一種聚乙二醇修飾trail重組蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由于生物制藥技術(shù)的發(fā)展使得蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)藥物大量生產(chǎn)成為可能， 但是多肽藥物存在著體內(nèi)循環(huán)的半衰期短、易在胃腸道內(nèi)被蛋白水解酶破壞、水溶性差、抗 原性較強(qiáng)引起過(guò)敏、以及易于引起中和抗體的產(chǎn)生等缺點(diǎn)，限制著它的應(yīng)用。因此，現(xiàn)有技 術(shù)中針對(duì)具有醫(yī)療作用的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾來(lái)使其走向藥物應(yīng)用的技術(shù)被廣 泛研究。蛋白質(zhì)或多肽的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)修飾即PEG化 (PEGylation)，是將活化的PEG通過(guò)化學(xué)方法以共價(jià)鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上。自1977 年Davis首次采用PEG修飾牛血清白蛋白以來(lái)，PEG修飾技術(shù)迅速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于多種蛋 白質(zhì)和多肽的化學(xué)修飾，PEG修飾技術(shù)也從理論走向?qū)嶋H的藥物應(yīng)用。
[0003] PEG修飾能賦予蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)多種優(yōu)良性能，具體表現(xiàn)為循環(huán)半衰期延長(zhǎng)、免疫 原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等，在很大程度上擴(kuò)寬了 蛋白質(zhì)和多肽的的應(yīng)用范圍。其機(jī)理可能為:蛋白質(zhì)PEG修飾后，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)增大，當(dāng) 修飾后的蛋白質(zhì)的Mr達(dá)到或超出腎小球?yàn)V過(guò)閾值時(shí)，蛋白質(zhì)隨血液循環(huán)進(jìn)入腎臟后就可以 逃避腎小球的濾過(guò)作用；由于PEG的屏蔽效應(yīng)，使得修飾后的蛋白質(zhì)或多肽不易受到各種蛋 白酶的攻擊，降解速率明顯降低，穩(wěn)定性提高，因而可以在血液循環(huán)中停留更長(zhǎng)的時(shí)間;PEG 在溶液中呈無(wú)規(guī)則卷曲，作為一種屏障，能掩蓋蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，使得蛋白質(zhì)不能 與各種細(xì)胞表面受體結(jié)合，不被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，避免了相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，降低了蛋白 質(zhì)的免疫原性;PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后能將其優(yōu)良的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，如能改善蛋白質(zhì)的 生物分布和溶解性能。
[0004] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 也稱(chēng)為凋亡素-2 配體 (Apo_2L) ，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子 (TNF)基因超家族成員，屬于II型跨膜蛋白（transmembrane protein)。TRAIL是一個(gè)由281 個(gè)氨基酸構(gòu)成的II型跨膜蛋白，其中從第114個(gè)精氨（arginine)到第281個(gè)甘氨酸 (glysine)的序列為誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的主要功能區(qū)域。它能通過(guò)與死亡受體結(jié)合選擇性誘 導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞幾乎沒(méi)有不良反應(yīng)。這一特性 使得TRAIL在腫瘤的靶向治療中具有良好的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ?抗腫瘤因子，近年已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但單體結(jié)構(gòu)的TRAIL不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，只有 三聚體結(jié)構(gòu)的TRAIL才能與死亡受體(DR4，DR5)相結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞凋亡的作用。但是在自然情 況下TRAIL很難形成三聚體結(jié)構(gòu)，把TRAIL應(yīng)用到臨床上仍有許多問(wèn)題亟待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是為解決利用聚乙二醇修飾腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 的難題，提供一種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白的制備方法，利用PET表達(dá)載體對(duì)人類(lèi)TRAIL 基因（114-281序列）進(jìn)行基因克隆制作出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽(Histidine tag)和異亮 氨酸拉鏈基序（Leucine zipper)的TRAIL重組基因（PET23dw-His-ILZ-hTRAIL( 114-281)， 簡(jiǎn)稱(chēng)HZ-TRAIL)。利用PEGylation技術(shù)將TRAIL重組基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生產(chǎn)三 聚體的高活性TRAIL蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明利用聚乙二醇修飾的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo) 配體對(duì)抗腫瘤和抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有高藥效的優(yōu)點(diǎn)。
[0006 ]為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明技術(shù)方案包括：
