墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。墨旱蓮提取物由中藥材墨旱蓮經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取等方法制備而成，墨旱蓮提取物得率10.01-15.05％，其中總皂苷含量在53.24-56.1％，旱蓮苷A含量為6.54-11.3％，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量1.46-3.56％。本發(fā)明所得到的中藥材墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化等醫(yī)藥用途，墨旱蓮提取物可抑制反映肺組織損傷的NO、MDA含量，降低反映膠原沉積的HYP含量和抑制肺組織中致纖維化的細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)從而干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠纖維化程度。
【專利說明】墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。
【背景技術(shù)】
[0002]肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要包括上皮細(xì)胞和基底膜的破壞、成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積。其特征是肺間質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積而正常肺組織結(jié)構(gòu)被破壞。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，慢性炎癥是成纖維細(xì)胞增殖和肺部結(jié)構(gòu)病理改變的主要因素，但抗炎治療效果不明顯，大量研究顯示成纖維細(xì)胞增殖與纖維化形成可以獨(dú)立于炎癥而發(fā)生，提示纖維化的病變不僅僅是炎癥的繼發(fā)結(jié)果。目前為止，抗炎及免疫調(diào)節(jié)藥物治療肺纖維化效果不好，傳統(tǒng)的治療藥物仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物為主，如皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺無顯著效果，副作用大，肺移植是肺纖維化終末階段的唯一有效治療方法，但在臨床廣泛應(yīng)用受到經(jīng)濟(jì)、供體缺乏等限制 ，因此尋找新的治療方法迫在眉睫。
[0003]有關(guān)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究早期主要集中在肺泡巨噬細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子，但目前已確定肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖及通過釋放大量介質(zhì)而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用，共同特征是體內(nèi)膠原代謝的失衡，在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主，晚期是以I型膠原增加為主。在肺纖維化過程中，肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖和分化作用受多種因子調(diào)控，除成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM外，受損的肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞也產(chǎn)生ECM，肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病過程中肺組織損傷修復(fù)和再生的關(guān)鍵參與者，因此，研究藥物抑制成纖維細(xì)胞的增殖對于防止肺纖維化有重要的意義，
[0004]多數(shù)肺纖維化病人的組織中可以觀察到炎癥與纖維化并存，提示炎癥反應(yīng)參與了肺纖維化的形成，肺泡炎癥和纖維化是兩個(gè)相對獨(dú)立的過程，炎癥反應(yīng)是有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，在某些情況下，炎癥損傷持續(xù)并引起纖維化，在肺纖維化發(fā)生過程中，TGF-β、TOGF、FGF、VEGF等幾個(gè)細(xì)胞因子起到關(guān)鍵性作用，可以作為研究和治療的關(guān)鍵性靶點(diǎn)[1]。細(xì)胞因子之間及其與炎癥細(xì)胞、肺臟組織細(xì)胞之間可以相互作用發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)加重肺組織炎癥或免疫損傷，刺激纖維母細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，肺纖維化的發(fā)生是以細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡導(dǎo)致大量趨化因子釋放從而引起炎性細(xì)胞聚集、活化為基礎(chǔ)。細(xì)胞因子在肺纖維化中的作用是目前研究的熱點(diǎn)，采用抑制促纖維化的細(xì)胞因子為纖維化的治療提供了一條新的有效途徑。
[0005]各種因素作用于肺臟，直接或間接產(chǎn)生氧自由基，損傷肺組織，使MDA產(chǎn)生增多，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子，促進(jìn)損傷后的修復(fù)，使膠原產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。MDA為機(jī)體內(nèi)氧自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成的脂質(zhì)過氧化物，其含量的變化反映了機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，對膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，膠原是唯一含羥脯氨酸較多的蛋白質(zhì)。