專利名稱：：陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：特發(fā)性肺纖維化(ldiopathicPulmonaryFibrosis,IPF)是一種原因不明、以進(jìn)行性呼吸困難為突出臨床表現(xiàn)的局限于肺部的一種特殊類型的慢性間質(zhì)性肺炎，其病理改變?yōu)槠胀ㄐ烷g質(zhì)性肺炎，以肺泡上皮損傷、成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)增殖，并形成成纖維細(xì)胞灶(FibroblastFoci)為特征。胸部影像學(xué)表現(xiàn)為彌漫性網(wǎng)狀、網(wǎng)結(jié)節(jié)陰影或蜂窩樣改變，以中下肺野周邊胸膜下為重，而磨玻璃樣改變較少。肺功能呈限制性通氣功能障礙和/或彌散功能受損，導(dǎo)致低氧血癥。近年來，隨著對(duì)肺間質(zhì)性疾病研究的逐步深入，肺纖維化的發(fā)現(xiàn)率有明顯上升趨勢(shì)。IPF發(fā)病機(jī)制未完全闡明，至今也仍然沒有有效的藥物能逆轉(zhuǎn)IPF的自然過程及其終末結(jié)局。目前治療藥物仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物為主，但療效均不理想，對(duì)人體具有明顯的毒副作用。如糖皮質(zhì)激素，有效率僅10%~30%，甚至有報(bào)道無效，長(zhǎng)期使用可引起嚴(yán)重的副作用。肺移植可以作為肺纖維化終末階段，即蜂窩肺階段的唯一有效治療方法，但是由于適當(dāng)?shù)墓w的缺乏、昂貴的醫(yī)療費(fèi)用及免疫排斥等副作用，使它的開展受到限制。IPF預(yù)后甚差，確診后平均存活24年，5年生存率為30%~50%，嚴(yán)重危害病人的健康和生存。因此，積極尋找能有效阻斷膠原沉積，延緩纖維化進(jìn)程，并具有毒副作用小、長(zhǎng)期服用安全可靠等特點(diǎn)的治療方藥，具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。陳皮為蕓香科植物橘(C&mr幼'cw/afeBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮氣香，味辛、苦，性溫，入脾、肺經(jīng)。陳皮為常用傳統(tǒng)中藥，采用湯劑入藥方式，具有理氣健脾、燥濕化痰之功效，主要用于治療呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病。研究表明陳皮提取液具有抗過敏、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤的作用及免疫調(diào)節(jié)作用，陳皮提取物能抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及I型膠原分解。在陳皮及其有效成份對(duì)肺的藥理學(xué)研究中，目前僅發(fā)現(xiàn)陳皮揮發(fā)油有刺激性祛痰作用，陳皮水提取物及揮發(fā)油對(duì)離體豚鼠支氣管平滑肌具有舒張作用，尚無陳皮對(duì)肺纖維化及肺成纖維細(xì)胞作用的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供陳皮提取物在制備治疔肺纖維化藥物中的應(yīng)用，可以有效減少膠原沉積，延緩纖維化進(jìn)程。所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流后得到的提取物或陳皮經(jīng)水蒸汽蒸餾得到的揮發(fā)油。所述溶媒一般為水、乙醇或異丙醇。其中乙醇優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為50%-100%的乙醇，更優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇。所述陳皮提取物按下述方法制得(1)將干燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面l2cm，加熱，回流1小時(shí)，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合并濾液，將濾液減壓濃縮，干燥得到陳皮水提物干粉。其中所述干燥可以為公知的各種方式，如風(fēng)干、60度以下烘干或冷凍干燥。作為本發(fā)明的改進(jìn)，所述揮發(fā)油為用水蒸汽蒸餾后用有機(jī)溶劑萃取，使有機(jī)溶劑揮發(fā)后得到的揮發(fā)油。所述有機(jī)溶劑為乙醚或石油醚。本發(fā)明中利用水、乙醇等溶媒提取，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，或利用水蒸氣蒸餾法得到揮發(fā)油，成功地得到了陳皮提取物，將之作為治療肺纖維化的藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明可以降低與纖維化緊密相關(guān)的生物指標(biāo)血清及肺中羥脯氨酸含量、肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(31蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平，有效抑制人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖，延緩肺泡炎的產(chǎn)生和肺纖維化進(jìn)程。