本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種基于聚乙二醇的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥、其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是機體在多種因素、多個階段和多次突變而導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變的結(jié)果，在醫(yī)學(xué)上也稱之為惡性腫瘤。癌癥的殺傷力大、易轉(zhuǎn)移，通過破壞組織和器官的各項功能，最終導(dǎo)致人們因器官功能的衰竭而死亡。據(jù)統(tǒng)計，隨著人口的增長，癌癥的發(fā)病率也在不斷增長，嚴(yán)重危害著人類的健康，因此，癌癥治療方法備受國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者們的重視。

在過去的幾十年里，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，各種癌癥的治療方法得到了迅速發(fā)展，包括手術(shù)治療、化學(xué)療法、放射療法、免疫治療、激素治療、靶向治療等。但是，化療過程中使用的小分子藥物（如：紫杉醇，阿霉素，喜樹堿等），在殺死腫瘤細(xì)胞作用的同時對正常細(xì)胞也有很強的損傷作用，因此，會引起嚴(yán)重的嘔吐、頭暈、機體機能下降等副作用。同時，小分子藥物在血液循環(huán)過程中易被機體識別并排出，加上腫瘤組織附近特殊的環(huán)境，如錯綜復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、致密的間質(zhì)結(jié)構(gòu)以及較高的間質(zhì)液壓力等，使得藥物很難到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。正是由于這些限制條件影響了抗腫瘤藥物在臨床上的療效。

通過前藥化，可以有效地解決上述問題。前藥(prodrug)，也稱藥物前體、前驅(qū)藥物，是指經(jīng)過生物體轉(zhuǎn)化后具有藥理作用的化合物。聚合物前藥是指具有活性的藥物與起運輸作用的聚合物載體通過共價鍵結(jié)合，使藥物不具有活性。但是，當(dāng)前藥進(jìn)入機體循環(huán)和代謝過程中，可通過水解作用卸除載體，釋放出活性藥物，發(fā)揮藥理作用。這種方式可以有效地提高藥物的利用率，增強靶向性，降低藥物的毒副作用。

在聚合物前藥結(jié)構(gòu)中，對于聚合物基底材料的選擇至關(guān)重要，生物相容性是材料用于藥物載體的最基本要求。聚乙二醇（peg）具有無毒性、良好生物相容性和生物可降解性，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)使用。通過對peg進(jìn)行末端官能化修飾，再與疏水性藥物鍵合，可以制備聚合物前藥，賦予藥物分子一些優(yōu)良性質(zhì)。盡管聚合物前藥在癌癥治療中具有很大的優(yōu)勢，但是，如何將更多藥物傳遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，仍然是一直備受關(guān)注的問題。藥物到達(dá)病灶位點需要克服各種屏障，應(yīng)考慮在血液循環(huán)過程中如何保持輸運載體的穩(wěn)定性，延長循環(huán)時間；如何高效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，更多地累積在特定的部位；如何對藥物可控釋放等等。如果不解決這些問題，就會大大地降低藥物對癌癥的治療效果。

現(xiàn)有技術(shù)中，已有一些關(guān)于還原敏感和酸敏感性前藥的報道。但是，作為抗腫瘤前藥，應(yīng)當(dāng)具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作為抗腫瘤前藥，還應(yīng)當(dāng)具有下列特征：在水溶液中可以形成穩(wěn)定的聚合物膠束，親水性外殼起到穩(wěn)定膠束、提高膠束血液循環(huán)時間的作用；前藥膠束在體內(nèi)循環(huán)時，具有抗凝血和抗蛋白吸附的性能；當(dāng)載藥膠束到達(dá)腫瘤或病變組織時，能夠利用局部組織低的ph條件和高的谷胱甘肽濃度的特點，破壞膠束，快速釋放出抗癌藥物。因此，需要尋求更多的藥效明顯、且在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中具有還原和酸敏感性抗腫瘤前藥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于聚乙二醇的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥及其制備方法；該阿霉素前藥具有良好的生物相容性和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。

本發(fā)明具體的技術(shù)方案為：一種還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥，由下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式表達(dá)：

m為3～113，n為3～15。

上述技術(shù)方案中，阿霉素前藥具有酸敏感性的基團(tuán)以及還原敏感性的基團(tuán)；該具有雙重響應(yīng)性的阿霉素前藥在結(jié)構(gòu)上含有的疏水性阿霉素部分，用于形成膠束的內(nèi)核，peg親水性部分包裹在內(nèi)核外邊形成膠束的外殼，對膠束的穩(wěn)定性具有很好的作用。在還原和ph條件下，酸敏感基團(tuán)以及還原敏感基團(tuán)發(fā)生斷裂，膠束被破壞，從而快速地釋放出聚集在膠束內(nèi)部的疏水性抗癌藥物。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥的數(shù)均分子量為4000～80000g·mol^-1。

