一種牡丹皮提取物及其在制備防治肺纖維化藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牡丹皮提取物及其在制備防治肺纖維化 藥物中的用途。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 肺纖維化是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性疾病。肺纖維化確診后平均存 活時間為3年，或出現(xiàn)臨床癥狀后，存活5年。在肺纖維化的終末階段，肺移植是唯一有效 的治療方法，但是供體的缺乏、昂貴的醫(yī)療費用等限制了肺移植的應(yīng)用，提高藥物的療效一 直是廣大醫(yī)藥工作者追求的目標(biāo)。隨著對肺纖維化發(fā)病學(xué)研宄的日益深入，已經(jīng)證實細(xì)胞 外基質(zhì)（ECM)中膠原蛋白、彈性纖維以及蛋白糖類的過量堆積是其特征性的病理組織學(xué)變 化。目前，認(rèn)為成纖維細(xì)胞的增殖和活化是ECM大量形成和堆積的主要原因，肺泡上皮細(xì)胞 的間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞的增生是成纖維細(xì)胞的主要來源。在有害刺激、細(xì)胞因子等的作用 下，成纖維細(xì)胞活化，分泌大量的ECM。盡管對肺纖維化的發(fā)病機制有了更深入的認(rèn)識，但臨 床治療仍然不佳。
[0003] 目前，治療肺纖維化的藥物主要有糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑和細(xì)胞毒類藥物。盡 管少部分接受糖皮質(zhì)激素治療的患者顯示出一定的療效，但沒有完全或持續(xù)緩解者，副作 用嚴(yán)重、長期療效不能確定等問題制約了這些藥物的長期應(yīng)用。中藥能夠在一定程度上改 善肺纖維化終末期患者的生活質(zhì)量，但也存在藥理作用機制和作用靶點不明確問題，阻礙 了其在臨床的選擇應(yīng)用。因此，阻斷成纖維細(xì)胞增殖、活化，抑制膠原等ECM，作用機制和靶 點明確的藥物開發(fā)，具有重要的意義。
[0004] 牡丹皮是毛茛科牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.)根皮，是常用的一種中藥材 之一。牡丹皮苦、辛，微寒。入歸心、肝和腎經(jīng)。具有清熱涼血，活血化瘀的功效。臨床用于 治療溫毒發(fā)斑、吐血妞血、癰腫瘡瘍、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲損傷等癥。牡丹皮及其提取物的藥理作 用復(fù)雜，具有抗心肌缺血、抗血栓形成、降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧 化、免疫調(diào)節(jié)、改善肝損傷等藥理作用。在牡丹皮及其提取物、有效成分對肺的藥理學(xué)研宄 中，目前發(fā)現(xiàn)丹皮酚誘導(dǎo)某些肺腫瘤細(xì)胞的凋亡。在牡丹皮有關(guān)的纖維化的研宄中，目前發(fā) 現(xiàn)丹皮酚抑制腎小球系膜細(xì)胞合成與分泌纖維連接蛋白（FN)和膠原蛋白；抑制腹膜成纖 維細(xì)胞的增殖。但是，截至目前，尚無牡丹皮提取物、有效部位和有效成分防治肺纖維化的 相關(guān)研宄報道。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種牡丹皮提取物及其在制備防治肺纖維化藥 物中的用途。實驗表明，牡丹皮提取物能夠有效抑制肺泡上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺 成纖維細(xì)胞活化，從而抑制肺纖維化的形成和發(fā)展，使其在制備防治肺纖維化藥物中得到 新的用途。
[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] 本發(fā)明提供一種牡丹皮提取物，所述牡丹皮提取物是通過以下方法提取而得：
[0008] a、以牡丹皮為原材料，加入占牡丹皮原材料重量6~20倍的果膠酶水溶液，然后 置于閃式提取器中，在室溫條件下提取〇. 5~5min ;提取后的藥材及溶液中加入酸調(diào)節(jié)所 得提取溶液的pH值至3. 8~5. 7,調(diào)節(jié)后水浴加熱至37~60°C進行酶解，酶解1~5小時， 得到酶解液；
[0009] b、采取水蒸氣蒸餾法收集占酶解液總重量1/4~1/2的蒸餾液，所得蒸餾液在 2~4°C條件下冷藏放置24小時，在此條件下進行過濾，所得結(jié)晶體為丹皮酚；
[0010] c、步驟b蒸餾后所剩提取液及藥渣進行過濾，過濾后所得藥渣待用，所得濾液在 50°C條件下減壓濃縮至比重為I. 1~1.2的浸膏，然后采用sevage法脫蛋白，脫除蛋白后 加入乙醇使浸膏含醇量體積百分比達(dá)到75~85%，靜置12h ;靜置后過濾除去上部乙醇溶 液，所得乙醇溶液待用；除去乙醇溶液后得到底部沉淀物，采用無水乙醇洗滌所得沉淀物， 除去其中的水分，再用丙酮洗滌除去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗滌除去沉淀 物中的丙酮，然后在30~50°C下減壓干燥，得到牡丹皮多糖；
[0011] d、將步驟c所剩待用藥渣加入待用的乙醇溶液中，在40~60°C條件下浸泡0. 5~ 2小時，然后過濾，所得濾液在50°C條件下減壓濃縮至比重為I. 1~1. 2的浸膏，所得浸膏 過大孔吸附樹脂柱進行純化，得到牡丹皮總苷；
[0012] e、將步驟b所得丹皮酚、步驟c所得牡丹皮多糖和步驟d所得牡丹皮總苷混合，得 到牡丹皮提取物。
[0013] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物，所述果膠酶水溶液的制備方法為：稱取果膠酶，加入 果膠酶重量8~25倍的蒸餾水進行充分溶解，然后加入飲用水至果膠酶質(zhì)量百分濃度為 0. 5~2. 5%，得到果膠酶水溶液。
