用于藥物遞送的修飾的聚(β-氨基酯)的制作方法
【專利說(shuō)明】用于藥物遞送的修飾的聚（β-氨基酯）
[0001] 本發(fā)明涉及適于用于活性劑的遞送的聚合物。本發(fā)明還涉及包含這些聚合物的納 米顆粒和它們的制備方法。
[0002] 缺乏遞送多核苷酸如DNA和RNA的安全和有效率的載體仍是基因治療成 功的主要障礙（Luo，D.&Saltzman，W.M.SyntheticDNAdiliverysystems.Nature Biotech. 18,33-37(2000)；KamimuraK.等人，AdvancesinGeneDeliverySystems. Pharmaceut.Med.25,293-306(2011);MieleE.等人，Nanoparticle-baseddeliveryof smallinterferingRNAchallengesforcancertherapy.Int.J.Nanomedicine7， 3637-3657(2012))。大多數(shù)用于多核苷酸遞送的方案使用病毒載體，其是高度有效率的遞 送系統(tǒng)。然而，病毒載體具有某些劣勢(shì)，包括安全風(fēng)險(xiǎn)、有限的攜帶多核苷酸的容量和大規(guī) 模生產(chǎn)的高成本。非病毒載體提供潛在的優(yōu)勢(shì)，包括高包裝容量、容易生產(chǎn)、低毒性和免疫 原性，但沒(méi)有病毒載體有效率（Mintzer，M.A.&Simanek，E.E.Nonviralvectorsforgene delivery.Chem.Rev. 109,259-302(2009))〇
[0003] 已經(jīng)描述了可生物降解的聚（β-氨基酯）（PBAE)作為潛在的非病毒多核苷酸 遞送載體，其能夠?qū)NA和RNA二者濃縮在分離的納米顆粒中（Green，J.J.等人Acc. ChemRes. 41,749-759(2008))。用伯胺在PBAE的末端進(jìn)行化學(xué)修飾（參見(jiàn)方案1)已經(jīng) 顯示產(chǎn)生比商用轉(zhuǎn)染劑如Lipofectamine2000,Fugene和聚乙稀亞胺（PEI)高的轉(zhuǎn)染效 率（Zugates，G.T.等人BioconjugateChem. 18,1887-1896 (2007) ;Green，J.J.等人Nano letters8,3126-3130(2008) ;W002/31025A2)。
[0005] 持續(xù)需要改善的無(wú)毒、可生物降解的、生物相容的、可以用于有效轉(zhuǎn)染多核苷酸 的、并且可以經(jīng)濟(jì)地制備的聚合物。這樣的聚合物將用于在基因治療中包裝和遞送DNA和 RNA和用于包裝和遞送其它診斷、治療和預(yù)防試劑。
[0006] 尤其是，存在對(duì)可以用于有效轉(zhuǎn)染在循環(huán)中具有差的穩(wěn)定性的短多核苷酸，特別 是siRNA和microRNA(miRNA)的聚合物的需求。已有的聚合多核苷酸遞送載體不能以高載 量包封siRNA和miRNA，原因是這些序列長(zhǎng)度較短。此外，很多已有的用于siRNA和miRNA 的聚合遞送載體有細(xì)胞毒性。
[0007] 本發(fā)明提供新型的末端修飾的PBAE，其可用于多種醫(yī)藥應(yīng)用，包括藥物遞送，特別 是用于遞送多核苷酸；組織改造和生物材料。本發(fā)明特別涉及PBAE的醫(yī)藥應(yīng)用。本發(fā)明還 提供本發(fā)明的末端修飾的聚合物與多核苷酸的復(fù)合物，包括本發(fā)明的聚合物的藥物遞送裝 置（例如，微粒，納米顆粒），制備末端修飾的聚合物的方法，和使用本發(fā)明的末端修飾的聚 合物的方法。
[0008] 這些系統(tǒng)的聚酯性質(zhì)由于其高的可生物降解性和降低的毒性，導(dǎo)致引人注目的生 物相容屬性。因此，這些聚合物作為非病毒多核苷酸遞送載體在很多疾病如癌癥、單成因疾 ?。╩onogeneticdiseases)、血管疾病和感染性疾病的治療中具有應(yīng)用。這些多核苷酸遞 送載體的另一種應(yīng)用是在體外研究中作為工具以研究基因功能或細(xì)胞和生理背景下的調(diào) To
[0009] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供式I的聚合物：
[0011] 其中[0012] LdPL2獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0013] 〇、S、NRx 和鍵；其中RJ蟲(chóng) 'S： 立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0014] L3獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：亞烷基、亞烯基、雜亞烷基、雜亞烯基、亞芳基 或雜亞芳基；
[0015] L4獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0016]
[0017] L5獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：亞烷基、亞烯基、雜亞烷基、雜亞烯基、亞芳基 或雜亞芳基；
[0018] 札和R2獨(dú)立地選自寡肽和Ry;
[0019] 其中札和1?2中的至少一個(gè)是寡肽；