本發(fā)明采用結(jié)構(gòu)中含有酸敏感基團(tuán)以及還原敏感基團(tuán)的交替共聚物poly(ss-alt-a)作為基本原料，經(jīng)銅鹽及配體催化化學(xué)反應(yīng)活化后與抗癌藥物阿霉素反應(yīng)，制備基于聚乙二醇的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox。

上述還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥的制備方法，包括以下步驟：

(1)以6-疊氮己酰肼與阿霉素鹽酸鹽（dox×hcl）作為原料，無水甲醇為溶劑，冰醋酸為催化劑，通過化學(xué)反應(yīng)獲得阿霉素衍生物；

其中，6-疊氮己酰肼與阿霉素鹽酸鹽的摩爾比為1：(2～6)；

所述6-疊氮己酰肼的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

所述阿霉素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

(2)惰性氣體氣氛條件下，在銅鹽催化劑和配體的存在下，以3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯與二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇為原料，以無水n,n-二甲基甲酰胺為溶劑，通過反應(yīng)制備獲得兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物；

其中，二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇、3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯和銅鹽催化劑的摩爾比為1∶(1.1～1.5)∶（0.5～1.5）；銅鹽催化劑和配體的摩爾比為1∶(1～2)；

所述3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

所述二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式為：

上述m為3～113；

所述兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物的結(jié)構(gòu)式為：

上述m為3～113，n為3～15。

(3)以無水n,n-二甲基甲酰胺作為溶劑，在銅鹽催化劑和配體的存在下，用步驟(2)獲得的兩端炔基封端的的聚乙二醇交替共聚物與步驟(1)獲得的阿霉素衍生物反應(yīng)，制備得到所述還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥；

所述兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物、阿霉素衍生物的摩爾比為1：(2～5)。

上述技術(shù)方案中，制備阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl），主要通過三個步驟制備而成：

第一步，制備6-疊氮己酸甲酯。以6-溴己酸甲酯與疊氮化鈉（nan3）反應(yīng)，以dmf為溶劑，進(jìn)行疊氮化反應(yīng)，獲得6-疊氮己酸甲酯。其中，6-溴己酸甲酯、疊氮化鈉的摩爾比為1：(1.5～5)；

第二步，制備6-疊氮己酰肼。以第一步合成的6-疊氮己酸甲酯與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的水合肼反應(yīng)，以四氫呋喃（thf）作為溶劑，通過酰胺化反應(yīng)，獲得6-疊氮己酰肼。其中，6-疊氮己酸甲酯與水合肼的摩爾比為1：(10～30)；

第三步，制備阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）。采用第二步合成的6-疊氮己酰肼與阿霉素鹽酸鹽（dox×hcl）作為原料，以無水甲醇為溶劑，冰醋酸為催化劑，獲得阿霉素衍生物。其中，6-疊氮己酰肼與阿霉素鹽酸鹽的摩爾比為1：(2～6)；

制備兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物包括以下幾步：

制備炔基封端的并含有二硫鍵的小分子化合物3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）。采用3,3’-二硫代二丙酸與3-丁炔-1-醇為原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽為活化劑，4-二甲氨基吡啶為催化劑，二氯甲烷為溶劑，通過酯化反應(yīng)，獲得3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯。其中，3,3’-二硫代二丙酸與3-丁炔-1-醇的摩爾比為1：(1.5～3)；

制備疊氮基封端的二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3），通過兩步進(jìn)行：

第一步，合成二氯乙基二縮醛基聚乙二醇（cl-a-peg-a-cl）。采用聚乙二醇（ho-peg-oh）與2-氯乙基乙烯基醚（ceve）為原料、酸催化劑存在下，反應(yīng)得到末端為氯基的聚乙二醇產(chǎn)物cl-a-peg-a-cl。其中，聚乙二醇的分子量為：400~5000g·mol^-1，聚乙二醇與2-氯乙基乙烯基醚的摩爾比為1：(2～6)；酸催化劑為對甲基苯磺酸、對甲苯磺酸吡啶鎓、三氟乙酸中的一種；

