本發(fā)明涉及一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復(fù)合物作為非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的應(yīng)用方法，特別涉及一種聚乙二醇和葉酸修飾的聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染及免疫安全性研究的應(yīng)用方法，屬于功能化高分子納米材料基因轉(zhuǎn)染載體技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基因治療是指通過基因水平的操作而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的方法。目前，基因治療主要是針對嚴(yán)重威脅人類健康的疾病進(jìn)行治療，癌癥是其主要應(yīng)用領(lǐng)域?；蛑委熂夹g(shù)如今發(fā)展迅速，部分基因治療方案已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。在臨床試驗時，發(fā)現(xiàn)了很多安全隱患，比如其安全性、靶向性、轉(zhuǎn)移效率較低等問題尚未解決。

目前，在基因載體系統(tǒng)中主要分為兩部分，病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體由于其高效的轉(zhuǎn)染效率從而應(yīng)用于臨床上的基因治療。但是由于其體積小，所以運(yùn)載基因的數(shù)量有限，而且容易產(chǎn)生基因突變和免疫原性。然而，非病毒載體的生物安全性好，免疫原性低。其與脂質(zhì)體、多聚物和dna復(fù)合物等產(chǎn)品的相繼出現(xiàn)，促使非病毒載體在基因治療中的廣泛應(yīng)用。

非病毒載體系統(tǒng)中，樹狀大分子能作為一種理想的納米材料應(yīng)用于基因傳遞系統(tǒng)。其區(qū)別于傳統(tǒng)的線性聚合物類納米材料，具有獨特的高度支化三維立體結(jié)構(gòu)，有良好的單分散性。樹狀大分子經(jīng)過各種表面化修飾，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，產(chǎn)生了不同的理化性質(zhì)。研究表明，第五代樹狀大分子有一定的細(xì)胞毒性，但是與納米金顆粒形成復(fù)合物[shany.，luot.，pengc.，etal.，genedeliveryusingdendrimer-entrappedgoldnanoparticlesasnonviralvectors[j].biomaterials，2012，33(10)：p.3025-3035.]會降低載體的毒性。xiao等[xiaot.，houw.，caox.，etal.，dendrimer-entrappedgoldnanoparticlesmodifiedwithfolicacidfortargetedgenedeliveryapplications.biomaterialsscience，2013，1(11)：p.1172.]將葉酸修飾到第五代樹狀大分子(pamam)表面，與基因在特定比例下產(chǎn)生了更高的基因轉(zhuǎn)染效率。

從分子生物學(xué)角度分析基因轉(zhuǎn)染的免疫安全性，其中實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)是基因轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因表達(dá)量的重要檢測手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)一般采用2^-△△ct法，計算實驗組與對照組中基因的相對表達(dá)量。公式是△△ct＝(ct目的基因-ct對照基因)實驗組-(ct目的基因-ct對照基因)對照組，ct值是熒光信號達(dá)到閾值時的體系循環(huán)數(shù)目。

檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明：聚乙二醇和葉酸共同修飾聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為基因載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，運(yùn)用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)對基因轉(zhuǎn)染后的免疫安全性檢測尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復(fù)合物作為非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的應(yīng)用方法，得到的復(fù)合物能具有良好生物相容性、細(xì)胞免疫安全性以及高效基因轉(zhuǎn)染效率，在惡性腫瘤的基因治療等方面有較好的應(yīng)用前景。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復(fù)合物作為非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的應(yīng)用方法，其特征在于，所述樹狀大分子的表面是氨基末端，對其進(jìn)行化學(xué)修飾可降低其毒性并提高轉(zhuǎn)染效率；其末端連接靶向基團(tuán)包括葉酸，rgd，透明質(zhì)酸，能高效地進(jìn)行基因傳遞。

優(yōu)選地，所述化學(xué)修飾的方法為修飾聚乙二醇、修飾環(huán)糊精、乙?；屯榛姆椒ㄖ械娜我庖环N或幾種。

優(yōu)選地，所述復(fù)合物中au與g5.nh2摩爾比為25∶1及以上。

更優(yōu)選地，所述復(fù)合物中au與g5.nh2摩爾比為25∶1、50∶1、75∶1或100∶1。

優(yōu)選地，所述復(fù)合物在基因轉(zhuǎn)染體系中的濃度為1.0～2.0mg/ml。

優(yōu)選地，所述基因傳遞的傳遞外源治療基因包括pdna，cpgdna，反義核苷酸，sirna及ssdna中的任意一種或幾種。

更優(yōu)選地，所述基因傳遞的外源治療基因的目標(biāo)細(xì)胞包括癌細(xì)胞及體細(xì)胞。

更優(yōu)選地，所述癌細(xì)胞包括hela，u87及a549；所述體細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞，t淋巴細(xì)胞，b淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞。