同時(shí)陳皮為常用傳統(tǒng)中藥，毒副作用小、長(zhǎng)期服用安全可靠。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:陳皮提取物制備具體制備方法如下①將干燥陳皮粉碎成粗粉，加適量的蒸餾水，浸過藥材表面約l2cm，加熱，回流1小時(shí)，趁熱過濾。在藥渣中再加適量蒸餾水同法加熱回流，趁熱過濾，合并濾液。②濾液減壓濃縮，冷凍干燥得到陳皮提取物干粉，以下簡(jiǎn)稱水提物。實(shí)施例2:陳皮提取物制備具體制備方法如下①將干燥陳皮粉碎成粗粉，加適量的75%乙醇，浸過藥材表面約12cm，加熱，回流1小時(shí)，趁熱過濾。在藥渣中再加適量75%乙醇同法煎煮，合并濾液。②濾液減壓濃縮，冷凍干燥得到陳皮提取物干粉，以下簡(jiǎn)稱醇提物。實(shí)施例3:陳皮提取物制備具體制備方法如下干燥陳皮粉碎成粗粉，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油反復(fù)多次，合并蒸餾液并用乙醚萃取，收集乙醚液，揮干，得到陳皮提取物，以下簡(jiǎn)稱揮發(fā)油。實(shí)施例4:陳皮水提物、醇提物和揮發(fā)油對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖抑制作用實(shí)驗(yàn)在DEME培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)中加入10%小牛血清和1%青霉素G鉀和鏈霉素制成培養(yǎng)液，取2-3代匯合度80%的HELF細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用上述培養(yǎng)液制成濃度為5xl044(個(gè)/毫升)細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100微升，置于37'C，5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)。待細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)延展良好后加入含有不同濃度的待測(cè)藥的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)，其中，藥物濃度為藥物與全體細(xì)胞培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比，陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松為目前的臨床使用的肺纖維化治療藥，其加入量為l微摩爾。利用MTT法(波長(zhǎng)570nm)測(cè)定吸光值，計(jì)算抑制率[g卩(對(duì)照組吸光值一藥物組吸光值)/對(duì)照組吸光值]，結(jié)果如下-抑制率(％)待測(cè)藥300毫克/毫升150毫克/毫升15毫克/毫升毫克/毫升0.5毫克/毫升0毫克/毫升1微摩爾對(duì)照_—一一_0.0±10.7—潑尼松_—————19.8士2.3*水提物—290,7±7.1**—104.0士22.2"一0.9士5.218.6±4.1*16.6±4.6*——醇提物15.9±7.529.2±2.5*51.0±3.7*49.7±2.1*37.5±4.3*——揮發(fā)油46.6±1,1*49.7±5.8*54.5±0.5*44.2±2.7*41.7±6.7*——"一"表示對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖具有促進(jìn)作用。*尸<0.05，**P<0.01。從上表可以看出陳皮水提物、醇提物和揮發(fā)油對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖均有抑制作用，以乙醇提取物和揮發(fā)油作用為強(qiáng)。實(shí)施例5:陳皮醇提物對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的防治作用實(shí)驗(yàn)將35只SD大鼠編號(hào)、稱重后，隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組，每組7只。A組正常組。B組對(duì)照組。C組潑尼松組，建模后次日起每天用潑尼松5毫克/公斤，灌胃。D組陳皮醇提物組，建模后次日起每天用陳皮乙醇提物100毫克/公斤，灌胃。E組陳皮醇提物組，建模后次日起每天用陳皮乙醇提物200毫克/公斤，灌胃。其中，B-E組按照下列方法建模，步驟如下用苯巴比妥腹腔注射將大鼠麻醉后仰臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，固定大鼠頭部和四肢，輕輕拉出舌，壓迫舌腹，在額鏡直視下，窺見聲門，趁大鼠吸氣瞬間，迅速將與注射器相連的頂端磨鈍的9號(hào)腰穿針(藥液預(yù)先裝在注射器內(nèi))插入約達(dá)氣管分叉處，緩緩注入博萊霉素溶液，用量為0.2毫升/100克。注藥完畢將動(dòng)物直立、旋轉(zhuǎn)數(shù)分鐘，盡量使藥物在肺內(nèi)分布均勻。A組按上述步驟一次性氣管內(nèi)注射生理鹽水0.2毫升/100克，作為正常組。大鼠清醒后常規(guī)分籠飼養(yǎng)。