第二步，合成二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）。將第一步得到的cl-a-peg-a-cl與疊氮化鈉反應(yīng)，以二氯甲烷為溶劑，得到二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）。其中，所述末端含氯基的聚乙二醇（cl-a-peg-a-cl）與疊氮化鈉的摩爾比為1：(2～6)；

制備炔基封端的聚合物poly(ss-alt-a)。在氮氣保護(hù)下，在銅鹽催化劑和配體的存在下，利用上述合成的3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）與二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，制備炔基封端的聚合物poly(ss-alt-a)。其中，二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）與3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）的摩爾比為1：(1.1～1.5)；

制備雙重響應(yīng)的阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox包括以下幾步：

利用脫鹽處理的阿霉素衍生物與上步合成的兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物poly(ss-alt-a)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，獲得還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox。其中，兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物與阿霉素衍生物的摩爾比為1：(2～5)。

上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，反應(yīng)溫度為60℃～80℃，反應(yīng)時間為12h～24h；步驟(2)中，惰性氣體為氮氣；反應(yīng)溫度為25℃～50℃，反應(yīng)時間為24h～72h；步驟(3)中，反應(yīng)溫度為25℃～50℃，反應(yīng)時間為24h～48h。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)和步驟(3)中，銅鹽催化劑選自五水合硫酸銅、氯化亞銅或溴化亞銅；配體選自：抗壞血酸鈉、聯(lián)吡啶、五甲基二亞乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亞乙基四胺中的一種。

本發(fā)明首次在銅鹽催化劑和配體的存在下，通過原料以及參數(shù)的限定，制備得到含有酸敏感基團(tuán)以及還原敏感基團(tuán)的聚乙二醇交替共聚物，解決了現(xiàn)有反應(yīng)體系無法制備出同時含有酸敏感基團(tuán)以及還原敏感基團(tuán)的交替共聚物的問題，是一種新型、簡單、高效、快速的合成方法。

進(jìn)一步的技術(shù)方案，在步驟(1)～(3)完成后，分別對產(chǎn)物進(jìn)行提純處理，所述純化過程包括以下步驟：

(i)阿霉素衍生物n3-hyd-dox×hcl的純化：反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用棉花過濾除去沉淀物，除去溶劑后在冰乙醚中沉淀三次；采用離心法得到沉淀物，將其放置在真空干燥箱中干燥得到紅色粉末狀的產(chǎn)物n3-hyd-dox×hcl；

(ii)兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物poly(ss-alt-a)的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用dmf透析48h后，置于60℃油浴中，減壓除去dmf；然后用150mlch2cl2重新溶解，用飽和nacl水溶液進(jìn)行萃取，除去銅鹽；有機層用無水na2so4干燥4h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再在乙醚溶液中沉淀3次，將沉淀物收集并真空干燥，最終得到粘性產(chǎn)物poly(ss-alt-a)；

(ⅲ)還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox的純化：反應(yīng)結(jié)束后，采用去離子水透析72h，將透析袋中所得到的紅色透明液體冷凍干燥，獲得深紅色固體產(chǎn)物dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox。

上述技術(shù)方案中，步驟(i)中，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法除去溶劑；步驟(ii)中透析時采用截留分子量為1000～14000da的透析袋；步驟(ⅲ)中，透析時采用截留分子量為3500～14000da的透析袋。

具體的提純包括以下步驟：

(i)制備阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）的純化：

第一步，制備6-疊氮己酸甲酯的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用中性三氧化二鋁的短柱過濾反應(yīng)液，并用油泵減壓除去溶劑dmf。隨后，用大量的二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，用30ml的二次水萃取三次，將有機相收集并用無水硫酸鈉干燥4h。最后，用棉花過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥24h，得到無色的液體產(chǎn)物6-疊氮己酸甲酯；

第二步，制備6-疊氮己酰肼的純化：反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去thf后換用ch2cl2溶解。在分液漏斗中，采用飽和氯化鈉水溶液萃取粗產(chǎn)物。將有機相用無水na2so4干燥4h，除去溶劑后真空干燥，最終收集到產(chǎn)物6-疊氮己酰肼；

第三步，制備阿霉素衍生物的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用棉花過濾除去反應(yīng)液中的na2so4，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，在冰乙醚中沉淀三次。最終，采用離心法得到下面的沉淀物，將其放置在真空干燥箱中干燥24h，得到紅色粉末狀產(chǎn)物，即為n3-hyd-dox×hcl；