更優(yōu)選地，所述復(fù)合物與dna的n/p比為0.5∶1及以上。

更優(yōu)選地，所述復(fù)合物與dna的n/p比為0.5∶1、1∶1、2.5∶1、5∶1或7∶1。

更優(yōu)選地，所述pdna是從大腸桿菌(e.colidh5α菌株)中提取的，質(zhì)粒為攜帶卡那霉素抗性基因并帶有綠色熒光蛋白報告基因的質(zhì)粒；所述cpgdna是由人工合成，序列為5’-tccatgacgttcctgatgct-3’。

優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染時間為4～12h。

優(yōu)選地，所述聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復(fù)合物的制備方法包括以下具體步驟：

步驟1)：{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}的合成：將mpeg(相對分子質(zhì)量為2000)溶解于dmso中，edc與mpeg按照摩爾比10∶1的比例均勻混合，反應(yīng)30-40min，再加入與edc等比例的nhs反應(yīng)3-4h；將活化好的mpeg與g5.nh2的dmso溶液按照摩爾比10∶1的比例混合72-84h；在上述反應(yīng)的產(chǎn)物中按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50的量加入氯金酸haucl4反應(yīng)30min；然后加入nabh4使其還原，攪拌條件下反應(yīng)3-4h；將反應(yīng)液透析3-4天，最后經(jīng)冷凍干燥得到樣品{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，記作s1；

步驟2)：{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}的合成：將fa和edc按照摩爾比1∶0.9比例均勻混合，反應(yīng)30-40min，再加入與edc等比例的nhs反應(yīng)3-4h；將peg與活化好的fa按照摩爾比1∶2比例加入到g5.nh2中，避光攪拌72-84h；再按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50加入haucl4反應(yīng)30min，再迅速加入5倍量的nabh4使其還原，避光條件下攪拌3-4h；將反應(yīng)液透析3-4天，最后經(jīng)過冷凍干燥得到樣品2{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，記作s2；其中haucl4溶液的濃度為30.15mg/ml；nabh4溶液的濃度為10mg/ml；edc濃度為9.7mg/ml；nhs濃度為5.05mg/ml；mpeg的濃度為4mg/ml；g5.nh2溶液的濃度為0.44μmol/ml，fa濃度為2mg/ml。

更優(yōu)選地，所述步驟1)與步驟2)合成的兩種樣品作為載體應(yīng)用于hela的基因轉(zhuǎn)染的方法是按照聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復(fù)合物與pdna按照不同的n/p(樹狀大分子的伯氨基與pdna分子中的磷酸基團(tuán)摩爾比)分別為1∶1、2.5∶1、5∶1制備載體與pdna的復(fù)合物；在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)hela細(xì)胞，再加入前述三種n/p比的復(fù)合物/pdna復(fù)合體在細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)染4h。

優(yōu)選地，采用實時熒光定量pcr儀或酶聯(lián)免疫吸附法測定基因轉(zhuǎn)染后的復(fù)合物或復(fù)合物與dna刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的相對表達(dá)量。

更優(yōu)選地，所述實時熒光定量pcr儀中pcr擴(kuò)增的細(xì)胞因子為ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-1β、il-6、il-10、tnf-α和il-12中的任意一種或幾種細(xì)胞因子。

更優(yōu)選地，所述復(fù)合物在raw264.7(巨噬細(xì)胞)中基因轉(zhuǎn)染4h后進(jìn)行細(xì)胞因子il-6和tnf-α細(xì)胞因子檢測，步驟1)與步驟2)制備的兩種樣品分別與pdna和cpgdna復(fù)合物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，運(yùn)用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr檢測raw264.7的細(xì)胞因子tnf-α和il-6的基因表達(dá)水平，用以檢測基因轉(zhuǎn)染是否引起細(xì)胞免疫反應(yīng)。

更優(yōu)選地，所述檢測基因轉(zhuǎn)染是否引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的具體步驟如下：

