一種聚乙二醇修飾的巴西芬凈及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及聚乙二醇修飾的己西芬凈及其制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 隨著大量抗菌藥物、抗腫瘤藥物、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的使用增多W及器官移 植、介入技術(shù)手術(shù)和獲得性免疫缺陷綜合征發(fā)病率的逐年上升，深部真菌感染的發(fā)病率也 逐年增加。目前只有一些挫類抗真菌藥物(兩性霉素B，氣胞喀晚和一些挫類藥物)在運(yùn)類治 療中起到效果。而此類藥物，從療效、藥物毒性，抗菌譜W及藥物抗性的角度看來，治療效果 有一定的局限性。其中大環(huán)內(nèi)脂類抗菌素，兩性霉素B在臨床中運(yùn)用的效果最好，與其他抗 菌藥物不同，兩性霉素B是同時(shí)作用于成熟的和正在生長的病原菌細(xì)胞。然而兩性霉素B的 靜脈給藥具有較大的毒性。因此，我們需要一種更安全、療效更好的抗菌素。
[0003] 己西芬凈是從絲狀真菌(Aureobasidiumpullulans)Rioe中分離出來的環(huán)醋膚類 抗生素，具有很強(qiáng)的抗真菌能力。在較低的濃度下(0.1-0.5μg/ml)即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。對(duì) 其敏感的真菌種類包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevi Siae )、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉 (Aspe;rgiIlusnidulans)和黑曲霉(A.niger.)。其作用機(jī)制是，己西芬凈抑制了真菌生長所 依賴的肌醇憐酷胺（inositol phospkxryIceramide，IPC)合成酶的活性，干擾銷脂合成，從 而進(jìn)一步殺死菌株。并且，己西芬凈不會(huì)破壞DNA，RNA和蛋白質(zhì)的合成。
[0004] 聚乙二醇是一種具有高度親水性的聚合大分子，其無毒，抑中性，是具有較好生物 相容性的獨(dú)特理化性質(zhì)的一類高分子聚合物。聚乙二醇具有極強(qiáng)的親水性，且沒有免疫原 性，它與藥物連接W后會(huì)改變藥物的性質(zhì)，將聚合物自身的優(yōu)良性質(zhì)賦予藥物分子。此外。 聚乙二醇是迄今為止已知的大分子聚合物中細(xì)胞和蛋白吸收水平最低的分子，鑒于其具有 W上優(yōu)良性質(zhì)，聚乙二醇已被美國抑A批準(zhǔn)作為體內(nèi)注射藥用聚合物分子。
[0005] 聚乙二醇修飾的己西芬凈有較強(qiáng)的溶解能力，而由于聚乙二醇在己西芬凈周圍形 成的屏障，產(chǎn)生了大分子的空間位阻作用，從而減少了己西芬凈在體內(nèi)的酶解，使其半衰 期延長，避免了己西芬凈在腎臟中很快代謝消除，提高其治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明設(shè)及一種聚乙二醇修飾的己西芬凈及其制備方法，目的在于在提高己西芬 凈的穩(wěn)定性、延長其半衰期、提高其治療效果。
[0007] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:先將聚乙二醇的一端與二班巧 酷亞胺碳酸醋連接形成活潑醋，所述聚乙二醇修飾劑與己西芬凈通過醋鍵連接，得到聚乙 二醇修飾的己西芬凈化合物。
[000引具體的，將活化的mPEG通過共價(jià)鍵偶聯(lián)到己西芬凈上，形成通式為D-R的化合物， 其中D為己西芬凈，R為聚乙二醇修飾劑陽G-(C = O)-D
[0009] 其中所述聚乙二醇為分子量3W)a~SOKDa的直鏈聚乙二醇，優(yōu)選為分子量為3W)a， 6kDa，9kDa，I OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa 更優(yōu)選分子量為 9kDa。
[0010] mPEG要和己西芬凈結(jié)合，需要根據(jù)連接分子的特性選擇活化所需的功能基團(tuán)，對(duì) mPEG分子的一端進(jìn)行活化，常見具有生物相容性的活化基團(tuán)包括醋基、酷胺基、酷亞氨基、 氨基甲酸醋基、簇基、徑基、班巧酷亞氨基、環(huán)氧基、氧幾基咪挫基、硝基苯基、醒基、半脫氨 酸基、組氨酸基或伯胺等。優(yōu)選班巧酷亞胺班巧酷醋（SS)、班巧酷亞胺碳酷醋（SC)、對(duì)硝基 苯碳酸和醒基(adehyde)等，更優(yōu)選班巧酷亞胺班巧酷醋(SC)。