(ii)制備炔基封端的3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用濾紙過濾，除去反應(yīng)中生成的鹽，再用150ml的ch2cl2溶解，用1mhcl溶液和飽和氯化鈉（nacl）水溶液的混合溶液萃取2次，每個水層繼續(xù)用30ml的ch2cl2萃取3次。將有機層收集后，用無水na2so4干燥4h，除去溶劑后的粗產(chǎn)物繼續(xù)采用柱層析法進(jìn)行分離提純。收集最終產(chǎn)物，真空干燥24h，即得到3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）；

(ⅲ)制備疊氮基封端的二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）的純化：

第一步，制備合成二氯乙基二縮醛基聚乙二醇（cl-a-peg-a-cl）的純化：反應(yīng)結(jié)束后，先用ch2cl2稀釋反應(yīng)液，用10ml的磷酸緩沖溶液（pbs，ph10.0)和飽和nacl水溶液的混合溶液萃取，得到的水層繼續(xù)用ch2cl2萃取三次。有機層用無水na2so4干燥4h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大量溶劑，剩約3ml粗產(chǎn)物溶液時，將其在正己烷中沉淀三次，收集沉淀物并真空干燥，得到產(chǎn)物cl-a-peg-a-cl；

第二步，制備合成二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用中性al2o3的短柱過濾除去未反應(yīng)的nan3，60°c油浴減壓條件下除去溶劑dmf。隨后，用ch2cl2溶解粗產(chǎn)物，用ph10.0的pb緩沖溶液萃取提純產(chǎn)物，每個水層繼續(xù)用20ml的ch2cl2萃取，最終將有機相收集并用無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并真空干燥得到棕色的產(chǎn)物n3-a-peg-a-n3；

(ⅳ)兩端炔基封端的聚乙二醇交替共聚物poly(ss-alt-a)的純化：反應(yīng)結(jié)束后，用dmf透析48h后，置于60℃油浴中，減壓除去dmf。然后用150mlch2cl2重新溶解，用飽和nacl水溶液進(jìn)行萃取，除去銅鹽。有機層用無水na2so4干燥4h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再在乙醚中沉淀3次，將沉淀物收集并真空干燥，最終得到粘性產(chǎn)物poly(ss-alt-a)；

(ⅴ)制備雙重響應(yīng)的阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox的純化：反應(yīng)結(jié)束后，采用去離子水透析72h，將透析袋中所得到的紅色透明液體冷凍干燥，得到紅色粘性固體產(chǎn)物dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox。

本發(fā)明公開的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)-hyd-dox可以在水溶液中自組裝形成前藥膠束，疏水性藥物阿霉素形成膠束的核；親水性peg鏈段形成膠束的外殼，起到穩(wěn)定膠束的作用。而疏水性內(nèi)核和親水性peg鏈段之間含有還原響應(yīng)的二硫鍵和酸敏感的縮醛及酰腙鍵基團(tuán)，在還原和ph條件下，敏感基團(tuán)發(fā)生斷裂，膠束被破壞，從而快速地釋放出聚集在膠束內(nèi)部的疏水性抗癌藥物。因此，本發(fā)明同時請求保護(hù)上述還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥在制備刺激響應(yīng)性抗癌納米藥物中的應(yīng)用。

由于上述方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用生物相容性良好的聚乙二醇和疏水性抗癌藥物阿霉素分別作為親水性鏈段和疏水性末端，以在還原條件下和酸性條件下可發(fā)生水解的基團(tuán)作為敏感性連接基團(tuán)，制備了具有良好生物相容性的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥；與原藥阿霉素相比，前藥具有良好的水溶性和貯存穩(wěn)定性，在腫瘤細(xì)胞環(huán)境中易于分解，加速藥物釋放，大大增加了其應(yīng)用價值。

2、本發(fā)明獲得的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥在水中可自組裝形成穩(wěn)定的聚合物前藥膠束。疏水性的阿霉素部分聚集形成膠束內(nèi)核，親水性peg鏈段作為膠束外殼起到穩(wěn)定膠束、提高膠束血液循環(huán)時間的作用。親水部分和疏水部分通過在酸性條件下可裂解化學(xué)鍵相連，同時親水的peg鏈段內(nèi)部含有在還原條件下和酸性條件下可發(fā)生水解的基團(tuán)；當(dāng)前藥膠束到達(dá)腫瘤或病變組織時，由于這些組織微環(huán)境的ph值降低，會使酸敏感基團(tuán)發(fā)生斷裂，同時在高的谷胱甘肽的環(huán)境中，還原敏感基團(tuán)也發(fā)生斷裂，導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)被破壞，從而快速釋放出抗癌藥物，增加了藥物的利用率和靶向性，在癌癥的治療方面，具有潛在的應(yīng)用價值。