步驟a)：巨噬細(xì)胞總核酸的提?。阂悦?×10⁶個巨噬細(xì)胞種到6孔板中，向每孔加入復(fù)合物或復(fù)合物/dna復(fù)合體轉(zhuǎn)染4h后，分別加入totalrnaextractor1ml；裂解的樣品在室溫下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后放置3min，然后在12000rpm條件下離心10min；取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，混勻放置20min；在12000rpm條件下離心10min，移除上清液；再加入1ml75％的乙醇洗滌沉淀，在12000rpm離心3min，移除上清液；最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液；

步驟b)：制備反轉(zhuǎn)錄樣品：參照市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將以下試劑加入冰浴的pcr管：1μlrna模板，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o10μl，輕輕混勻后離心5s；反應(yīng)混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s；將pcr管冰浴，再加入試劑4μl的5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5μl核糖核酸酶抑制劑和1μl逆轉(zhuǎn)錄酶；再輕輕混勻后離心3～5s；在pcr儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25℃孵育10min，50℃反應(yīng)30min進(jìn)行cdna合成，85℃反應(yīng)5min進(jìn)行終止反應(yīng)，得到反轉(zhuǎn)錄樣品；

步驟c)：pcr擴(kuò)增：在冰浴條件下加入如下反應(yīng)混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀釋至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl；在95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s，62℃退火及延伸32s，反應(yīng)40個循環(huán)；最后儀器分析出擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線和溶解曲線。

本發(fā)明以兩種聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復(fù)合物為載體，攜帶質(zhì)粒dna對hela細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。通過核磁、紫外吸收測定、透射電子顯微鏡對復(fù)合物的物理化學(xué)特征進(jìn)行表征；利用末端氨基定量試劑盒測定載體的末端氨基數(shù)目；cck-8檢測載體與pdna復(fù)合物的細(xì)胞毒性；瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)確定載體完全結(jié)合基因的氮磷比；通過表面電勢與水動力學(xué)粒徑對載體與pdna復(fù)合物的電勢和粒徑進(jìn)行了分析；綠色熒光蛋白的表達(dá)用來研究載體傳遞質(zhì)粒dna的效率；流式細(xì)胞技術(shù)及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)用來研究載體與基因復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞效率和細(xì)胞定位；利用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測載體與基因復(fù)合物的免疫原性。本發(fā)明將mpeg與g5pamam表面氨基基團(tuán)共價結(jié)合，可以通過中和其部分表面氨基以降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性，并提高復(fù)合物的生物相容性。通過連接上葉酸，可以使復(fù)合物具有靶向性，提高了基因轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明制備的聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復(fù)合物具有良好的基因轉(zhuǎn)染效果；轉(zhuǎn)染過程易于操作，生物相容性好，免疫原性低，為非病毒基因載體在基因傳遞上的應(yīng)用提供參考。

附圖說明

圖1為實施例2中的復(fù)合物的核磁圖譜；

圖2為實施例3中的復(fù)合物的紫外吸收圖譜；

圖3為實施例4中的復(fù)合物的透射電子顯微鏡圖及平均粒徑尺寸圖。3a為復(fù)合物s1(左上)和s2(左下)的透射電子顯微鏡圖片；3b為復(fù)合物s1(右上)和s2(右下)的平均粒徑尺寸圖；

圖4為實施例6中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體的hela細(xì)胞毒性檢測圖；

圖5為實施例7中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

圖6為實施例8中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體的表面電勢圖；

圖7為實施例8中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體的水動力學(xué)粒徑圖；

圖8為實施例9中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對hela細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)檢測圖；

圖9為實施例10中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對hela細(xì)胞的細(xì)胞吞噬效率圖；

圖10為實施例11中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對hela細(xì)胞的胞內(nèi)定位結(jié)果圖；

圖11為實施例12中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對raw264.7細(xì)胞毒性檢測圖；

圖12為實施例13中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對raw264.7免疫原性檢測標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線；

