聚乙二醇化磷脂為載體的膠束多肽疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種以聚乙二醇化磷脂為載體的膠束 多肽疫苗，及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 以納米尺度材料作為載體設(shè)計的腫瘤治療性疫苗是治療腫瘤的新思路。已有的 研究表明，利用納米尺度材料載體攜帶蛋白抗原，能夠提高抗原的免疫原性，這種現(xiàn)象可能 與納米尺度材料相對巨大的比表面積和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)；同時納米尺度材料載體對蛋白 抗原能夠起到一定程度的保護(hù)，防止蛋白抗原很快地被血液中的蛋白酶和內(nèi)網(wǎng)系統(tǒng)降解， 有利于蛋白抗原發(fā)揮作用；另外，攜帶有蛋白抗原的納米尺度材料載體易被抗原呈遞細(xì)胞 (antigenpresentcells,APCs)，特別是樹突狀細(xì)胞（DendriticCells,DCs)，攝取和加 工，從而使DCs處理和呈遞大量蛋白抗原，引發(fā)更為有效的免疫反應(yīng)。使用特定的納米尺度 材料包載腫瘤特異性抗原和免疫佐劑組成腫瘤治療性疫苗，接種腫瘤患者能夠刺激患者的 免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，減小甚至清除手術(shù)或放、化療后體內(nèi)殘存的腫瘤 病灶。
[0003] 目前雖然已經(jīng)出現(xiàn)多種以納米尺度材料為載體的腫瘤疫苗設(shè)計方案，但都存在 一些關(guān)鍵性的技術(shù)障礙。以病毒（viruses)、病毒樣顆粒（virus-likeparticles)或 病毒顆粒（virosomes)作為載體的腫瘤疫苗（LArlenPM,etal.Arandomizedphase IIstudyofdocetaxelaloneorincombinationwithPANVAC-V(vaccinia)and PANVAC-F(fowlpox)inpatientswithmetastaticbreastcancer(NCI05-C-0229) ? ClinBreastCancer. 2006 ；7:176 - 179. ；2.GulleyJL,etal.Immunologicand prognosticfactorsassociatedwithoverallsurvivalemployingapoxviral-based PSAvaccineinmetastaticcastrate-resistantprostatecancer.CancerImmunol Immunother. 2009)，雖然能夠在使用初期刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但由于病毒的蛋白成分 本身就是有效的抗原同時組成占優(yōu)，因此引發(fā)的免疫反應(yīng)主要是針對病毒載體本身的抗原 而非病毒載體攜帶的腫瘤特異性抗原，降低了免疫反應(yīng)的效率，特別是在腫瘤特異性抗原 的抗原性比較弱的情況下，這種效應(yīng)更為明顯；而為了提高治療性疫苗的免疫治療效果，通 常要進(jìn)行多次免疫，這種情況下前次免疫引發(fā)的針對病毒載體本身的免疫反應(yīng)（主要是抗 體反應(yīng)），會大大降低后續(xù)免疫治療的效果；此外以常見病毒，例如腺病毒，痘病毒等為載 體設(shè)計的疫苗，往往因?yàn)榛颊呖赡艿脑缙诓《靖腥井a(chǎn)生的免疫保護(hù)而顯著降低疫苗的免疫 治療效果（HuangX，YangY.Innateimmunerecognitionofvirusesandviralvectors. HumGeneTher. 2009 ；20:293 - 301.)〇