3、本發(fā)明提供的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥結(jié)構(gòu)明確，合成條件不苛刻，具有以下顯著特點：(1)所用原料和試劑容易獲得；(2)反應(yīng)條件簡單；(3)產(chǎn)率高；(4)立體選擇性好；(5)產(chǎn)物分離簡便；(6)產(chǎn)物穩(wěn)定性好；制備容易，提純方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實施例一中阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代二甲亞砜；

圖2為實施例二中3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿；

圖3為實施例三中cl-a-peg21-a-cl和n3-a-peg21-a-n3的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿，其中，下標(biāo)21代表-ch2ch2o-的重復(fù)單元數(shù)；

圖4為實施例四中聚合物poly(ss-alt-a)3.6的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿，其中，下標(biāo)3.6代表交替共聚物的聚合度；

圖5為實施例五中dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿；

圖6為實施例一～五中ho-peg21-oh,cl-a-peg21-a-cl,n3-a-peg21-a-n3,poly(ss-alt-a)3.6,n3-hyd-dox×hcl和dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的紅外光譜圖；

圖7為實施例五中dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的在ph7.4緩沖溶液中自組裝形成的膠束的動態(tài)光散射曲線和透射電鏡照片圖；

圖8為實施例五中dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox形成的聚合物前藥膠束與裸藥阿霉素在不同ph值的緩沖溶液中的藥物釋放曲線圖；

圖9為dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox前藥與裸藥阿霉素的抑制腫瘤細(xì)胞增殖性能測試圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實施例一：阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）的合成

阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）主要通過三個步驟制備而成。第一步，制備6-疊氮己酸甲酯；第二步，制備6-疊氮己酰肼；第三步，對阿霉素鹽酸鹽（dox×hcl）進(jìn)行修飾得到阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl），具體合成方法如下：

合成小分子化合物6-疊氮己酸甲酯。將事先放置于120°c烘箱的裝置取出，放入保干器中，待其冷卻至室溫，取出使用。分別稱取6-溴己酸甲酯（3.54g，16.93mmol）和疊氮化鈉（nan3）（2.75g，42.33mmol），并用20ml的dmf溶解在50ml的圓底燒瓶中，在60°c冷凝水回流條件下反應(yīng)12h后結(jié)束。用中性三氧化二鋁（al2o3）的短柱過濾反應(yīng)液，除去未反應(yīng)的nan3，并用油泵減壓除去溶劑dmf。隨后，用大量的二氯甲烷（ch2cl2）溶解粗產(chǎn)物，用30ml的二次水萃取三次，將有機相收集并用無水硫酸鈉（na2so4）干燥4h。最后，用棉花過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥24h，得到無色的液體產(chǎn)物6-疊氮己酸甲酯（2.47g，產(chǎn)率：53.2%）；

在圓底燒瓶中加入已得到的6-疊氮己酸甲酯（0.76g，4.44mmol）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的水合肼（5.60g，111.1mmol），采用四氫呋喃（thf）作為溶劑。同樣，在80°c油浴并裝有蛇形冷凝管的裝置中，回流反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去thf，用ch2cl2溶解。在分液漏斗中，采用飽和氯化鈉水溶液萃取粗產(chǎn)物。將有機相用無水na2so4干燥4h，除去溶劑后真空干燥，最終收集到產(chǎn)物6-疊氮己酰肼（0.55g，產(chǎn)率：56.2%）；

分別稱取6-疊氮己酰肼（102.0mg，0.60mmol），dox×hcl（115.9mg，0.20mmol）和無水na2so4（103mg，0.73mmol）加入帶有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，用30ml的無水甲醇溶解。隨后加入3滴冰醋酸，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，?5°c油浴中避光反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用棉花過濾，除去反應(yīng)液中的na2so4，除去溶劑后在冰乙醚中沉淀三次。最終，采用離心法得到下面的沉淀物，將其放置在真空干燥箱中干燥24h，得到紅色粉末狀的產(chǎn)物，即為n3-hyd-dox×hcl（93.5mg，產(chǎn)率：62.4%）。