在肺纖維化病人肺組織中TGF-β I表達(dá)上調(diào)，而氧化應(yīng)激可以直接導(dǎo)致肺纖維化時(shí)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β I增多，TGF-β I是一個(gè)具有多重功能的細(xì)胞因子，通過細(xì)胞增殖、分化、凋亡及肺纖維上皮細(xì)胞分化等作用來調(diào)控組織形成和分化，是一種強(qiáng)力的致纖維化因子[2]，可以刺激細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分，還可改變基質(zhì)降解酶成分的活性，直接加劇ECM的沉積[3]，肺纖維化機(jī)制中TGF-β I/Smad為經(jīng)典信號(hào)通路，TGF-β I先與受體結(jié)合發(fā)生磷酸化，結(jié)合激活Smad2/3、與胞漿內(nèi)Smad4結(jié)合，入核與核內(nèi)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、及致纖維化作用[4]。因此，通過測定肺組織羥脯氨酸能確定組織中膠原的含量，TGF-β I表達(dá)降低可顯示藥物干預(yù)肺纖維化的可能作用機(jī)制，即藥物不是通過抗炎而改善肺纖維程度，是通過降低組織中TGF-β I的表達(dá)，激活TGF-β 1/Smad通路而發(fā)揮其干預(yù)作用。在眾多細(xì)胞因子中TGF-β I被認(rèn)為是肺纖維化形成與發(fā)展的“誘導(dǎo)劑”和“啟動(dòng)子”，TGF-β I可促進(jìn)成纖維細(xì)胞(FB)的增殖、分化及分泌的過程，繼而促進(jìn)膠原蛋白等ECM成分在肺間質(zhì)和肺泡中過度積聚，從而最終引起肺間質(zhì)纖維化。博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化是經(jīng)典的篩選抗肺纖維化藥物的體內(nèi)藥效模型，博萊霉素可引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，氧自由基產(chǎn)生增多，從而啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低其TGF-β I含量可減緩小鼠肺纖維化進(jìn)程。 [0006]中藥材墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrata L.的地上部分，自上個(gè)世紀(jì)80年代國內(nèi)外學(xué)者該植物化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離鑒定噻吩、皂苷、香豆素草醚、黃酮等類型成分?！吨袊幍洹?2010版)中收載蟛蜞菊內(nèi)酯、旱蓮苷A作為該藥材的定性、定量指標(biāo)性成分。墨旱蓮提取物有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止血、升白、保肝、增加冠流等作用；注射旱蓮草提取液能使常壓缺氧情況下小鼠的生命明顯延長，亦能提高在減壓和缺氧環(huán)境下的小鼠存活率；旱蓮草擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈流量和增加耐缺氧能力的作用出現(xiàn)快，維持時(shí)間長，毒性??；能提高減壓缺氧情況下小鼠的存活率。近幾年墨旱蓮的藥效研究主要集中于保肝、肝細(xì)胞的再生[5’6]、抗癌[7’8]、非特異性免疫增強(qiáng)[9]、改善骨質(zhì)疏松[1°]、腦神經(jīng)保護(hù)[11]等作用。分子水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)化合物膨蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)是ATP酶抑制劑[12’13’13]及異構(gòu)酶II抑制劑[15]，對NF-KB、IKK、capaSSe-ll等轉(zhuǎn)錄因子均具有抑制作用[16~19]，具有保肝、抗癌、抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[2°]、體外抑制人肝星狀細(xì)胞LX-2的纖維化[21]、減毒[22]等作用。
[0007]目如，有關(guān)墨旱蓮提取物等相關(guān)專利有近20余篇:主要集中在提取的制備方法(201010214799.6,201110184589.1,200610201098.2,201010603861.0,201110187513.4)、總皂苷的制備方法(200810031092.4，201310002410.5)、在保肝、降血脂(201110310181.4)以及在洗發(fā)膏、煙草香料等方面的應(yīng)用。尚未見報(bào)道墨旱蓮藥材的改善肺纖維化作用及其在治療此疾病藥物中用途。
[0008]【參考文獻(xiàn)】
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[0032]本項(xiàng)發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化病癥的醫(yī)藥新用途。
[0033]技術(shù)方案
[0034]墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0035]所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì)，所述的墨旱蓮提取物中總皂苷含量為53.24-56.1%，提取物中旱蓮苷A含量為6.54-11.30%，蟛蜞菊內(nèi)酯含量為1.46-3.56%。
[0036]所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成，所述的墨旱蓮提取物得率 10.01-15.05%o
[0037]其中所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏；將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位，同時(shí)將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位；其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
[0038]具體來說:
[0039]本項(xiàng)發(fā)明是經(jīng)過研究證明墨旱蓮提取物可改善博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型，并采用分光光度法對墨旱蓮提取物中總皂苷含量，采用HPLC法對提取物中2種單體物質(zhì)蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的含量進(jìn)行了測定。通過觀察HE、Masson染色后肺組織病理切片、測定各組肺臟系數(shù)、在不同時(shí)期檢測各組小鼠肺組織中NO、MDA、HYP、TGF-β I含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本發(fā)明中的墨旱蓮提取物可改善模型小鼠肺組織纖維化程度，降低模型肺組織膠原沉積，顯示對小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用，可用于治療肺纖維化疾病的新醫(yī)藥用途。
[0040]有益效果
[0041]1、肺纖維化是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，多數(shù)研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素治療肺纖維化有效率小于30%，患者生存率無明顯改變，目前尚無明確治療藥物。本發(fā)明墨旱蓮是常用中藥材。中醫(yī)認(rèn)為墨旱蓮為保肝補(bǔ)腎中藥，目前，沒有任何研究報(bào)道墨旱蓮提取物或其中某類單體成分可用于肺纖維化的治療，本發(fā)明人通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該墨旱蓮提取物顯著改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。本發(fā)明的墨旱蓮提取物具有較好的穩(wěn)定性，可以用于制備治療相應(yīng)疾病的藥物。
`[0042]2、依據(jù)《中國藥典》(2010版)記載，本發(fā)明提取物測定總皂苷含量(53.24-56.1% )之外，同時(shí)測定墨旱蓮的指標(biāo)成分蟛蜞菊內(nèi)酯(1.46-3.56% )和旱蓮苷A(6.54-11.30% )。本發(fā)明中的墨旱蓮提取物是個(gè)復(fù)雜體系，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明提取物整體入藥有效，尚不能確定活性成分及輔助成分類型。具體來說本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)施例1和2(即權(quán)利要求兩個(gè)端點(diǎn)值)中所制備的提取物給藥組中，HE、MaSSon染色病理切片顯示給藥組肺纖維化程度明顯改善，墨旱蓮提取物給藥組NO含量明顯低于模型組，給藥第14、28天，肺組織中反映肺損傷的MDA含量明顯低于模型組(P < 0.05或P < 0.01)，給藥第14、28天肺組織中反映膠原沉積的HYP的含量均明顯低于模型組，說明墨旱蓮提取物對肺纖維化進(jìn)程不同時(shí)期都有一定的保護(hù)作用，提示墨旱蓮提取物具有減輕氧自由基損傷，抑制膠原形成、保護(hù)肺組織的作用。實(shí)施例3 (不在發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi))提取物給藥組，雖然模型小鼠肺系數(shù)有較顯著變化(P < 0.05)，但其小鼠肺組織改善程度不明顯，NO、MDA、HYP,TGF-β I等指標(biāo)無明顯改變。抑制肺纖維化細(xì)胞過度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段，體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在1.6-100 μ g/mL范圍內(nèi)，實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物呈劑量依賴性抑制HFL-1增殖，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了墨旱蓮提取物的抗肺纖維藥物用途。因此說明本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)其可以墨旱蓮提取物對肺纖維化進(jìn)程不同時(shí)期都有一定的保護(hù)作用，不在本發(fā)明保護(hù)范圍效果不佳。
[0043]3、本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)材料來自原植物，原植物分別范圍廣，成本低，提取物活性明確，具有廣泛的實(shí)用價(jià)值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0044]1.圖1實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對造模第14、28天的小鼠肺系數(shù)及肺組織中HYP含量的影響。A:對肺系數(shù)的影響；B:對肺組織中HYP含量的影響；#p < 0.05，versuscontrol ；*p < 0.05, **p < 0.01versus model ;陽性對照藥物:prednisone。
[0045]2.圖2實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對各組肺組織炎癥程度的影響(HE染色X200)。A空白；B~D實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物；E模型；F陽性藥
[0046]3.圖3實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對各組肺組織纖維化程度的影響(Masson染色X200)。A空白；B~D實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物；E模型；F陽性藥
[0047]4.圖4實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物對造模第14、28天時(shí)各組肺組織中NO(A)與 MDA(B)含量的影響。(##p < 0.01，#p < 0.05，versus control ；*p < 0.05，**p< 0.01versus model)，陽性對照藥物:prednisone
[0048]5.圖5實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物對各組肺組織中TGF-β I含量的影響。(##ρ < 0.01, #ρ < 0.05, versus control ；*p < 0.05, **p < 0.01versus model),陽性對照藥物:prednisone