[0004] 以脂質(zhì)體為載體的納米疫苗，載體本身不具有免疫原性，能夠有效提高腫瘤特 異性抗原的免疫效率，但是，脂質(zhì)體載體由于尺度和成分的原因，經(jīng)過皮下接種后其顆粒 并不能有效地擴(kuò)散入引流淋巴結(jié)，一部分疫苗成分長時間駐留在接種部位，隨之而來的， 免疫產(chǎn)生的腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（Cytotoxiclymphocytes,CTLs)會有 很大一部分迀移至疫苗接種部位而非腫瘤生長部位，大大降低了針對腫瘤的特異性免疫 反應(yīng)(HailemichaelY，etal.Persistentantigenatvaccinationsitesinduces tumor-specificCD8+Tcellsequestration,dysfunctionanddeletion.NatMed. 2013 ； 19(4) :465-72.)。另外，由于脂質(zhì)體制備的特點(diǎn)，得到的產(chǎn)物往往均一性較差，顆粒尺度跨 度很大，而且批次之間的重復(fù)性也一般，在質(zhì)量控制上存在一定的難度。
[0005] 膠束載體，是一種由同時包含疏水嵌段和親水嵌段的雙親性聚合物分子自組裝成 的納米顆粒，膠束納米顆粒的組裝是聚合物分子在水溶液中自發(fā)形成熱力學(xué)穩(wěn)定體系，這 個過程是由疏水片段從水溶液中撤出并自發(fā)堆積聚合引起的自由能降低推動的。與低分 子量表面活性劑相比，雙親性聚合物的臨界膠團(tuán)濃度（criticalmicelleconcentration， CMC)更低，這使得聚合物膠束更能對抗溶液的稀釋，同時，疏水嵌段組成的膠束核結(jié)構(gòu)緊 密，在生理環(huán)境中被大量體液稀釋后，不容易解離，穩(wěn)定性更好。雙親性聚合物分子的親水 性嵌段大都選用聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)，聚乙二醇水溶性良好，具有高度 水合特性，在膠束顆粒的外殼區(qū)域能夠?yàn)槟z束顆粒提供足夠的空間位阻。此外，它的生物 相容性良好，是通過FDA認(rèn)證的廣泛使用的藥用輔料。雙親性聚合物分子的疏水嵌段材料 比較豐富，是決定膠束載體載藥效率和穩(wěn)定性的主要因素。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，疏水嵌段 中的親脂基團(tuán)可分為三類，聚酯（polyester)衍生物，聚氨基酸（poly(aminoacid))衍生 物和普郎尼克類（Pluronics)。聚酯類內(nèi)核嵌段中，聚乳酸（poly(lacticacid),PLA)，聚 己內(nèi)酬（poly(caprolactone)，PCL)和聚羥基乙酸（poly(glycolicacid))均為FDA認(rèn) 可的具有良好生物相容性的材料。聚氨基酸類內(nèi)核嵌段中，聚天冬氨酸（P〇ly(aspartiC acid)，PAsp)，聚谷氨酸（poly(glutamicacid)，PGlu)，聚賴氨酸（poly(L-Iysine)，PLys)， 聚組氨酸（poly(histidine),PHis)等材料已被普遍利用。Pluronics為聚環(huán)氧乙燒-聚環(huán) 氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷組成的三嵌段共聚物，可以表示為PE0m-PP0n-PE0m。
[0006] 聚乙二醇化磷脂是一種新型的雙親性聚合物分子。其親水嵌段為聚乙二醇，疏水 嵌段為磷脂分子。聚乙二醇分子通過共價鍵與磷脂分子上的含氮堿基結(jié)合。目前，聚乙二醇 化磷脂作為包載材料主要是用于包載小分子化療藥物，其優(yōu)點(diǎn)如下：1)疏水內(nèi)核磷脂可以 包載難溶性藥物，大大提高藥物的溶解能力；2)親水外殼聚乙二醇可以保護(hù)膠束內(nèi)部的藥 物分子不被外界吸附或降解，能夠幫助藥物逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，延長藥物循環(huán)時間； 3)控制藥物的釋放，優(yōu)化藥物的體內(nèi)分布以達(dá)到更好的治療效果（不會引發(fā)免疫反應(yīng)）。但 是，有關(guān)聚乙二醇化磷脂膠束對蛋白或多肽的包載研究極少，有關(guān)聚乙二醇化磷脂制備的 膠束作為載體系統(tǒng)開發(fā)的腫瘤治療性疫苗的研究國內(nèi)外均未見報道。