圖13為實施例13中的復(fù)合物/pdna復(fù)合體對raw264.7免疫原性檢測溶解曲線；

圖14為實施例13中的復(fù)合物對raw264.7細(xì)胞對raw264.7的免疫原性檢測圖；

圖15為實施例13中的復(fù)合物和復(fù)合物/pdna復(fù)合體對raw264.7細(xì)胞的免疫原性檢測圖；

圖16為實施例13中的復(fù)合物和復(fù)合物/cpgdna復(fù)合體對raw264.7細(xì)胞的免疫原性檢測圖；

圖17為實施例1中的復(fù)合物合成步驟示意圖，a為復(fù)合物s1的合成步驟，b為復(fù)合物s2的合成步驟。

具體實施方式

為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。

實施例1

稱取20.25mg的mpeg(分子量為2000)溶解于dmso中，9.59mgedc與mpeg溶液按照摩爾比10∶1的比例均勻混合，再加入5.25mgnhs反應(yīng)3h。將47.34mg的g5.nh2溶解于dmso溶液按照摩爾比10∶1的比例充分混合，反應(yīng)72h。在上述反應(yīng)的產(chǎn)物中按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50的量加入41.39mghaucl4反應(yīng)30min，再加入18.9mgnabh4攪拌條件下反應(yīng)3h。透析3天后經(jīng)冷凍干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，記錄為s1(如圖17a)。稱取11.26mg的fa，4.4mg的edc和2.64mg的nhs按照1∶0.9∶0.9比例均勻混合。將20.25mg的peg與活化好的fa按照摩爾比1∶2比例加入到47.34mg的g5.nh2中，避光攪拌72h。再加入haucl4反應(yīng)30min，迅速加入5倍量的nabh4使其還原，避光條件下攪拌3h。將反應(yīng)液透析3天，最后經(jīng)冷凍干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，記錄為s2(如圖17b)。

實施例2

分別稱取5mg的s1和s2分別溶于700ml的d2o中，對兩種溶液進(jìn)行超聲，然后使用核磁共振波譜儀測定兩種復(fù)合物的核磁氫譜。核磁結(jié)果如圖1所示，¹hnmr圖譜用于表征接到g5.nh2上的碳鏈的個數(shù)，g5.nh2特征基團(tuán)的質(zhì)子峰在化學(xué)位移2.0-3.5ppm之間，在3.4-3.6ppm之間出現(xiàn)的質(zhì)子吸收峰，說明mpeg被成功的連接到g5.nh2上，在6.6-8.5ppm之間出現(xiàn)的質(zhì)子吸收峰說明了fa被成功接到g5.nh2上。利用origin軟件計算出質(zhì)子峰的積分面積，得到平均每個g5.nh2表面連接大約10個mpeg，大約3.2個fa。結(jié)果表明按照預(yù)設(shè)的目標(biāo)合成了{(lán)(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}和{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}。

實施例3

將材料s1和材料s2分別溶解于超純水中，配制成濃度為200μg/ml溶液，利用紫外-可見分光光度計檢測在300nm-800nm波段范圍內(nèi)的紫外吸收值。紫外-可見分光光度檢測結(jié)果如圖2所示，復(fù)合物中g(shù)5.nh2在520nm處左右均有吸收峰，說明納米金顆粒被成功包裹。在280nm處有吸收峰說明fa成功接到了g5.nh2上。

實施例4

將配制好的s1和s2水溶液(1mg/ml)滴到有碳膜的銅網(wǎng)表面，置于室溫下干燥，制得樣品。然后采用jem-2010f型透射電子顯微鏡在200kv下檢測樣品(圖3a)。采用imagej軟件進(jìn)行測量并計算出樣品尺寸，s1的平均尺寸(圖3b)約2.9nm和s2的平均尺寸(圖3b)約3.1nm。圖中可看出制備的復(fù)合物呈球形，分散性較好。

實施例5

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1制備得到的兩種復(fù)合物末端氨基定氮檢測。將s1和s2分別溶解于水中配制成2mg/ml的溶液，再根據(jù)初級氨基檢測試劑盒(panopa)的實驗方法測定復(fù)合物的表面氨基數(shù)目。實驗步驟為：從試劑1中取一粒片狀藥品，用3ml超純水溶解，配成溶液1。對照組中取50μl超純水加入溶液1充分混勻，實驗組中取待測復(fù)合物s1或s250μl加入溶液1充分混勻，反應(yīng)3min后在吸光度為340nm處測量，分別記錄吸光度a0和a1；再分別加入100μl溶液2充分混勻并反應(yīng)15min，在吸光度為340nm處記錄數(shù)據(jù)a2和a3。根據(jù)公式計算出樣品中末端氨基氮的濃度(mg/l)。結(jié)果顯示，經(jīng)mpeg修飾后，末端氨基的數(shù)目為29.9。而在修飾mpeg再連接fa之后，末端氨基的數(shù)目為21.6，這可能是由于fa與氨基共價連接，從而減少pamam表面氨基的數(shù)目，以降低復(fù)合物的毒性。

