一種基于聚乙二醇修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種基于聚乙二醇修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗的制備方法。使用該方法制備的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗，可用于預(yù)防流行性腦膜炎等疾病，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是引起流行性腦脊髓膜炎的病原菌。腦膜炎奈瑟氏球菌主要通過(guò)咳嗽，噴嚏或接吻等方式進(jìn)行傳播，由鼻咽部侵入血液循環(huán)，引起菌血癥和敗血癥。病人會(huì)出現(xiàn)惡寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐，皮膚上有出血性皮瘆，嚴(yán)重時(shí)該菌會(huì)侵染腦脊髓膜，發(fā)生化膿性腦脊髓膜炎。流行性腦膜炎通常以7歲以下的兒童和60歲以上老人的發(fā)病率最高，死亡率維持在5% -10%之間。
[0003]腦膜炎奈瑟氏球菌根據(jù)其莢膜多糖的特異性，可分成A、B、C、D、29E、H、1、K、L、W135、X、Y、Z共十三個(gè)血清型致病菌。其中，以A、C、W135和Y群菌株的毒力最強(qiáng)，占發(fā)病病例的95%以上，是引起流行性腦膜炎最常見(jiàn)的4種致病菌株。傳統(tǒng)的腦膜炎莢膜多糖疫苗僅能誘導(dǎo)短期的T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)，免疫原性弱，且產(chǎn)生的抗體很快就會(huì)消失，尤其對(duì)兩歲以下嬰幼兒的保護(hù)效果最差。這是由于莢膜多糖是T細(xì)胞非依賴性抗原，只能激活非成熟的B細(xì)胞，產(chǎn)生IgM抗體，幾乎不能誘導(dǎo)產(chǎn)生B記憶細(xì)胞，不具備免疫記憶能力。通過(guò)將莢膜多糖與具有強(qiáng)免疫原性的載體蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，可以將T細(xì)胞非依賴型的莢膜多糖轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴型的多糖，提高莢膜多糖的免疫原性。人們?cè)诖嘶A(chǔ)上成功開發(fā)了多糖結(jié)合疫苗，在一定程度上解決了這一問(wèn)題。然而，目前已上市的多糖結(jié)合疫苗的免疫原性仍有待進(jìn)一步的提尚。
[0004]近期的研宄結(jié)果表明，當(dāng)載體蛋白的劑量在0.025-2.5 y g的范圍內(nèi)，能夠提高多糖結(jié)合疫苗中多糖的免疫原性；當(dāng)載體蛋白的劑量超過(guò)25 yg以上時(shí)，能夠顯著抑制多糖的免疫原性。例如，當(dāng)破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳疫苗和以破傷風(fēng)類毒素為載體的流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗、腦膜炎多糖結(jié)合疫苗一起免疫注射時(shí)，抗流感嗜血桿菌和抗破傷風(fēng)類毒素的抗體都會(huì)減少，這就是經(jīng)典的載體抑制現(xiàn)象。因此，具有適度免疫原性的載體蛋白有助于提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。通過(guò)改變載體蛋白的免疫原性來(lái)提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性，是優(yōu)化載體蛋白和設(shè)計(jì)新型多糖結(jié)合疫苗的一種關(guān)鍵技術(shù)。
[0005]聚乙二醇(PEG)是一種中性、無(wú)毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修飾可有效增加載體蛋白的水化體積，減少腎小球的過(guò)濾作用，延長(zhǎng)載體蛋白在體內(nèi)的半衰期，提高其生物利用度；PEG分子覆蓋在載體蛋白的表面，可屏蔽其抗原表位，可在一定程度上降低載體蛋白的免疫原性。因此，通過(guò)適度的PEG修飾，可以改變載體蛋白的免疫原性，獲得具有適度免疫原性的載體蛋白，從而進(jìn)一步提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006](1)本發(fā)明提供了一種基于聚乙二醇修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗的制備方法，并以此方法制備出一種具有高免疫原性的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗。
[0007](2)本發(fā)明所涉及的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗，所使用的腦膜炎多糖為血清型為A、C、W135和Y群的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。
[0008](3)本發(fā)明所涉及的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗，所使用的蛋白載體為破傷風(fēng)類毒素。