各組大鼠均于實(shí)驗(yàn)第28天，灌胃給藥2小時(shí)后麻醉，腹主動(dòng)脈取血后處死，制備血清，并行肺組織取樣，進(jìn)行下列項(xiàng)目的檢測(cè)l)一般情況觀察分別觀察各組大鼠造模前后及給藥干預(yù)前后的-一般狀態(tài)，包括體重情況、體毛情況、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、呼吸及死亡情況等。結(jié)果見下表(大鼠體重，單位為克)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*尸<0.05，**尸<0.01。由于氣管內(nèi)注入博萊霉素造成大鼠機(jī)體呼吸功能障礙，繼發(fā)引起機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收出現(xiàn)嚴(yán)重障礙，體內(nèi)分解代謝大于合成代謝，而使機(jī)體出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢。大鼠早期出現(xiàn)體重下降(第一、第二周)。潑尼松為目前臨床使用抗肺纖維化治療藥，該藥雖能提高食欲，但因其有促進(jìn)蛋白質(zhì)分解、抑制其合成及抑制免疫而導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、肌肉消瘦等副作用，故潑尼松組大鼠體重下降尤為明顯。結(jié)果表明第7天時(shí)對(duì)照組、潑尼松組的體重顯著低于正常組(尸<0.01);而醇提取物100和200毫克/公斤/天劑量組體重與對(duì)照組比較有顯著性增加(J°<0.05)，陳皮乙醇提取物200毫克/公斤/天組在第二周還可以顯著增加大鼠的體重(P<0.05)。與潑尼松相比，陳皮乙醇提取物沒有潑尼松的副作用，可以顯著改善由博萊霉素造成的大鼠體重下降。2)血清和肺組織羥脯氨酸含量血清和肺組織羥脯氨酸含量用樣本堿水解法及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*P<0.05，尸<0.01。肺纖維化的特點(diǎn)是肺中膠原蛋白合成的速度大于降解的速度，膠原纖維顯著增多，最終導(dǎo)致膠原的逐漸積累。羥脯氨酸是組成機(jī)體膠原蛋白的一種特有的氨基酸，除彈性蛋白含少量羥脯氨酸(約1%)外，幾乎所有羥脯氨酸都存在于膠原中，故組織中羥脯氨酸含量能反映器官纖維化的程度。結(jié)果表明陳皮乙醇提取物200毫克/公斤/天組(E)血清及肺中羥脯氨酸含量顯著低于對(duì)照組，陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天組(D)血清羥脯氨酸含量與對(duì)照組比較無顯著性差異，但肺組織羥脯氨酸含量與對(duì)照組比較有顯著性差異。顯示了陳皮乙醇提取物具有降低羥脯氨酸含量的作用，從而降低纖維化的程度。3)肺組織病理學(xué)觀察右肺常規(guī)固定后，用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)沖洗、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋，制成蠟塊，4微米連續(xù)切片，行HE(蘇木精-伊紅)及VanGieson(VG)染色，觀察肺組織病理學(xué)變化，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡觀察并照像，確定肺泡炎和肺纖維化的程度，并將肺泡炎和肺纖維化分級(jí)及計(jì)算積分，進(jìn)行病理半定量分析。結(jié)果見下表。組別肺泡炎纖維化-+卄4+f積分-+卄積分正常組A2000.3±0,5**1100.4±0.8**對(duì)照組B00432.4±0.500162.9±0.4潑尼松組C0401.4±0.5**0221.9±0.9*醇提物組D011.7±0.8*02411.9±0.7*醇提物組E23201.0±0.8"13301.3±0.8***尸<0.05，**P<0.01。肺部病理形態(tài)的改變是最為直觀的療效衡量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組肺泡間隔明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，重度纖維組織增生，可見大量成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維，胸膜下肺泡結(jié)構(gòu)破壞紊亂，肺泡隔變薄或斷裂，且對(duì)照組病理積分較正常組高，存在顯著性差異。結(jié)果表明陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天組(D)及200毫克/公斤/天組(E)肺泡炎積分和肺纖維化積分顯著低于對(duì)照組，對(duì)肺纖維化具有防治作用。4)肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子pi(TGF-PO蛋白及信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)水平組別蛋白TGF-^信使核糖核酸面積(平方微米)積分光密度面積(平方微米)積分光密度正常組A359.79±20.73**56.55±6.76"209.72±28.23*59.10±6.31*對(duì)照組B567.88±88.8075.05±7.41367.34±46.5577.24±1.92潑尼松組c472.73±39.83*65.44±8.42*279.77±26.95*71.55±2.00*醇提物組D461.19±72.00*64.54±2.00*283.58±26.35*72.32±3.47*醇提物組E368.07±63.72*62.08士2.92*267.75±21.54*69.26±6.01***戶<0.05，**P<0.01。