實施例6

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1制備得到的兩種復(fù)合物/pdna復(fù)合體的細(xì)胞毒性檢測。培養(yǎng)瓶中處于指數(shù)生長期的hela細(xì)胞用胰酶消化后收集，以6×10³細(xì)胞每孔的密度將hela細(xì)胞種于96孔板中。在含有10％fbs的200μldmem培養(yǎng)基中在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，換成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同濃度復(fù)合物的培養(yǎng)基，再加入1μgpdna復(fù)合物繼續(xù)培養(yǎng)4h。將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450nm波長處各孔的吸光度。圖4結(jié)果顯示，隨著復(fù)合物的濃度增加，細(xì)胞活力逐漸降低。但是載體與pdna復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞存活率均在75％以上，表明兩種復(fù)合物/pdna復(fù)合體的細(xì)胞毒性很低，有利于后續(xù)實驗。

實施例7

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1制備得到的復(fù)合物與質(zhì)粒dna的結(jié)合能力一般采用瓊脂糖凝膠電泳實驗進(jìn)行測定。按照氮磷比為0.25，0.5，1，2.5，5，7制備載體與pdna復(fù)合物，單獨的pdna作為對照。稱取0.5g瓊脂糖加入至50mltris-硼酸電泳緩沖液(0.5×tbe)中混合。在微波爐中反復(fù)加熱三次，每次約1min，直至瓊脂糖溶解，且瓶中無氣泡。待瓶中溫度降低至50-60℃，往膠中加入4μl濃度為1mg/ml的溴化乙錠(eb)染料，搖勻倒入擺好梳子的膠槽內(nèi)，等待約15min后拔掉梳子，準(zhǔn)備上樣。將載體與pdna復(fù)合物與上樣緩沖液(6×loadingbuffer)混勻后分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，電壓80v，時間30min。跑膠結(jié)束后用凝膠成像儀分析pdna在凝膠中的遷移情況。在不同n/p條件下，每個泳道中條帶的分離狀況表示不同濃度的復(fù)合物包裹基因的能力，圖5是載體與pdna復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中顯示復(fù)合物/pdna復(fù)合體在n/p為2.5時觀察不到明顯的dna條帶，說明復(fù)合物/dna復(fù)合體沒有向正極移動，具有較強(qiáng)的包裹能力，能壓縮質(zhì)粒dna。

實施例8

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，將質(zhì)粒dna與實施例1的方法制備的復(fù)合物按照三種氮磷比為1∶1，2.5∶1，5∶1，分別與1μgpdna共孵育得到載體與pdna復(fù)合物。復(fù)合物s1和s2與pdna復(fù)合體作為實驗組，復(fù)合物s1和s2作為對照組。在室溫條件下孵育30min后加入1毫升pbs緩沖液，然后采用激光粒度儀(malvern，uk)測定復(fù)合物的水動力學(xué)粒徑和表面電勢。測試是以he-ne為激光源，激光波長是633nm，入射角為90°，測量溫度為25℃為實驗條件，對復(fù)合物進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，載體與pdna復(fù)合物的表面電勢(圖6)均為正，pdna的負(fù)電荷中和了復(fù)合物正電荷，正如圖中兩種載體與dna復(fù)合物的電勢分別小于兩種載體的電勢。隨著氮磷比的增加，復(fù)合物的表面電勢也有增加的趨勢，電勢范圍均在正常范圍內(nèi)，有利于復(fù)合物和細(xì)胞間相互作用，便于載體對目的基因的傳遞。載體與pdna復(fù)合物隨著氮磷比增加，相互作用增強(qiáng)，粒徑依次減小(圖7)。當(dāng)?shù)妆葹?.5時，粒徑范圍處于200nm與300nm之間，此時復(fù)合物容易進(jìn)入細(xì)胞，利于細(xì)胞內(nèi)基因傳遞。

實施例9

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1制備得到的復(fù)合物傳遞含有egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)基因的質(zhì)粒dna的效率檢測，熒光強(qiáng)度的大小反映出egfp基因的轉(zhuǎn)染效率。

