一種聚乙二醇修飾的l-門冬酰胺酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾藥物，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] L-門冬酰胺酶（L-ASNase,L-asparaginase,EC. 3. 5. 1. 1)，又名L-天冬酰胺酶或 L-天門冬酰胺酶，其目前主要用于臨床上治療急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL)。其對兒童的完 全緩解率可達57. 8 %，有效率為85. 2 %;對成人的完全緩解率為32. 8 %，有效率為64. 3 %。 同時，對單細(xì)胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增多癥以及慢性髓細(xì)胞白血病均 有一定療效。
[0003] 1974年，國內(nèi)就已經(jīng)將L-門冬酰胺酶投入生產(chǎn)（天津生化制藥廠等.醫(yī)藥工業(yè)， 1974, 4XIV8.)，后因囷種退化等原因而退出市場，現(xiàn)基本依賴進口。
[0004] 由于L-門冬酰胺酶是以大腸桿菌為主要來源的一種異源蛋白質(zhì)，存在半衰期短， 穩(wěn)定性低，具有較強的免疫原性等缺點，易于誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，形成中和抗體，縮短半 衰期以及難以維持有效的血藥濃度等缺陷。雖然與其它化療藥物相比，其具有選擇性殺傷 癌細(xì)胞的優(yōu)點，并且對骨髓的抑制作用較小，但該酶在血液循環(huán)系統(tǒng)中會由于胰蛋白酶的 消化作用而很快失活，因此相對地就需要較高濃度、大劑量的酶來維持療效，而這種大劑量 又會引起更大范圍的毒副作用。因而，如何獲得低免疫原性，低毒副作用L-門冬酰胺酶用 于臨床給藥，一直是研宄的重點。
[0005] 聚乙二醇（PEG)是一種中性，無毒，具有良好生物相容性的高分子聚合物（分子量 幾百到幾萬），也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。對蛋白質(zhì) 藥物進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾研宄中應(yīng)用最多，成功率最高的也是PEG化修飾技術(shù)。
[0006] PEG化原理是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化成高反應(yīng)活性基團，與蛋白質(zhì)的巰基、氨基、羧 基或是羥基進行偶聯(lián)反應(yīng)，生成PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。PEG化蛋白質(zhì)藥物在臨床用藥上具有 改善多肽類藥物的穩(wěn)定性及可溶性，降低其免疫原性，提高生物利用度等優(yōu)點。經(jīng)PEG修飾 的L-門冬酰胺酶除了降低免疫原性與延長半衰期外還有效增加了其穩(wěn)定性，使臨床上的 用藥頻率降低，最終降低了治療費用。
[0007] 中國專利CN1498965A公開了一種聚乙二醇修飾門冬酰胺酶的制備方法，該專利 使用聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯（SS-PEG)對其進行修飾。而后對修飾產(chǎn)物使用中空纖 維柱超濾進行分離。由于SS-PEG屬于第一代活化的聚乙二醇修飾劑，其修飾產(chǎn)物具有易 水解及穩(wěn)定性低的缺點。且水解后會有琥珀酸尾巴作為半抗原殘留在生物體內(nèi)從而增加 了L-門冬酰胺酶的免疫原性。而通過超濾手段無法徹底的將單點和多點修飾產(chǎn)物分開，從 該公開專利的附圖1中可以發(fā)現(xiàn)這種藥物實際為一種多種修飾的混合產(chǎn)物，其缺點顯而易 見。
[0008] 中國專利CN101082043B也公開了一種聚乙二醇修飾門冬酰胺酶的制備方法。該 專利使用線性單甲氧基聚乙二醇對其進行修飾。而后使用離子交換層析和凝膠樹脂過濾層 析對修飾后產(chǎn)物進行分離。但由于采用線性的聚乙二醇修飾，為了降低免疫原性，就需要多 點修飾。而多點修飾存在使修飾后的藥物活性被大幅度降低，無法更好的滿足臨床應(yīng)用的 需求。
[0009]因而本專利迫切需要提供一種由新一代的聚乙二醇修飾劑修飾的L-門冬酰胺 酶，同時達到降低免疫原性與活性損失的目的，已更好的滿足臨床應(yīng)用方面的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明有以下幾個目的：第一、提供一種新型的聚乙二醇 共價修飾的L-門冬酰胺酶，該酶具有更低的免疫原性，活性損失更少，半衰期更長等特點， 更適合臨床應(yīng)用；第二、提供上述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶的制備方法；第三、 提供上述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶的醫(yī)藥用途。
[0011] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0012] 聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，該L-門冬酰胺酶采用支鏈化聚乙二醇對其 進行修飾；支鏈化聚乙二醇為含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇，并且單一活性功能基 團設(shè)置在端點，所述的含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式如下：