[0007] -種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白的制備方法，所述誘導(dǎo)配體為腫瘤壞死因子相 關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL，所述制備方法為化學(xué)修飾方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟一 :HZ-TRAIL的制備:利用PET表達(dá)載體對(duì)人類(lèi)TRAIL蛋白中114-281基因序列 進(jìn)行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAIL114-281 的TRAIL重組蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)HZ-TRAIL;
[0009] 步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)繁處理，然后將HZ-TRAIL在大 腸桿菌中重組表達(dá)，大腸桿菌細(xì)胞通過(guò)聲波降解法裂解，并離心處理后，取20ml上清液緩慢 注入到鎳氮三乙酸螯合瓊脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的組氨酸和金屬鎳離子充分吸附，利用 鎳-親和色譜法進(jìn)行逐步洗脫提取HZ-TRAIL，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析法進(jìn)行純化，保存在-20°C， 備用；
[0010] 步驟三:PEG-HZ-TRAIL的制備:取重量份數(shù)為1份的步驟二制備出的HZ-TRAIL加入 到pH為5.0重量份數(shù)為0.15份的醋酸鹽緩沖液中，加入聚乙二醇修飾劑和還原劑，在低溫4 °C狀態(tài)下進(jìn)行N端氨基修飾，使PEG以共價(jià)鍵偶聯(lián)到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即為PEG-HZ-TRAIL蛋白，反應(yīng)時(shí)間為8-12小時(shí)，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反應(yīng)混合物；
[0011]步驟四：PEG-HZ-TRAIL的純化:將所述步驟三制備出的反應(yīng)混合物利用凝膠過(guò)濾 層析法進(jìn)行分離純化，然后通過(guò)超濾法濃縮，最終得到PEG-HZ-TRAIL。
[0012] 所述步驟二中的擴(kuò)繁處理?xiàng)l件為在25~30°C，擴(kuò)繁6~9個(gè)小時(shí)。
[0013] 所述步驟二中的離心處理?xiàng)l件為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫度為4°C，離心處理 20min〇
[0014]所述步驟三中的還原劑為NaCNBH3,所述加入還原劑的重量份數(shù)為0.13份。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟三中加入聚乙二醇修飾劑的重量份數(shù)為2~10份。更優(yōu)選地，所 述步驟三中加入聚乙二醇修飾劑的重量份數(shù)為7.5份。優(yōu)選地，所述步驟三中的反應(yīng)時(shí)間為 8h〇
[0016] 所述的三聚體TRAIL重組蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。一種經(jīng)三聚體 TRAIL重組蛋白，適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
[0017] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可誘導(dǎo)癌細(xì)胞或炎性淋巴細(xì)胞凋亡。
[0018] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可應(yīng)用于抗腫瘤藥物中。
[0019] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中。
[0020] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0021 ] 1、本發(fā)明一種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白的制備方法，利用PFG技術(shù)將HZ-TRAIL 改良成新的PEG-HZ-TRAIL，從而延長(zhǎng)了HZ-TRAIL的半衰期、通過(guò)延緩蛋白的排泄，提高其抗 酶解的能力，增加其溶解性與穩(wěn)定性，以及降低其免疫原性，顯著延長(zhǎng)了HZ-TRAIL的體內(nèi)生 物活性。另外，通過(guò)進(jìn)一步研究證明了 PEG-HZ-TRAIL在抗腫瘤和抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效。 [0022] 2、PEG-HZ_TRAIL可以誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)任何副作 用。
[0023] 3、PEG-HZ-TRAIL在RA發(fā)病過(guò)程中通過(guò)誘導(dǎo)炎性淋巴細(xì)胞的凋亡，降低炎癥反應(yīng)， 對(duì)關(guān)節(jié)起保護(hù)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1所示為本發(fā)明一種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白PEG-HZ-TRAIL制備模式圖。 [0025]圖2所示為本發(fā)明一種聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白HZ-TRAIL的制備模式圖。
[0026] 圖3A所示為在一般生理環(huán)境條件下HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度隨時(shí)間變化 圖；
[0027] 圖3B所示為在血漿溶液中HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度隨時(shí)間變化圖。
[0028] 圖4所示為本發(fā)明實(shí)施例5 HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的藥代動(dòng)力學(xué)比較分析圖。 [0029]圖5所示為本發(fā)明實(shí)施例6 PEG-HZ-TRAIL對(duì)大腸癌細(xì)胞(HCT116)殺傷能力測(cè)定 圖。
[0030]圖6所示為本發(fā)明實(shí)施例6 PEG-HZ-TRAIL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)的凋亡能力測(cè)定 圖。
[0031 ]圖7A所示為本發(fā)明實(shí)施例6 HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比較分析 圖；
[0032]圖7