在24孔板上種密度為3.5×10⁴hela細(xì)胞每孔，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，棄去舊培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。質(zhì)粒和復(fù)合物按照n/p為1，2.5，5條件下混合，室溫下避光放置20min，再加入孔板中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染4h。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。圖8是復(fù)合物與pdna復(fù)合體在hela細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá)檢測圖。結(jié)果顯示，s2在上述三種n/p條件下，綠色熒光蛋白的表達(dá)量都比s1多。說明連接葉酸的靶向機(jī)制能有效的提高復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染能力。在n/p為2.5時比n/p為5時細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，可能是由于n/p增大時，復(fù)合物與pdna的相互作用增大，從而導(dǎo)致pdna在細(xì)胞內(nèi)難從復(fù)合物中釋放出來，無法表達(dá)出相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物。當(dāng)連接fa時，綠色熒光蛋白表達(dá)量增多，可以初步推測是fa靶向作用的結(jié)果。

實施例10

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1的方法制備得到的復(fù)合物傳遞pdna的細(xì)胞內(nèi)吞效率。以5×10⁴hela細(xì)胞每孔的密度種于24孔板中，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h。在實施例8上述三個n/p條件下，按照每孔加1gcy3標(biāo)記的pdna和復(fù)合物進(jìn)行混合，室溫下避光放置20min，再加入孔板中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染4h，使載體與cy3-pdna復(fù)合物充分進(jìn)入細(xì)胞。然后，用1ml滅菌的pbs重新懸浮細(xì)胞，并將待檢測樣品放在冰上。每組設(shè)定三個平行實驗，用流式細(xì)胞儀對每個樣品進(jìn)行檢測。每次測定細(xì)胞數(shù)量為1×10⁴每管，檢測細(xì)胞釋放的紅色熒光，設(shè)定fsh-h/ssc-h為細(xì)胞門，設(shè)定fl2-h為cy3熒光通道，每組樣品重復(fù)測定三次。圖9是復(fù)合物與cy3標(biāo)記pdna復(fù)合體在hela細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)吞實驗，結(jié)果顯示在n/p為2.5條件下，cy3激發(fā)的紅色熒光信號強(qiáng)度最強(qiáng)。表明s1，s2在n/p為2.5時，顯示出良好的細(xì)胞內(nèi)吞效率。

實施例11

以宮頸癌細(xì)胞(hela)為模式細(xì)胞，實施例1的方法制備得到復(fù)合物s1，s2。通過胞內(nèi)的共定位實驗可以對audenps在作為基因轉(zhuǎn)染載體時在胞內(nèi)的傳遞途徑與胞內(nèi)定位情況進(jìn)行研究，用cy3染料特異性標(biāo)記pdna，與復(fù)合物形成復(fù)合體來轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，從而可以確定他們是否具有相同的胞內(nèi)傳遞途徑以及進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以后的去向。以1×10⁵細(xì)胞每個孔的密度種在12孔板上，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)24h。換成無血清培養(yǎng)基，加入復(fù)合物與pdna復(fù)合體，孵化4h。孵化后，將復(fù)合物與pdna復(fù)合體吸出，用無菌pbs洗2遍，加入2.5％的戊二醛，在4℃下固定30min，dapi染料標(biāo)記細(xì)胞核7min。然后用pbs清洗細(xì)胞三遍后，用激光共聚焦顯微鏡來觀察和記錄實驗結(jié)果。圖10是各復(fù)合物與cy3-pdna復(fù)合體在hela細(xì)胞中的細(xì)胞定位圖。結(jié)果顯示復(fù)合物與細(xì)胞經(jīng)過4h的基因轉(zhuǎn)染后，通過胞內(nèi)傳遞途徑將基因傳遞到細(xì)胞核周圍，尤其是在n/p條件為2.5條件下，s2與cy3標(biāo)記的pdna復(fù)合體大量集中在細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核周圍，表明修飾了peg和fa沒有影響復(fù)合物的生物學(xué)功能，還提高了基因轉(zhuǎn)染效率。整體上，s2比s1的細(xì)胞內(nèi)吞效率略高，與實施例10的結(jié)果一致。

實施例12

以巨噬細(xì)胞(raw264.7)為模式細(xì)胞，檢測實施例1制備得到的復(fù)合物與pdna形成的復(fù)合體的細(xì)胞毒性。以6×10³細(xì)胞每孔的密度將raw264.7細(xì)胞種于96孔板中，在含有10％fbs的200μldmem培養(yǎng)基中在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，換成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同濃度梯度復(fù)合物的新鮮培養(yǎng)基，再加入1μgpdna復(fù)合物繼續(xù)培養(yǎng)4h，每個梯度設(shè)定3個復(fù)孔。將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450nm波長處各孔的吸光度。圖11結(jié)果顯示，隨著復(fù)合物的濃度增加，細(xì)胞活力逐漸降低。整體上，復(fù)合物與pdna復(fù)合體在巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞存活率均在75％以上，表明復(fù)合物與pdna復(fù)合體的細(xì)胞毒性很低，有利于后續(xù)實驗。