[0007] 單磷酰脂A(MonophosphorylLipidA,MPLA)是一類較為常見的免疫佐劑（結(jié)構(gòu) 見圖9)，其是通過化學(xué)修飾來源于沙門氏菌R595的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)而 得到的新型的免疫佐劑。與LPS相比，MPLA基本保留了免疫刺激能力，但是內(nèi)毒素毒性大 大降低，因此成為了一種更加安全且有效的免疫佐劑，并已被美國FDA批準(zhǔn)作為免疫佐劑 進(jìn)入臨床。與LPS發(fā)揮作用的分子機(jī)制相似，MPLA也是通過與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR) 4相作用，激活其下游與天然免疫相關(guān)的信號通路，激活天然免疫反應(yīng)，促進(jìn) 干擾素Y和腫瘤壞死因子a的表達(dá)；與此同時活化樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)一步激活獲得性免 疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及一種能夠預(yù)防和治療腫瘤的膠束多肽疫苗。
[0009] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)和抗原多肽自組裝形 成，所述的聚乙二醇化磷脂為聚乙二醇（親水嵌段）通過共價鍵和磷脂分子（疏水嵌段） 上的含氮堿基結(jié)合形成的化合物。
[0010] 本發(fā)明所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇親水嵌段為分子量500~10000 的PEG分子，優(yōu)選為PEG1500~3000,最優(yōu)選為PEG2000。
[0011] 本發(fā)明所述的膠束疫苗的粒徑為10~l〇〇nm，優(yōu)選為10~50nm，最優(yōu)選為20nm。
[0012] 本發(fā)明所述的抗原多肽為長度為5~100個氨基酸的多肽，優(yōu)選為10~50個氨 基酸的多肽，更優(yōu)選為20~30個氨基酸的多肽，最優(yōu)選為E7多肽或OT-I多肽。
[0013] 本發(fā)明所述的E7抗原多肽為來源于人16型乳頭瘤病毒（HPV16)腫瘤的相關(guān)抗 原，在N端連接一個棕櫚酸分子，S卩E743 62序列：棕櫚酸-GQAEroRAHYNIVTFCCKCD;
[0014] 本發(fā)明所述的OT-I多肽為來源于卵清蛋白（OVA)的17個氨基酸的多肽，包 含OVA蛋白在H-2Kb分型小鼠特異性CTL表位0VA257-264,氨基酸序列結(jié)構(gòu)為棕櫚 酸-EQLESIINFEKLTEWKD。
[0015] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗還可以包含調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的免疫佐劑，所述的免 疫佐劑包括弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、單磷酰脂A佐劑，優(yōu)選為單磷酰脂A(MPLA)佐劑。
[0016] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗中，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、抗原多肽、免疫佐劑 的用量摩爾比例范圍720 :4~160 :3~80,最優(yōu)選摩爾比180 :4 :3。
[0017] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗制劑為溶液形式或凍干形式。
[0018] 本發(fā)明所述的膠束多肽疫苗的制備方法為：
[0019] (1)以易揮發(fā)有機(jī)溶劑溶解PEG-PE載體分子、抗原多肽分子、佐劑分子，制備載體 分子溶液、抗原多肽溶液、佐劑溶液；
[0020] (2)按照特定比例將步驟（1)所獲得的載體分子溶液、抗原多肽溶液、佐劑溶液混 勻；
[0021] (3)除去步驟（2)所獲得的混合溶液中的全部有機(jī)溶劑，使載體分子、抗原多肽分 子和佐劑分子形成分布均勾的混合脂膜；
[0022] (4)以一定量的去離子水或生理鹽水溶解步驟（3)所獲得的混合脂膜，溫育條件 下使脂膜水化均勻，隨后室溫靜置一定時間，獲得膠束疫苗溶液；
[0023] (5)將步驟（4)所獲