以及在皮下尿路造影術（subcutaneousurography)中作為助劑用以改善放射 造影劑（radiopaqueagent)的再吸收。在這些適應癥之外，透明質酸酶包括sHuPH20,可作 為治療或美容藥劑用于處理另外的疾病和狀況。
[0006] 在專利CN103614352A中，發(fā)明人公開了一種高效重組表達透明質酸酶的方法，通 過在水蛭的透明質酸酶基因N端添加一段編碼組氨酸的核苷酸序列，構建重組畢赤酵母工 程菌株，不僅簡化了透明質酸酶的純化步驟，同時實現(xiàn)了重組透明質酸酶的高活性分泌表 達。
[0007] 在專利CN104263707A中，發(fā)明人公開了一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶 的方法，通過在水蛭的透明質酸酶基因前段融合一段信號肽序列，解決了原重組菌株產(chǎn)量 較低的問題，實現(xiàn)了重組透明質酸酶在畢赤酵母中產(chǎn)量的顯著提高，為進一步降低水蛭透 明質酸酶的生產(chǎn)成本和擴大應用范圍奠定了一定的基礎，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008] 在專利CN101970650A中，發(fā)明人公開了一種可溶性透明質酸酶的大規(guī)模生產(chǎn)方 法，將人的透明質酸酶基因通過基因工程手段加入中國倉鼠卵巢（CH0)細胞中，所述CH0細 胞含有編碼可溶性rHuPH20的核酸，通過宿主細胞（CHO)培養(yǎng)發(fā)酵，得到可溶性透明質酸 酶。
[0009] 透明質酸酶的穩(wěn)定性較差，其在機體內的主要不良反應是產(chǎn)生免疫反應，引起過 敏反應。靜脈注射血漿半衰期短，動物藥代動力學研宄表明該酶進入體內半衰期（T1/2)小 于3分鐘。聚乙二醇（polyethyleneglycol)，簡稱PEG)修飾技術的應用使PEG的許多優(yōu) 良特性轉移到修飾的透明質酸酶中去。當PEG偶聯(lián)到透明質酸酶分子表面時，透明質酸酶 的穩(wěn)定性大大增強，同時可減少透明質酸酶藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并 使透明質酸酶藥物不易被免疫系統(tǒng)的細胞識別。PEG修飾的透明質酸酶藥代動力學性質也 發(fā)生很大的改變，半衰期延大大長。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的一個目的是提供一種重組人透明質酸酶及其制備方法，該方法將人透明 質酸酶基因整合入畢赤酵母工程菌中，通過發(fā)酵純化，得到大量高活性高純度的重組人透 明質酸酶。本發(fā)明的二個目的是提供一種重組人透明質酸酶聚乙二醇修飾化合物及其制備 方法，該化合物活性高、免疫原性低、穩(wěn)定性好。
[0011] 為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：
[0012] 一種重組人透明質酸酶的制備方法，該方法包括以下的步驟：
[0013] 1)表達載體的構建及轉化畢赤酵母工程菌：
[0014] 將人透明質酸酶基因片段插入到表達載體的酶切位點上，轉化至E.coilT0P10 中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達質粒，重組質粒經(jīng)SacI線性化后電轉入表 達宿主畢赤酵母中（P.pastoris)，得到工程菌，其中所述的表達載體是pPIC系列載體；
[0015] 2)陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導表達：
[0016] 篩選出陽性克隆在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，經(jīng)誘導使目標蛋白表達；
[0017] 3)表達產(chǎn)物的分離純化：
[0018] 收集發(fā)酵液，經(jīng)離心得到發(fā)酵上清，然后對發(fā)酵上清用層析技術純化；
[0019] 上述的人透明質酸酶的cDNA序列如SEQIDN0:1所示，編碼一個序列如SEQID N0:2所示氨基酸的蛋白質；所述的人透明質酸酶的編碼序列來源于基因文庫，或者根據(jù)文 獻報道的人透明質酸酶的cDNA序列全基因合成，或者設計引物，通過PCR擴增獲得。
[0020] 作為優(yōu)選，所述的pPIC系列載體是pPIC9k、pPICZaA、pPICZaB、pPICZaC中的 一種或多種。
[0021] 作為優(yōu)選，所述的步驟1)中表達載體的酶切位點是XhoI/XbaI或BamHI/NotI 位點。
[0022] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)中陽性克隆篩選采用Zeocin做抗性篩選。
[0023] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)中的培養(yǎng)溫度控制在25-40°C，再優(yōu)選的培養(yǎng)溫度控制 在 30-35 °C。
[0024] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)中的誘導表達使用終濃度0. 5% -1. 5% (v/v)的甲醇作 為誘導劑，再優(yōu)選的誘導表達使用終濃度0.5%-1% (v/v)的甲醇。
[0025] 作為優(yōu)選，所述的步驟2)的誘導表達溫度控制在25-40°C，再優(yōu)選的誘導表達溫 度控制在30-35 °C。
[0026] 作為優(yōu)選，所述的步驟3)中的層析技術是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析 中的一種或多種方法。
[0027] 本發(fā)明還公開了上述任一項技術方案獲得重組人透明質酸酶。
[0028] 為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：
[0029] 上述的重組人透明質酸酶聚乙二醇修飾化合物；聚乙二醇和重組人透明質酸酶以 共價鍵連接，每個重組人透明質酸酶分子平均結合5~15個聚乙二醇分子，聚乙二醇修飾 重組人透明質酸酶的酶比活性大于25, 000U/mg。作為優(yōu)選，酶比活性為大于30, 000U/mg。
[0030] 作為優(yōu)選，所述的聚乙二醇為含單一活性功能基團的直鏈單甲氧基聚乙二醇，其 結構式如下：
【主權項】
1. 一種重組人透明質酸酶的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟： 1) 表達載體的構建及轉化畢赤酵母工程菌： 將人透明質酸酶基因片段插入到表達載體的酶切位點上，轉化至E. coil TOPlO中，在 確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達質粒，重組質粒經(jīng)Sac I線性化后電轉入