實施例二：炔基封端的3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）的合成

首先，以3,3’-二硫代二丙酸與3-丁炔-1-醇為原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽為活化劑，4-二甲氨基吡啶為催化劑，二氯甲烷為溶劑，通過酯化反應(yīng)，獲得3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯。具體合成方法如下：

將所用玻璃儀器置于120°c烘箱中烘干4h，取出放在保干器中冷卻至室溫待用。首先，向三頸燒瓶中依次加入3,3’-二硫代二丙酸（3.66g，17.40mmol）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（edc×hcl）（8.67g，45.23mmol）和4-二甲氨基吡啶（dmap）（3.19g，2.61mmol），用100ml的ch2cl2溶解；其次，將3-丁炔-1-醇（3.17g，45.23mmol）和15ml的ch2cl2加入恒壓滴液漏斗中。在冰水浴中滴加2h，滴加結(jié)束后，將裝置移到25°c的油浴中，繼續(xù)反應(yīng)48h；

反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去少量溶劑，濾紙過濾除去反應(yīng)生成的鹽，再用150ml的ch2cl2溶解，用1mhcl溶液和飽和氯化鈉（nacl）水溶液的混合溶液萃取2次，收集的水層用30ml的ch2cl2萃取3次。將有機層收集后，用無水na2so4干燥4h，除去溶劑后的粗產(chǎn)物繼續(xù)采用柱層析法進(jìn)行分離提純，淋洗劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液（乙酸乙酯：石油醚=1：6）。最終產(chǎn)物被收集，真空干燥24h后即得到較純的3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯b-ss-b（3.63g，產(chǎn)率：59.4%）。

實施例三：疊氮基封端的二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg21-a-n3）的合成

疊氮基封端的化合物二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg21-a-n3），通過兩步反應(yīng)得到：首先，合成二氯乙基二縮醛基聚乙二醇（cl-a-peg21-a-cl）；其次，合成二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg21-a-n3）。具體合成方法如下：

第一步，合成二氯乙基二縮醛基聚乙二醇（cl-a-peg21-a-cl）。取分子量為1000的聚乙二醇（ho-peg22-oh）（6.01g，6.01mmol）和對甲苯磺酸吡啶鎓（ppts）（0.30g，1.20mmol）置于100ml的支管燒瓶中，并加入50ml的甲苯，采用兩次常壓甲苯共沸的方法除去雜質(zhì)水。待其冷卻后，在氮氣保護(hù)下，加入30ml干燥的ch2cl2溶解，并在恒壓滴液漏斗中加入10ml的ch2cl2和2-氯乙基乙烯基醚（ceve）（3.20g，30.05mmol），冰水浴滴加完后，室溫下繼續(xù)反應(yīng)1h，加入10ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的碳酸鈉（na2co3）水溶液終止反應(yīng)；

產(chǎn)物的提純采用萃取和沉淀相結(jié)合的方法。先用ch2cl2稀釋反應(yīng)液，用10ml磷酸緩沖溶液（pbs，ph10.0)和飽和nacl水溶液的混合溶液萃取，得到的水層繼續(xù)用ch2cl2萃取三次。有機層用無水na2so4干燥4h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去ch2cl2溶劑。然后，將其在正己烷中沉淀三次，收集沉淀物并真空干燥，得到產(chǎn)物cl-a-peg21-a-cl（5.75g，產(chǎn)率：78.9%）；

第二步，合成二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg21-a-n3）。將上步得到的cl-a-peg-a-cl（2.37g，1.95mmol）和nan3（0.76g，11.70mmol）溶解在25ml的dmf中，60°c油浴下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，用中性al2o3的短柱過濾除去未反應(yīng)的nan3，置于60℃油浴中，減壓除去dmf。隨后，用ch2cl2溶解粗產(chǎn)物，用ph10.0的pb緩沖溶液萃取提純產(chǎn)物，收集的水層用20ml的ch2cl2萃取。最終將有機相收集，并用無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥得到棕色的產(chǎn)物n3-a-peg21-a-n3（1.68g，產(chǎn)率：63.9%）。

實施例四：炔基封端的聚合物poly(ss-alt-a)n的合成

在氮氣保護(hù)下，將3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）與二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg21-a-n3）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，制備炔基封端的聚合物poly(ss-alt-a)n。具體合成方法如下：