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(31是已知作用很強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，在肺纖維化發(fā)生的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著重要地位，對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要；該因子在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中持續(xù)上調(diào)，它可以趨化并促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，刺激成纖維細(xì)胞分泌前膠原。結(jié)果表明陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天(D)及200毫克/公斤/天組(E)可以顯著降低肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平。本結(jié)果說明陳皮乙醇提取物可以通過降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(31蛋白及信使核糖核酸兩個(gè)方面的表達(dá)發(fā)揮抑制肺纖維化的功效。權(quán)利要求1.陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流后得到的提取物或陳皮經(jīng)水蒸汽蒸餾得到的揮發(fā)油。3.如權(quán)利要求2所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述溶媒為水、乙醇或異丙醇。4.如權(quán)利要求3所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述乙醇為質(zhì)量百分比濃度50%-100%的乙醇。5.如權(quán)利要求4所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述乙醇為質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇。6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述陳皮提取物按下述方法制得(1)將下燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面12cm，加熱，回流1小時(shí)，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合并濾液，將濾液減壓濃縮，干燥得到陳皮提取物干粉。7.如權(quán)利要求6所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述干燥為風(fēng)十、60度以下烘干或冷凍干燥。8.如權(quán)利要求2所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于揮發(fā)油為用水蒸汽蒸餾后用有機(jī)溶劑萃取，使有機(jī)溶劑揮發(fā)后得到的揮發(fā)油。9.如權(quán)利要求8所述的陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述有機(jī)溶劑為乙醚或石油醚。全文摘要本發(fā)明提供陳皮提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，可以有效減少膠原沉積，延緩纖維化進(jìn)程。所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流后得到的提取物或陳皮經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油。所述陳皮提取物按下述方法制得(1)將干燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面1～2cm，加熱，回流1小時(shí)，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合并濾液，將濾液減壓濃縮，干燥得到陳皮提取物干粉。本發(fā)明可以降低與纖維化緊密相關(guān)的生物指標(biāo)血清及肺中羥脯氨酸含量、肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平，有效抑制人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖，延緩肺泡炎的產(chǎn)生和肺纖維化進(jìn)程。文檔編號(hào)A61K36/752GK101554422SQ20091002793公開日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日發(fā)明者周賢梅申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)院