【具體實(shí)施方式】
[0049]實(shí)施例1
[0050]一、墨旱蓮提取物的制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)考察
[0051]墨旱蓮(Herba Ecliptae)為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.的干燥地上部分，購于安徽亳州。乙醇、石油醚等試劑均為分析純。
[0052]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物(EtOAc)及水部位(H20)，同時(shí)將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水(6.56% ) ,30% (4.66% ) ,60%(5.51% ),90% (4.49%)乙醇洗脫部位，60%乙醇洗脫部位減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物，配制成藥液用于活性研究。
[0053]1、墨旱蓮提取中總皂苷的含量測定方法如下:
[0054]①標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液的制備:稱取干燥至恒重所得旱蓮苷A對照品1.46mg,甲醇溶解，定容于IOml量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取墨旱蓮提取物7.0lmg,甲醇溶解，定容至25ml,混勻，作為樣品液。
[0055]②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取旱蓮苷A對照品溶液各0，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0ml，置于IOml具塞試管中水浴揮干，加0.2ml的5%香草醛/冰醋酸和0.8ml高氯酸溶液，于60°C水浴加熱15min，冷卻后加5ml冰醋酸，以溶液濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為 C = 0.4757A+0.0002，R2 = 0.9998，在 0.029 ~0.146mg/ml 呈良好的線性關(guān)系。依同法制備空白對照。于波長550nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0056]③樣品中總皂苷含量測定:吸取樣品液lmL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作，測定吸收度。計(jì)算墨旱蓮總皂苷含量為56.1%。
[0057]2、墨旱蓮提取物中旱蓮苷A和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量測定:[0058]①色譜條件:C18柱(ZORBAX SB-C18,14.6 X 250mm5-Micron，Agilent);進(jìn)樣量:20 μ L0流速lml/min。檢測波長:210nm。流動(dòng)相:乙腈(A)和0.1 %磷酸緩沖液⑶梯度洗脫，O ~lOmin，15-23% (A) ；10-40min, 23% (A) ；40-42min, 23-40% (A) ；42-60min, 40%⑷；60-65min ；40-90% ⑷。
[0059]②對照品、供試品溶液制備:精密稱取蟛蜞菊內(nèi)酯對照品6.72mg,旱蓮苷A7.03mg于25ml容量瓶，甲醇溶解并定容。即蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的濃度分別為0.2688mg/ml,0.2812mg/ml。精密稱取墨旱蓮提取物16.77mg于IOml容量瓶，甲醇溶解定容，搖勻，即得。
[0060]③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取混合對照品溶液各1.00，1.25，1.5，1.75，2.0Oml于IOml量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述條件測定。以對照品溶液濃度X(Xl(T5mg/ml)為橫軸，峰面積Y為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蟛蜞菊內(nèi)酯的回歸方程為:Y=L 0459X-784.56 (R2 = 0.9905)，旱蓮苷 A 的回歸方程為:Y = 0.0793Χ-29.940 (R2 =0.9982)，分別在 0.02688 ~0.05376mg/ml 和 0.02812 ~0.05624mg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 [0061]將供試品溶液按上述所述條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算得總皂苷旱蓮苷A的含量為
11.30%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為3.56%。
[0062]實(shí)施例2
[0063]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分，水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液，通過HP-20樹月旨，用乙醇-水梯度洗脫，依次采用30%，70%及90%乙醇洗脫，其中70%乙醇洗脫部位減壓干燥后，備用，用于抗肺纖維化活性研究。
[0064]按實(shí)施例1所述條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算得總皂苷含量為53.24%，旱蓮苷A的含量為6.54%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46%。
[0065]實(shí)施例3
[0066]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分，水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液，得墨旱蓮極性提取物，_20°C冷藏保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)用藥:以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物，配制成藥液。