在氮氣的保護(hù)下，向含有10ml的dmf的支管燒瓶中加入cubr（0.085g，0.59mmol）和五甲基二乙烯三胺（pmdeta）（0.102g，0.59mmol），攪拌使兩者進(jìn)行絡(luò)合，隨后依次加入已合成的b-ss-b（0.25g，0.79mmol）和n3-a-peg21-a-n3（0.97g，0.79mmol）。抽充氣三次后，裝置在氮氣保護(hù)下密封好置于50°c油浴中反應(yīng)48h，隨后，補加10mol%的b-ss-b繼續(xù)反應(yīng)24h，以確保兩端為丁炔基。粗產(chǎn)物用dmf進(jìn)行透析（透析袋截留分子量為3500da），每隔一段時間換新的透析液。48h后，60°c油泵減壓除去dmf。然后用150ml的ch2cl2重新溶解，加入飽和nacl水溶液除去銅鹽。分離得到的有機層用無水na2so4干燥4h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再在乙醚溶液中沉淀3次，將沉淀物收集并真空干燥，最終得到粘性產(chǎn)物poly(ss-alt-a)n（0.74g，產(chǎn)率：60.7%）。

實施例五：雙重響應(yīng)的阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)n-hyd-dox的合成

利用脫鹽處理的阿霉素衍生物與聚合物poly(ss-alt-a)n發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，獲得還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)n-hyd-dox。具體合成方法如下：

首先，對阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）進(jìn)行脫鹽酸處理。在圓底燒瓶中，加入n3-hyd-dox×hcl（0.095g，0.13mmol），用3mldmso溶解，并加入10ml三乙胺（tea）攪拌2h，靜置后吸走上清液再加入新的tea溶液繼續(xù)攪拌，如此重復(fù)2次，最后留取dmso層的樣品待用。在支管燒瓶中，通氮氣的狀態(tài)下，先加入cubr（0.015g，0.104mmol）和pmdeta（0.018g，0.104mmol），用5mldmf溶劑溶解并攪拌5min，再依次向瓶中加入poly(ss-alt-a)n（0.23g，0.052mmol）和上述脫去鹽酸鹽的n3-hyd-dox的溶液，抽充氣三次后，將瓶子密封置于50°c油浴中反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液移到截留分子量為5000da的透析袋中，采用去離子水進(jìn)行透析，每隔4h后換一次去離子水。透析72h后，將透析袋中溶液取出，在冰箱中冷凍后置于凍干機中凍干，最后得到紅色粘性固體產(chǎn)物dox-hyd-poly(ss-alt-a)n-hyd-dox（0.26g，產(chǎn)率：84.2%）。

分別利用核磁共振氫譜（¹hnmr）和紅外光譜（ft-ir）驗證所得小分子化合物、聚合物以及基于聚乙二醇的還原/ph雙重響應(yīng)性阿霉素前藥的結(jié)構(gòu)。附圖1為阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）的核磁共振氫譜圖、附圖2為聚合物3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯的核磁共振氫譜圖、附圖3為cl-a-peg21-a-cl和n3-a-peg21-a-n3的核磁共振氫譜圖、附圖4為聚合物poly(ss-alt-a)3.6的核磁共振氫譜圖、附圖5為dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的核磁共振氫譜圖、附圖6為ho-peg21-oh,cl-a-peg21-a-cl,n3-a-peg21-a-n3,poly(ss-alt-a)3.6,dox-hyd-n3和dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的紅外光譜圖。結(jié)合附圖1、2、3、4、5、6可以證明反應(yīng)產(chǎn)物符合實驗設(shè)計。

實施例六：采用透析法制備聚合物前藥膠束

取聚合物前藥（dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox）25mg溶解在2ml的dmf中，攪拌2h后，用微量注射器以2mlh^-1的速度向溶液中滴加20ml的去離子水，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2h。隨后，將溶液裝入截留分子量為5000da的透析袋中，用去離子水透析24h后，將溶液取出并定容至25ml，最終得到濃度為1mgml^-1的膠束溶液。附圖7為dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox在水中自組裝形成的膠束的透射電鏡照片（a）和動態(tài)光散射曲線（b）；如：附圖7（a）所示為聚合物前藥在水溶液中自組裝形成球形膠束的形貌；附圖7（b）所示為對應(yīng)膠束粒徑的動態(tài)光散射測試曲線圖，可以看出聚合物前藥膠束平均粒徑為48nm。