[0014] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物，步驟a中所述加入酸調(diào)節(jié)所得提取溶液的pH值至 3. 8~5. 7,其中所述酸為鹽酸、硫酸和醋酸中的至少一種。
[0015] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物，步驟b中所得丹皮酚的純度多90% ;步驟c中所得牡 丹皮多糖的純度彡80% ;步驟d中所得牡丹皮總苷的純度彡80%。
[0016] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物，步驟d中所述浸膏過大孔吸附樹脂柱進行純化，其中 所述大孔吸附樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂或D-101型大孔吸附樹脂。
[0017] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物，步驟e得到的牡丹皮提取物中丹皮酚、總苷和多糖的 混合比例為1:2~4:4~8。
[0018] -種牡丹皮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的用途。
[0019] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的用途，牡丹皮提取物在制 備防治肺纖維化藥物中應(yīng)用時，采用牡丹皮提取物或以牡丹皮提取物為主要成分的藥物組 合物。
[0020] 根據(jù)上述的牡丹皮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的用途，所述牡丹皮提取物 或以牡丹皮提取物為主要成分的藥物組合物，按照藥學(xué)常規(guī)方法制成膠囊劑、片劑、散劑、 顆粒劑、丸劑、滴丸、口服液、糖漿劑或酒劑。
[0021] 為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，以下結(jié)合牡丹皮提取物的藥理試驗實例及 其結(jié)果，說明牡丹皮提取物在制備防治肺纖維化疾病藥物中的新用途。
[0022] 實驗例1 :牡丹皮提取物對肺泡上皮細(xì)胞（A549)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
[0023] 1)材料與方法：A549細(xì)胞來自于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。 RPM1-1640 培養(yǎng)基（Beijing Solarbio Science&Technology Co. Ltd)、胎牛血清（浙 江天杭生物科技股份有限公司）、Human TGF-|3 1(Pepro Tech InchE-f1?粘蛋白抗體 (E-cadherin Antibody;貨號 BA0475)、I 型膠原蛋白抗體（C0L1A1 (Collagen I )Antibody; 貨號BA0325)、即用型SABC-POD (小鼠 IgG)試劑盒（貨號SA1021)、即用型SABC-POD (兔 IgG)試劑盒（貨號SA1022)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。牡丹皮提取物，丹皮 酚、總苷和多糖按照質(zhì)量比例1:3:6混合均勻，備用。
[0024] 在24孔培養(yǎng)板的每個孔中加入玻璃片，然后在每個玻璃片上加入IX IO4細(xì)胞。將 培養(yǎng)板放入5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞貼壁于玻璃片。2h取出培養(yǎng)板，更換不含血清的 RPM1-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8h。吸除培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液；分為5組，即正常組（加入 RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、TGF- β 1刺激組簡稱TGF- β 1組（加入含有5ng/mL TGF- β 1的 RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、藥物干預(yù)組（加入含有5ng/mL TGF-β 1的RPM1-1640完全培養(yǎng) 液，培養(yǎng)液分別含有50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL的牡丹皮提取物），繼續(xù)培養(yǎng)48h。
[0025] E-cadher in和Co 11 agen-I檢測：取出細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入4 %的多聚甲醛液， 固定，然后取出孔中的玻璃片，分別進行E-cadherin和Collagen-I免疫細(xì)胞化學(xué)染色。分 析上述蛋白表達(dá)，結(jié)果以陽性表達(dá)的累積光密度數(shù)值（IOD)/細(xì)胞的面積（Area)表示。
[0026] 2)實驗結(jié)果：詳見表1。肺泡上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征性表現(xiàn)，是細(xì)胞特異性 蛋白表達(dá)的變化，即上皮細(xì)胞特異性蛋白E-cadherin表達(dá)量的減少以及間質(zhì)細(xì)胞特異 性蛋白Collagen-I表達(dá)量的增加。與正常組比較，TGF-β 1組E-cadherin顯著降低 (Ρ〈0· 01)，Collagen-I 顯著升高（Ρ〈0· 05)。與 TGF-β 1 組相比，200 μ g/m