[0067]按實(shí)施例1中所述條件檢測，計(jì)算得總皂苷為45.2%，旱蓮苷A的含量為0.71%，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為0.26%。
[0068]實(shí)施例4
[0069]二、墨旱蓮提取物改善博萊霉素所致小鼠肺纖維模型
[0070]選取實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。氣管內(nèi)注入博來霉素復(fù)制小鼠肺纖維化模型，是國際上普遍采用的一種方法，而且與人類肺間質(zhì)纖維化相近。
[0071]I材料與儀器ICR小鼠，雌性，體重18_22g，由南京市青龍山動(dòng)物繁殖場提供。娃哈哈純凈水。羥脯氨酸試劑盒，南京建成生物工程研究所。醋酸潑尼松，批號(hào)120101，江蘇平光制藥有限責(zé)任公司。水合氯醛，批號(hào)20100813，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0072]2實(shí)驗(yàn)方法 ICR雌性小鼠，分空白組，模型組，陽性藥組，墨旱蓮提取物按照劑量lOg/kg灌胃給藥，每組各20只。小鼠腹腔注射10ml/kg，4%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部。用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管。注射器刺入氣管，空白組注入生理鹽水，其余各組均注入博來霉素(5mg/kg)。然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉(zhuǎn)后用75%酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l_2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。
[0073]造模后即日開始，空白組，模型組每天灌胃生理鹽水，陽性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松。取實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物，分別灌胃10g/kg墨旱蓮提取物，連續(xù)灌胃28天。于28日，小鼠稱體重，摘眼球取血，血液流入1.5ml離心管中，靜置后，40C 3000rpm離心20min, -80°C保存?zhèn)溆?。取出肺組織,稱重,計(jì)算肺系數(shù),肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)，見圖1A所示。另取各組實(shí)驗(yàn)小鼠左上肺葉按照試劑盒說明書測定羥脯氨酸含量，結(jié)果見圖1B。取各組小鼠左下肺放入4%甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，HE染色，Masson染色，觀察肺組織損傷及纖維化變化，造模28天后肺組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖2和3。
[0074]所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)土SD(x土s)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-way AN0VA), P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0075]病理組織切片經(jīng)HE、Masson染色，結(jié)果表明對照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出物，肺泡腔未見炎性細(xì)胞浸潤，無成纖維細(xì)胞增生，對照組小鼠的肺組織內(nèi)可見 少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤急成纖維細(xì)胞增生，大量膠原沉積，肺纖維化形成，Masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點(diǎn)，則說明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。經(jīng)陽性藥物醋酸潑尼松治療后，陽性對照組小鼠肺泡間隔較寬，肺泡腔變窄，較多炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生，病變程度較模型組減輕。給藥各組及陽性藥與模型組相比，纖維化程度均減輕。(圖2和3)
[0076]3.總提取物對模型小鼠肺系數(shù)和肺組織HYP含量所產(chǎn)生的影響。
[0077]羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14%，對膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，由于膠原是唯一含HYP較多的蛋白質(zhì)，因此，測定HYP含量能反映組織膠原的總量變化。造模之后的第14、28天測定肺系數(shù)，消化法檢測肺組織中HYP的含量。與正常對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義$<0.01或0.05);與模型組小鼠肺系數(shù)相比較。給藥14、28天后，墨旱蓮提取物組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(P <0.01)，但實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物組間不具有明顯差異(圖1A)。與對照組相比，28天時(shí)模型組肺組織HYP含量顯著增加(P < 0.01)，與模型組相比，實(shí)施例1和實(shí)施例2所制備的提取物可明顯降低肺組織中HYP含量(P < 0.05)，實(shí)施例3所制備的提取物的作用不明顯(圖1B)。提示實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，墨旱蓮提取物劑可降低模型肺組織膠原纖維含量，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度。[0078]4.墨旱蓮提取物對模型小鼠肺組織中NO，MDA、TGF- β I含量所產(chǎn)生的影響。
