一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 精氨酸是供給生物體合成絕大部分多肽及蛋白質(zhì)的重要氨基酸。正常細(xì)胞所需 精氨酸可經(jīng)體內(nèi)的尿素循環(huán)由精氨琥泊酸合成酶（argininosuccinatesynthetase,ASS) 與精氨琥泊酸裂合酶（argininosuccinatelyase，ASL)共同作用催化瓜氨酸而生成。 而一些腫瘤細(xì)胞，因其缺少ASS而自身無法正常合成精氨酸，必須從外部環(huán)境中攝取精 氨酸以進(jìn)行生長繁殖，這一類細(xì)胞被稱之為精氨酸營養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞，例如肝癌細(xì)胞 (hepatocellularcarcinomas,HCCs)和黑素瘤細(xì)胞（melanomas) 〇
[0003] 惡性黑素瘤和肝癌是在診斷一年內(nèi)殺死大多數(shù)患者的致命性疾病。其發(fā)病率正迅 速地增長，在其他國家其增長速率甚至更高。在世界上肝炎流行的地方，肝癌的發(fā)病率更 高。急需對(duì)這些疾病進(jìn)行有效治療。
[0004] 已有用選擇性去除必需氨基酸的方法來治療某些癌癥。比如通過分解精氨酸對(duì)腫 瘤細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)剝奪的精氨酸酶。精氨酸酶體外抗腫瘤活性自1960年已有報(bào)道（Bach，S. J. ,R.A.Hawkins,andD.Swaine.〃Ashortmethodforthepurificationofarginase fromoxliver."BiochemicalJournal89. 2 (1963): 263.)。雖然精氨酸酶的體外抑瘤作 用明確，但將其用于體內(nèi)試圖通過精氨酸耗竭治療癌癥的多項(xiàng)研宄并沒有取得預(yù)期的效 果（Storr,J.M.，andA.F.Burton.〃Theeffectsofargininedeficiencyonlymphoma cells."Britishjournalofcancer30. 1(1974):50.)，這是因?yàn)闄C(jī)體應(yīng)對(duì)氨基酸缺乏時(shí) 存在體內(nèi)氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制（aminoacidhomeostaticmechanism)，氨基酸匱乏時(shí)通過激 活蛋白質(zhì)分解途徑將精氨酸釋放到血液中參與循環(huán)，補(bǔ)充了精氨酸酶代謝造成的精氨酸耗 竭。
[0005] 精氨酸脫亞胺酶（argininedeiminase,EC3. 5. 3. 6，簡(jiǎn)稱ADI)是一種極具潛力 的用于治療精氨酸缺陷型腫瘤的抗癌新藥。它能在細(xì)胞內(nèi)將精氨酸分解成瓜氨酸和氨，使 精氨酸缺陷型癌細(xì)胞因精氨酸的供給被阻斷而死亡，從而達(dá)到治療癌癥的目的。2002年， Ensor等發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中重組表達(dá)的支原體ADI對(duì)精氨酸營養(yǎng)缺陷型的23種人的黑素 瘤以及16種人的肝細(xì)胞瘤在體外和體內(nèi)都具有活性，通過對(duì)ADI進(jìn)行聚乙二醇（PEG)化 提高了ADI在體內(nèi)的半衰期。2004年，他們將AD1-PEG-20用于肝癌的臨床實(shí)驗(yàn)，結(jié)果成 功使患者血漿中的精氨酸的可檢測(cè)濃度降為零。目前，美國鳳凰公司開發(fā)的支原體來源的 ADI-PEG-20制劑用于肝細(xì)胞癌和黑素瘤（藥品名稱分別為H印acid和Melanocid)的II期 和III期臨床試驗(yàn)正在全球多個(gè)中心進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸 脫亞胺酶（PEGadi)，該P(yáng)EGadi免疫原性降低，活性下降少，半衰期延長。適合臨床應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0008] -種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，該化合物采用1~30個(gè)支化聚 乙二醇對(duì)精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行修飾，支化聚乙二醇為含單一活性功能基團(tuán)的Y型甲氧基聚 乙二醇，并且單一活性功能基團(tuán)設(shè)置在端點(diǎn)，結(jié)構(gòu)式如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，其特征在于：該化合物采用1~ 30個(gè)支化聚乙二醇對(duì)精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行修飾，支化聚乙二醇為含單一活性功能基團(tuán)的Y 型甲氧基聚乙二醇，并且單一活性功能基團(tuán)設(shè)置在端點(diǎn)，結(jié)構(gòu)式如下：
所述的nl，n2，n3分別為大于等于1的正整數(shù)，且nl+n2+n3的值為80~2000,其中n3 的值優(yōu)選為5~100 ;所述的R為修飾精氨酸脫亞胺酶的活性功能基團(tuán)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，其特征在 于：Y型甲氧基聚乙二醇分子量為2000~lOOOODa。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，其特征在 于：活性功能基團(tuán)選自琥珀酰亞胺酯、硝基苯酯、琥珀酸基琥珀酸酯、琥珀酸基碳酸酯、馬來 酰亞胺和碘代乙酰胺及其組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，其特征在 于：活性功能基團(tuán)選自琥珀酸碳酸酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞 胺酶化合物，其特征在于：精氨酸脫亞胺酶采用3~12個(gè)Y型甲氧基聚乙二醇修飾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，其特征在 于：精氨酸脫亞胺酶采用5~9個(gè)Y型甲氧基聚乙二醇修飾。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶。一種聚乙二醇修飾的重組精氨酸脫亞胺酶化合物，該化合物采用1～30個(gè)支化聚乙二醇對(duì)精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行修飾，支化聚乙二醇為含單一活性功能基團(tuán)的Y型甲氧基聚乙二醇，并且單一活性功能基團(tuán)設(shè)置在端點(diǎn)。本發(fā)明在同樣降低免疫原性的情況下，修飾位點(diǎn)的個(gè)數(shù)更少，影響蛋白活性中心的可能性更低，因此蛋白酶比活性更高。本發(fā)明聚乙二醇修飾精氨酸脫亞胺酶比以往的精氨酸脫亞胺酶更有效地分解耗盡細(xì)胞的外源性精氨酸，更低的免疫原性，可用于治療相關(guān)的多種腫瘤疾病。
【IPC分類】C12N9-96, C12N9-78
【公開號(hào)】CN104745565
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510140645
【發(fā)明人】張弨, 封小燕, 張加慧, 劉翔, 韓雯
【申請(qǐng)人】杭州北斗生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日