[ocm]另外，本發(fā)明還提供了該復(fù)合物的制備方法，其工藝如下：

【附圖說明】
[0013] 圖1為己西芬凈抗菌活性
[0014] 圖2為己西芬凈在小鼠內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)
【具體實(shí)施方式】：
[0015] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0016] 實(shí)施例1制備mPEG-C(=0)-己西芬凈 [0017] 1. ImPEG-SC樣品的制備（3)
[001引將不同分子量的聚乙二醇陽G分別溶于適量的二氯甲燒中，加入1.1當(dāng)量的DSC(二 班巧酷亞胺碳酸醋），2當(dāng)量的DIEA(二異丙基乙胺），加入0.2當(dāng)量的DMAP(N，N-二甲基氨基 化晚），溫控60°C，反應(yīng)化，濃縮，異丙酸析晶，分別得到不同分子量的PEG班巧酷亞胺活化產(chǎn) 物陽G-SC。
[0019] 1.2mPEG-C(=0)-己西芬凈樣品制備(5)
[0020] 本發(fā)明的聚乙二醇修飾的己西芬凈包括W下步驟:將憐酸緩沖液加入己西芬凈溶 液中，調(diào)節(jié)其pH至6.0-9.0，然后加入mPEG-SC在5~40°C進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選為25°C，反應(yīng)時(shí)間為 2~6小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)。將反應(yīng)混合液用色譜分離，流動(dòng)相為含氯化鋼醋酸緩沖液，色譜分 離后，濃縮，凍干可得不同分子量的聚乙二醇修飾的己西芬凈;所述的己西芬凈溶液重量為 Img/mL的水溶液。本發(fā)明所述的聚乙二醇修飾己西芬凈可W制備抗真菌藥物。
[0021 ]實(shí)施例2體外抗菌實(shí)驗(yàn)比較
[0022] 取未修飾的己西芬凈及不同分子量的mPEG修飾后的己西芬凈（3kDa、化化、9kDa、 1040曰、2040曰、3040曰、4040曰、5040曰），分別置于37°(30,2,4,6,8，12,24,48,7化定時(shí)取樣 0.1ml，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)對(duì)抗真菌活性的影響，結(jié)果W活性保留百分?jǐn)?shù)表示。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。
[0023] 實(shí)施例3不同分子量mPEG修飾的己西芬凈在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究
[0024] 雄性昆明中小鼠84只，按隨機(jī)分成組，每只小鼠快速尾靜脈注射給藥分子量不同 的己西芬凈lOOuL，分別為basi化ngin，mPEG-C( =0)-basi化ngin(3kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(6kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(9kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(lOkDa)， mPEG-C( =0)-basifungin(20kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(30kDa)，mPEG-C( =0)-6日31化叫111(401^)日），111?66-(：(=0)-6日31化叫111(501^)日）。給藥0,2,4,6,8，12,24,48,7化（9 個(gè)時(shí)間點(diǎn)），眼球取血O.lmL，離屯、取血清，應(yīng)用放射免疫法測(cè)定血藥濃度，經(jīng)時(shí)曲線見圖2。 其中未經(jīng)修飾的basifungin在1化時(shí)，血藥濃度最高為0.74mgA^L，5kDamPEG-C(=0)-basi 化 ngin 在化時(shí) ，血藥濃度最高為 0.89mgAiL，9kDam 陽 G-C(=0)-basi 化 ngin 在 1 化時(shí)血 藥濃度最高為〇.93mgAiL，20kDam陽G-C(=0)-basifungin在24h時(shí)血藥濃度最高為0.73mg/ yL。W上結(jié)果可W得出，經(jīng)PEG修飾的己西芬凈能明顯的延緩藥物延緩時(shí)間，其中隨著PEG分 子量的增大，其藥物代謝時(shí)間越長。綜合代謝時(shí)間W及藥物效果，W9kDa的PEG-(C = O)-b 曰 sifungin 最佳。