[0020] 并且其中&選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷 基、雜環(huán)烷基、?；蓟螂s芳基；
[0021] 各個(gè)私獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜 烷基、雜環(huán)烷基、?；⒎蓟螂s芳基；和
[0022] η是5至10, 000的整數(shù)；
[0023] 或其藥用鹽。
[0024] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供式I的聚合物，其中
[0025]LdPL2獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0026]
0、S、NRX和鍵；其中RJ蟲(chóng)
立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0027]L3的至少一次出現(xiàn)是
[0028] 其中1\是
并且T2選自H、烷基或
[0029]
[0030] 其中LT獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0031] 〇、3、冊(cè)：(和鍵；其中1^獨(dú) 、. 立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0032] 其余的1^基團(tuán)在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：亞烷基、亞烯基、雜 亞烷基、雜亞烯基、亞芳基或雜亞芳基，其中
[0033]L4獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：
[0034]
[0035] L5獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：亞烷基，亞烯基，雜亞烷基，雜亞烯基，亞芳基 或雜亞芳基；
[0036] &、私和Rτ獨(dú)立地選自寡肽和Ry;
[0037] 其中&、私和RT中的至少一個(gè)是寡肽；
[0038] 并且其中&選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷 基、雜環(huán)烷基、?；⒎蓟螂s芳基；
[0039] 各個(gè)私獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜 烷基、雜環(huán)烷基、酰基、芳基或雜芳基；并且
[0040] η是5至10, 000的整數(shù)；
[0041] 或其藥用鹽。
[0042] 本發(fā)明因此提供末端被至少一種寡肽修飾的ΡΒΑΕ。這些ΡΒΑΕ用作多核苷酸的優(yōu) 良的濃縮劑和/或用作靶向配體以增強(qiáng)細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染效率。這些聚合物具有能夠改善多 核苷酸向細(xì)胞的遞送的可生物降解的基團(tuán)并且與已知的ΡΒΑΕ和商用轉(zhuǎn)染劑相比在體外顯 示出高的轉(zhuǎn)染效率和降低的細(xì)胞毒性。
[0043] 式I的聚合物可以通過(guò)將式II的二丙烯酸酯單體與式L4H2的取代的胺反應(yīng)以形 成丙烯酸酯封端的中間體式ΠΙ來(lái)制備。
[0044]
[0045] 隨后，可以通過(guò)與末端丙烯酸酯基團(tuán)的反應(yīng)來(lái)添加基團(tuán)RA和R2L2以形成式I的 聚合物。
[0046]
[0047] 在根據(jù)本發(fā)明的聚合物中，選擇各個(gè)LJPL2 (并且，在第二個(gè)方面中，LT)以促進(jìn)末 端修飾基團(tuán)&和1?2與PBAE聚合物的偶聯(lián)。例如在末端修飾基團(tuán)是包含末端半胱氨酸殘基 的寡肽的情況下，各個(gè)LdPL2 (并且，在第二個(gè)方面，LT)可以是鍵。
[0048] 在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，選擇LT以促進(jìn)末端修飾基團(tuán)1^與PBAE聚合物的偶聯(lián)。 例如在末端修飾基團(tuán)是包含末端半胱氨酸殘基的寡肽的情況下，LT可以是鍵。
[0049] 在根據(jù)本發(fā)明的聚合物中，Rx可以獨(dú)立地選自由以下各項(xiàng)組成的組：氫、烷基、環(huán) 烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基和雜環(huán)烷基，例如，選自由以下各項(xiàng)組成的組：氣、烷基和環(huán)燒 基。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明，"寡肽"包括通過(guò)肽鍵連接在一起的至少三個(gè)氨基酸的鏈。這種肽 優(yōu)選僅包含天然氨基酸，但是可以備選地使用本領(lǐng)域已知的非天然氨基酸（即，不天然存 在但可以并入多肽鏈中的化合物）和/或氨基酸類似物。此外，這種肽中的一個(gè)以上氨基 酸可以例如，通過(guò)添加化學(xué)實(shí)體如碳水化合物基團(tuán)、磷酸基、法呢基（farnesyl)、異法呢基 (isofarnesyl)、脂肪酸基、或用于綴合、官能化、或其它修飾的接頭等來(lái)修飾。本發(fā)明的聚 合物中的寡肽通常包含3至20個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選3至10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選3至6 個(gè)氨基酸殘基。備選地，本發(fā)明的聚合物中的寡肽可以包含4至20個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選 4至10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選4至6個(gè)氨基酸殘基。