實施例13

巨噬細(xì)胞培養(yǎng)到指數(shù)生長期，用胰酶消化后收集，計數(shù)器計數(shù)后以6×10⁵細(xì)胞個/孔的密度種到6孔板中，加入培養(yǎng)基dmem約2ml；按照預(yù)設(shè)的n/p值為2.5配制兩種復(fù)合物和dna的復(fù)合體。脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞作為陽性對照組。實驗步驟主要分為總rna提取、反轉(zhuǎn)錄、兩步法pcr擴(kuò)增反應(yīng)。具體包括：

(1)巨噬細(xì)胞總核酸的提?。阂悦?×10⁶個巨噬細(xì)胞種到6孔板中，向每孔加入復(fù)合物或復(fù)合物/dna復(fù)合體轉(zhuǎn)染4h后，分別加入totalrnaextractor1ml。裂解的樣品在室溫下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后放置3min，然后在12000rpm條件下離心10min。取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，混勻放置20min。在12000rpm條件下離心10min，移除上清液。再加入1ml75％的乙醇洗滌沉淀，在12000rpm離心3min，移除上清液。最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液。

(2)制備反轉(zhuǎn)錄樣品：將冰浴的pcr管中加入以下試劑：提取的rna，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o約10μl，輕輕混勻后離心5s。反應(yīng)混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s。將pcr管冰浴，再加入試劑4μl的5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5μl核糖核酸酶抑制劑和1μl逆轉(zhuǎn)錄酶。再輕輕混勻后離心3～5s。在pcr儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25℃孵育10min，50℃反應(yīng)30min進(jìn)行cdna合成，85℃反應(yīng)5min進(jìn)行終止反應(yīng)，得到反轉(zhuǎn)錄樣品。

(3)pcr擴(kuò)增：在冰浴條件下加入如下反應(yīng)混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀釋至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl。在95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s，62℃退火及延伸32s，反應(yīng)40個循環(huán)。最后用abi7500儀器對產(chǎn)物進(jìn)行分析，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律生成標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線(圖12)和溶解曲線(圖13)。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)規(guī)則的s型。三組溶解曲線分別檢測內(nèi)參gapdh，細(xì)胞因子il-6和tnf-α，每個溶解曲線呈現(xiàn)出一個峰且無雜峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物均一。結(jié)果采用△△ct法計算出實驗組與對照組的相對熒光強(qiáng)度。圖14是用qrt-pcr檢測復(fù)合物作用于免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子mrna表達(dá)量。未作處理的正常細(xì)胞作為對照組。兩種復(fù)合物與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr試劑盒采用兩步法反應(yīng)程序擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物。圖中結(jié)果表明單獨復(fù)合物不會引起免疫細(xì)胞分泌出以上兩種細(xì)胞因子，說明制備的復(fù)合物不會引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答，免疫安全性高。圖15是qrt-pcr檢測復(fù)合物與pdna復(fù)合體作用于巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子mrna表達(dá)量。巨噬細(xì)胞中加入pdna作為陰性對照組。在n/p為2.5條件下，復(fù)合物和pdna孵育4h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物，計算出相對熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明經(jīng)過質(zhì)粒dna基因轉(zhuǎn)染后，巨噬細(xì)胞也沒有產(chǎn)生細(xì)胞因子，說明復(fù)合物與pdna復(fù)合體的基因轉(zhuǎn)染過程免疫安全性高，免疫原性好。圖16是qrt-pcr檢測復(fù)合物與cpgdna復(fù)合體作用于巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子mrna表達(dá)量。巨噬細(xì)胞中加入cpgdna作為陰性對照組。復(fù)合物和cpgdna孵育4h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物。因為cpgdna是強(qiáng)免疫激活劑，所以與上述兩組實驗相比，相對熒光表達(dá)量高，進(jìn)一步說明復(fù)合物與pdna復(fù)合體基因轉(zhuǎn)染過程的免疫原性低，生物安全性高。