[0009](4)本發(fā)明涉及一種腦膜炎多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其核心技術(shù)是通過(guò)PEG修飾適度地抑制載體蛋白的免疫原性，提高腦膜炎多糖結(jié)合疫苗中莢膜多糖的免疫原性。具體而言，通過(guò)控制載體蛋白所連接的PEG數(shù)量，在一定程度上屏蔽載體蛋白的抗原表位，獲得具有適度免疫原性的載體蛋白，從而進(jìn)一步提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。
[0010](5)本發(fā)明涉及一種腦膜炎多糖結(jié)合疫苗的制備方法，由以下步驟組成:(a)溴化氰活化腦膜炎球菌莢膜多糖；(b)用N-2-胺乙基-馬來(lái)酰亞胺衍化溴化氰活化的莢膜多糖；(c)由2-亞氨基硫烷將破傷風(fēng)類毒素的氨基轉(zhuǎn)化為巰基；(d)腦膜炎莢膜多糖的衍生物與破傷風(fēng)類毒素的衍生物進(jìn)行共價(jià)結(jié)合；(e)用聚乙二醇修飾多糖-蛋白結(jié)合物中的破傷風(fēng)類毒素。
[0011]使用本發(fā)明所制備的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗，能預(yù)防由A、C、W135和Y群血清型腦膜炎奈瑟氏球菌感染引起的疾病，適用于2個(gè)月以上各年齡段的兒童。該多糖結(jié)合疫苗的特點(diǎn)是通過(guò)PEG修飾適度地抑制載體蛋白的免疫原性，從而獲得較高免疫原性的多糖結(jié)合疫苗。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1多糖結(jié)合疫苗的制備反應(yīng)示意圖。
[0013]圖2多糖結(jié)合疫苗的分離純化。分離純化由Sephacryl 300凝膠過(guò)濾柱(2.6cmX 60cm)進(jìn)行。流動(dòng)相為20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，流速為0.5ml/min。
[0014]圖3屮NMR測(cè)定多糖結(jié)合疫苗的結(jié)構(gòu)。
[0015]圖4多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。圖a為在第7天、14天和21天產(chǎn)生的多糖特異性的IgG抗體滴度；圖b為在第21天產(chǎn)生的多糖特異性的IgGl和IgG2a抗體滴度；圖c為在第21天產(chǎn)生的多糖特異性的IgM抗體滴度；圖d為在第21天產(chǎn)生的載體蛋白特異性的IgG抗體滴度。
[0016]圖5腦膜炎多糖特異性抗體的特異性和親合性。圖a為多糖特異性抗體的特異性；圖b為多糖特異性抗體的親合性。
【具體實(shí)施方式】
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[0017]通過(guò)以下具體的實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1:制備未被PEG修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗
[0019]未被PEG修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗(PS-TT)的制備反應(yīng)如圖1所示。將15mgA群腦膜炎球菌莢膜多糖溶于3ml生理鹽水中，使其終濃度為5mg/ml。用0.5M氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)節(jié)為10.8。加入30 y 1溴化氰溶液(50%，w/v)進(jìn)行活化，于室溫下反應(yīng)30分鐘。活化過(guò)程中，用0.5M NaOH將溶液的pH值維持在10.5左右。隨后，用0.5M的鹽酸將溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.5左右，終止活化反應(yīng)。隨后，加入15mg N-2-胺乙基-馬來(lái)酰亞胺，于4°C下反應(yīng)過(guò)夜，獲得腦膜炎多糖的活化產(chǎn)物。
[0020]將破傷風(fēng)類毒素(TT)與2-亞氨基硫烷以摩爾比為1:50的比例混合，反應(yīng)pH值為7.4，于4°C條件下反應(yīng)過(guò)夜。如圖1所示，2-亞氨基硫烷會(huì)將破傷風(fēng)類毒素分子的氨基轉(zhuǎn)化成巰基。用截留分子量為1kDa的濾膜于6000g離心5次，除去未反應(yīng)的2-亞氨基硫烷。將活化的多糖與活化的載體蛋白混合，多糖與載體蛋白的質(zhì)量比為1:1，于4°C條件下反應(yīng)過(guò)夜，獲得未被PEG修飾的腦膜炎多糖結(jié)合疫苗(PS-TT)。
[0021]實(shí)施例2:制備兩組PEG修飾程度不同的多糖結(jié)合疫苗
[0022]分別將1.5mg和5mg單甲氧基聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺(mPEG5K_mal，PEG的分子量為5kDa)與2ml的PS-TT溶液混合，其中PS-TT的蛋白濃度為2mg/ml。如圖1所示，修飾反應(yīng)在20mM磷酸緩沖液(pH7.4)中進(jìn)行，于4°C下反應(yīng)過(guò)夜。其中，mPEG5K-mal與PS-TT中載體蛋白的質(zhì)量比分別為0.3:1和1:1。用截留分子量為50kDa的濾膜于60