【主權(quán)項】
1. 聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于該L-門冬酰胺酶采用支鏈化聚乙 二醇對其進行修飾；支鏈化聚乙二醇為含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇，并且單一活 性功能基團設(shè)置在端點，所述的含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式如下：
所述的nl、n2、n3分別為大于等于1的正整數(shù)，表示各分支鏈的聚合度，各個聚乙二醇 分支鏈鏈段的數(shù)均分子量在5000-100000之間；所述的R為源自醇類化合物的烷基；所述 的X為修飾L-門冬酰胺酶的活性功能基團；所述的L-門冬酰胺酶亞基上的1-8個伯氨基 被相同數(shù)目的PEG修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于：所述的 L-門冬酰胺酶亞基上的1-3個伯氨基被相同數(shù)目的PEG修飾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于：Y型聚乙 二醇的分子量為5kDa_40kDa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于：活性功能 基團選自氰基、羧基、氨基、醛基、琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰 亞胺酯中的一種；作為再優(yōu)選，上述的活性功能基團選用琥珀酸基碳酸酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于：R基選用 甲基、乙基或丙基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，其特征在于：所述的 L-門冬酰胺酶是天然或重組的。
7. -種制備上述權(quán)利要求1~6任意一項權(quán)利要求所述的聚乙二醇共價修飾的L-門 冬酰胺酶的方法，該方法中含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇與L-門冬酰胺酶發(fā)生共 價結(jié)合反應(yīng)的重量比例為1 :〇. 5~20,緩沖液的pH值為4-10,反應(yīng)溫度為4°C~37°C，反 應(yīng)時間為2~36小時；在修飾反應(yīng)結(jié)束后，分離純化采用離子交換層析，凝膠過濾層析和 Hitrap-Desalting 柱脫鹽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：離子交換層析使用的介質(zhì)為陰離子 交換層析或陽離子交換層析；離子交換層析介質(zhì)骨架的為聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖 型、瓊脂糖型或球狀纖維素型；作為優(yōu)選，離子交換層析使用的介質(zhì)為QSepharose系列、 SP Sepharose 系列，DEAE Sepharose 系列、CM Sepharose 系列，DEAE Sephacel 系列、CM Sephacel 系列，QAE Sephadex 系列、SP Sephadex 系列，DEAE Sephadex 系列、CM Sephadex 系列，SOURCE Q系列或SOURCE S系列；作為再優(yōu)選，選擇使用SOURCE Q系列，洗脫方式采 用梯度洗脫。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：凝膠過濾層析使用的介質(zhì)為葡聚糖 型、瓊脂糖型或球狀纖維素型；優(yōu)選采用Sepharose系列、Sephacel系列、Sephadex系列、 Superdex系列和Superose系列中的一種混多種混合；作為再優(yōu)選，使用Sephacryl-300作 為層析介質(zhì)進行分離。
10.權(quán)利要求1~6任意一項權(quán)利要求所述的聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶用于 制備治療單細(xì)胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增多癥以及慢性髓細(xì)胞白血病 的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾藥物，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶及其制備方法和應(yīng)用。聚乙二醇共價修飾的L-門冬酰胺酶，該L-門冬酰胺酶采用支鏈化聚乙二醇對其進行修飾；支鏈化聚乙二醇為含單一活性功能基團的Y型聚乙二醇，并且單一活性功能基團設(shè)置在端點，各個聚乙二醇分支鏈鏈段的數(shù)均分子量在5000-100000之間；所述的R為源自醇類化合物的烷基；所述的L-門冬酰胺酶亞基上的1-8個伯氨基被相同數(shù)目的PEG修飾。本發(fā)明用支鏈化的聚乙二醇進行修飾，降低了藥物失活的比例，進一步減少藥物在生物體內(nèi)失活的程度，不僅降低了制作藥物的成本，還減少了臨床給藥的頻率和次數(shù)，將為患者減輕藥費負(fù)擔(dān)，帶來福音。
【IPC分類】A61K38-50, A61K47-48, A61P35-02, C12N9-82, A61P35-00, C12N9-96
【公開號】CN104745564
【申請?zhí)枴緾N201510140588
【發(fā)明人】韓雯, 劉翔, 張加慧, 封小燕
【申請人】杭州北斗生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月27日