實施例七：聚合物前藥的體外藥物釋放測試

取4ml預(yù)先制備好的膠束溶液（膠束濃度為1mgml^-1）置于截留分子量為7000da的透析袋中，兩端封好置于50ml的大離心管中，隨后，向相應(yīng)的離心管中分別加入30ml不同的緩沖溶液。緩沖溶液分為四種：（1）磷酸緩沖液（ph7.4，10mm）；（2）含有10mm的gsh的磷酸緩沖液（ph7.4，10mm）；（3）醋酸緩沖液（ph5.0，10mm）；（4）含有10mm的gsh的醋酸緩沖液（ph5.0，10mm）。然后，將大離心管置于37.5°c的恒溫振蕩儀中，以160r/min速度進(jìn)行振蕩。在設(shè)定的時間點，依次取出5ml的釋放液并補加相應(yīng)的緩沖溶液。每組實驗進(jìn)行3個平衡實驗，最后取平均值。取出的釋放液用熒光分光光度計對dox濃度進(jìn)行測定。載有阿霉素的聚合物膠束在不同的還原和ph條件下的釋放曲線如附圖8所示，在ph5.0或者在含有10mm的gsh的磷酸緩沖液中，藥物釋放速率明顯快于正常生理條件下；同時，在含有10mm的gsh的ph5.0緩沖溶液中藥物累計釋放率最大。藥物釋放說明該聚合物前藥膠束具有明顯的還原和ph雙重響應(yīng)性，可以達(dá)到控制釋放的目的。

實施例八：聚合物前藥膠束抑制腫瘤細(xì)胞增殖性能測試

分別將人子宮頸癌細(xì)胞(helacells)和人肝癌細(xì)胞（hepg2cells）培養(yǎng)在補充有10%胎牛血清(fbs)的dmem培養(yǎng)基中，置于37℃，5%co2(相對濕度為90%)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。選擇處在生長活躍期的細(xì)胞接種于每孔含有100μldmem培養(yǎng)基的96孔板中，培養(yǎng)24h。用透析法配置聚合物前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox的膠束母液（阿霉素濃度為94mgl^-1），將一系列不同濃度的膠束溶液加入到96孔板中，分別繼續(xù)培養(yǎng)48h和72h。接著加入25μl的mtt試劑，進(jìn)一步培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀(bio-radmodel680)在570nm下測量對應(yīng)的吸光度。細(xì)胞存活率的計算方法為：細(xì)胞存活率(cellviability)(%)=[a]test/[a]control×100%，其中，[a]test為dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox聚合物前藥膠束存在下測得的吸光度，而[a]control為不含聚合物前藥的情況下測得的吸光度。每個樣品測試三次，取其平均值。如附圖9所示，（a）和（b）分別為與hela細(xì)胞培養(yǎng)48h和72h后細(xì)胞的存活率；（c）和（d）分別為與hepg2細(xì)胞培養(yǎng)48h和72h后細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示：與抗癌藥物阿霉素相比，所合成的聚合物前藥具有良好的抑制hela細(xì)胞和hepg2細(xì)胞增殖的能力。

本發(fā)明首先制備阿霉素衍生物（n3-hyd-dox×hcl）；再分別制備炔基封端的小分子化合物3,3’-二硫二炔丁基二丙酸酯（b-ss-b）和疊氮基封端的化合物二疊氮乙基二縮醛基聚乙二醇（n3-a-peg-a-n3）；然后，通過聚合反應(yīng)制備含有縮醛鍵和二硫鍵的聚合物poly(ss-alt-a)；最后，再通過反應(yīng)將阿霉素連接在聚合物兩端，獲得具有還原和ph雙重響應(yīng)的阿霉素前藥dox-hyd-poly(ss-alt-a)3.6-hyd-dox，更換本發(fā)明限定的其他催化劑以及配體同樣可以得到產(chǎn)物，更換聚乙二醇的分子量以及本發(fā)明限定的原料比例，可以得到不同m值n值的產(chǎn)物；本發(fā)明限定的具有刺激響應(yīng)性聚合物前藥在水溶液中可以組裝成前藥膠束并穩(wěn)定存在，而在酸性或者是還原條件下，敏感性基團(tuán)或鏈段會發(fā)生斷裂使膠束被破壞，從而可以將聚集在膠束內(nèi)部的藥物快速地釋放出來，用于治療，取得了如實施例記載的技術(shù)效果。