[0051] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個(gè)寡肽在PH7具有凈正電荷。所 述寡肽或各個(gè)寡肽可以包含在PH7帶正電的天然存在的氨基酸，S卩，賴氨酸、精氨酸和組氨 酸。例如，所述或各個(gè)寡肽可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：聚賴氨酸，聚精氨酸或聚組氨酸， 其各自可以以半胱氨酸封端。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述或各個(gè)寡肽優(yōu)選為式IV的化合物：
[0053]
[0054] 其中p是2至19,通常3至9或3至5的整數(shù)，并且其中Ra在每次出現(xiàn)時(shí)選自由 以下各項(xiàng)組成的組：H2NC( =NH)-NH(CH2)3 -、H2N(CH2)4 -或（1H-咪唑-4-基）-CH2-。
[0055] 在所述寡肽或各個(gè)寡肽是式IV的化合物的情況下，將所述寡肽或各個(gè)寡肽與所 述聚合物連接的LdP/或L2 (和/或，在第二個(gè)方面，LT)是鍵并且末端半胱氨酸殘基提供 將所述寡肽或各個(gè)寡肽與丙烯酸酯封端的中間體式III偶聯(lián)的方式。硫醇官能度提供更 快、更有效且更容易控制的到雙鍵的添加。相反，在所述寡肽或各個(gè)寡肽終止于胺官能度以 用于偶聯(lián)時(shí)，在偶聯(lián)步驟中需要過(guò)量的這種化合物。
[0056] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個(gè)寡肽在pH7具有凈負(fù)電荷。所 述寡肽或各個(gè)寡肽可以包含在PH7帶負(fù)電的天然存在的氨基酸，S卩，天冬氨酸和谷氨酸。例 如，所述或各個(gè)寡肽可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：聚天冬氨酸和聚谷氨酸，其各自可以以 半胱氨酸封端。在該實(shí)施方案中，所述寡肽或各個(gè)寡肽可以是式IV的化合物，其中p是2 至19,通常3至9或3至5的整數(shù)，并且其中艮是HO2C(CH2)2 -或H02C-CH2 -。在該情況 下，將所述寡肽或各個(gè)寡肽與所述聚合物連接的LdP/或L2是鍵，同時(shí)末端半胱氨酸殘基 提供將所述寡肽或各個(gè)寡肽與丙烯酸酯封端的中間體式IV偶聯(lián)的方式。
[0057] 備選地，所述或各個(gè)寡肽可以包含在pH7帶負(fù)電的天然存在的氨基酸和在pH7帶 正電的天然存在的氨基酸的混合物。
[0058] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個(gè)寡肽是疏水的。所述寡肽或各 個(gè)寡肽可以包含疏水的天然存在的氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和丙氨酸；尤其是，所述或各個(gè)寡肽可以包含纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
[0059] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個(gè)寡肽是親水的。所述寡肽或各 個(gè)寡肽可以包含親水的天然存在的氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨 酰胺，并且還可以包含在PH7帶電的天然存在的氨基酸。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供式I的聚合物，其中&和R2二者都是寡肽，并且提 供式I的聚合物，其中&和R2中的一個(gè)是寡肽并且R:和R2中的一個(gè)是Ry。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，當(dāng)札和R2中的一個(gè)是1時(shí)，則Ry優(yōu)選選自由以下各項(xiàng) 組成的組：氫、-(CH丄NH2、- (CH2)^ΝΗΜθ、- (CH丄0H、- (CH2)"013、- (CH2) 2 (0CH2CH2)"順2、- (CH2) dOCHfHiOH和-(CHKOa^CHia^，其中m是1至20,例如1至5的整數(shù)。優(yōu)選地，心選 自由以下各項(xiàng)組成的組^(CH^NHy-(CH^NHMe和-(0^(0(??)^?。優(yōu)選地，當(dāng)1^是 NH或NRX，并且札和R2中的一個(gè)是R對(duì)，則Ry不同于R3。
[0062] 本發(fā)明的