[00巧]實(shí)施例4 mPEG-C( =0)-basifungin的修飾條件 [00%] 1 .pH值對(duì)聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0027] 用25毫摩爾/升的化抽Kk-K出K)4緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系寬起始抑值 5.0~10.0及窄起始pH值6.0~9.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，維持反應(yīng)體系己西芬凈濃度為0.5毫克/毫升， 溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速20化/min，總體積0.5毫升。反應(yīng)4小時(shí)后，各加20微升30 %冰醋酸終止 反應(yīng)。結(jié)果表明，反應(yīng)體系起始pH值低于6.0時(shí)，PEG修飾己西芬凈反應(yīng)不發(fā)生，起始pH值8.0 ~9.0時(shí)，有利于陽G修飾己西芬凈，聚乙二醇修飾己西芬凈的濃度達(dá)到0.11~0.12毫克/毫 升，總修飾率為44-50%。結(jié)果表明，聚乙二醇修飾己西芬凈反應(yīng)進(jìn)行的最優(yōu)選pH為8.3,此 時(shí)聚乙二醇己西芬凈濃度為0.112毫克/毫升，總修飾率為56.8%。因此，控制反應(yīng)體系的起 始抑值8.3為宜。
[0028] 2.反應(yīng)時(shí)間對(duì)聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0029] 控制起始pH8.3,其他反應(yīng)條件不變，研究反應(yīng)對(duì)聚乙二醇修飾己西芬凈的影響。 分別于反應(yīng)1、2、3、4、化取樣測(cè)定聚乙二醇修飾己西芬凈的含量。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，聚 乙二醇修飾己西芬凈含量逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)達(dá)到4h時(shí)，聚乙二醇修飾的己西芬凈含量達(dá)到 最高為0.137毫克/毫升。因此聚乙二醇修飾己西芬凈的反應(yīng)時(shí)間W4小時(shí)為最優(yōu)選。
[0030] 3.憐酸緩沖液對(duì)聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0031] 控制起始P冊(cè).3,反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，其他條件不變。研究憐酸緩沖液對(duì)聚乙二醇修 飾己西芬凈的影響。分別控制憐酸緩沖溶液濃度為5、10、15、20、25、30、40、50毫摩爾/升，測(cè) 定mPEG-C( =0)-basi化ngin的含量。隨著憐酸緩沖溶液的增加，mPEG-C( =0)-basifungin 的含量呈逐漸減低的趨勢(shì)，但緩沖溶液濃度不宜太低，WlO-30毫摩爾/升為宜，優(yōu)選為25毫 摩爾/升。
[0032] 4.溫度對(duì)聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0033] 在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，選擇5°C、25°C和40°C進(jìn)行聚乙二醇修飾己西芬凈溫度實(shí)驗(yàn)， 反應(yīng)中定時(shí)取樣。溫度顯著影響聚乙二醇修飾己西芬凈的速率，溫度越高，反應(yīng)速率越快。5 °C下，3小時(shí)前，反應(yīng)速率隨著時(shí)間的延長而增加，3h后緩慢增加;3小時(shí)和24小時(shí)mPEG-C(= 0)-basi化ngin的含量分別為0.157毫克/毫升和0.224毫克/毫升，修飾率分別為32.3%和 34%。25°(3和40°(3下，地時(shí)111?66-"=0)-6日31化叫111含量達(dá)到最大，隨后呈緩慢降低趨勢(shì)。 聚乙二醇己西芬凈含量最大值分別為0.227毫克/毫升和