[0079]肺組織損傷則MDA產(chǎn)生增多，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)N0、TNF-a等及各種細(xì)胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過度增多。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測14、28天時(shí)各組肺組織N0、MDA含量。
[0080]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，第14、28天模型組的NO、MDA含量均升高(P
<0.01)，陽性給藥組中反映肺損傷的MDA、N0含量明顯低于模型組，同樣，實(shí)施例1和實(shí)施例2法所制備的墨旱蓮提取物給藥組的NO、MDA含量也顯著下降(P < 0.01或0.05)(圖
4)，提示實(shí)施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善模型小鼠的肺組織損傷程度。
[0081]采用ELISA法，在造模28天結(jié)束時(shí)檢測各組小鼠肺組織中TGF-β I的含量(圖
5)。與對照組相比，模型組的TGF-βI的含量顯著升高，而與模型組相比，灌胃給予實(shí)施例1和實(shí)施例2所制備的墨旱蓮提取物之后，模型小鼠肺組織中TGF-β I的含量均顯著降低(P
<0.05)，而灌胃給藥實(shí)施例3法制備的提取物之后，模型肺組織中TGF-β I含量變化不明顯。TGF-β I是組織纖維化中公認(rèn)的致纖維化因子，通過經(jīng)典的TGF-β 1/Smads途徑參與纖維化進(jìn)程，研究結(jié)果提示實(shí)施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的降低TGF-β I含量，較好地干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化發(fā)展程度。
[0082]三、實(shí)施例1-3所制`備的墨旱蓮提取物對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響
[0083]肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化進(jìn)程中的效應(yīng)細(xì)胞，不是被動(dòng)參與病程，成纖維細(xì)胞的增殖并且分化成肌成纖維細(xì)胞，這兩種細(xì)胞均可分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，肺內(nèi)的ECM主要由膠原、糖胺聚糖、纖連蛋白FN等構(gòu)成，在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主，晚期是以I型膠原增加為主。由于肺成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原分泌增加在肺纖維化過程中起重要作用，抑制肺纖維化細(xì)胞過度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段。
[0084]人胚肺成纖維細(xì)胞(HFLl)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。HFLl細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換I次培養(yǎng)基，細(xì)胞生長90%密度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并傳代。將實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物分別命名為I號(hào)、2號(hào)、3號(hào)提取物。
[0085]實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。采用MTT法考察不同濃度藥物對HFL-1的生長抑制作用。取對數(shù)生長細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為5 X IO4ceIΙ/ml，每孔細(xì)胞懸液200μ 1，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組依次加入不同濃度的墨旱蓮提取物培養(yǎng)液，設(shè)立空白及陰性對照組，每組5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。分別作用48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20l.! 1，孵育4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150μ 1DMS0，震蕩混勻后，在酶標(biāo)儀492nm波長處檢測各孔的吸光度。(如表1)。
[0086]表1不同濃度墨旱蓮提取物對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響(n = 5，48h，x土SD)
【權(quán)利要求】
1.墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì)，墨旱蓮提取物中總皂苷含量在53.24-56.1%，提取物中旱蓮苷A的含量為6.54-11.30%，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46-3.56%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成，墨旱蓮提取物得率為10.01-15.05%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏；將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位，同時(shí)將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水洗脫部位、30 %乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位； 其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK103768117SQ201410044532
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張朝鳳, 許翔鴻, 張勉, 薛倩, 賀湘, 鄒倩 申請人:中國藥科大學(xué)