專利名稱：：丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。技術(shù)背景肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種原因不明，以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致肺泡、肺間質(zhì)纖維化，最終可引起呼吸衰竭的疾病。發(fā)病率約為5/10萬，近年來有增高趨勢。PF確診后平均存活期為2-4年，5年生存率為50-70%，現(xiàn)有的治療手段并沒有使患者的生存率有所改善。致肺纖維化的始動因素目前還不清楚，有人認(rèn)為可能與遺傳易感性、病毒感染、免疫功能有關(guān)。目前比較公認(rèn)的理論涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及脂質(zhì)過氧化作用等方面。根據(jù)肺纖維化的病理特點(diǎn)，其病理過程大致分為三個階段，第一階段是致病因子對肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的彌漫性損害，啟動炎癥免疫反應(yīng)；第二階段是多種炎性細(xì)胞參與，釋放各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)擴(kuò)大組織損傷并引起間質(zhì)增生；第三階段是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖以及膠原和其它細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)的代謝紊亂以反饋方式使炎性損傷和增生反應(yīng)加重，最終導(dǎo)致正常功能組織被取代和改建。在此過程中，肺炎癥細(xì)胞(主要為單核巨噬細(xì)胞)、肺上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肺間質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞)通過分泌細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等生物活性物質(zhì)，發(fā)揮直接或間接作用。實際上這三個過程同時存在、互相促進(jìn)，不代表時間上的分隔和疾病本身的發(fā)展順序。在參與肺纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)化生長因子e(TransforminggrowthfactorP，TGFe)是研究最深入、最重要的細(xì)胞因子。肺纖維化動物模型以及人類特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)中，TGFP水平都是升高的，TGFe抗體及TGFP受體拮抗劑都能減弱博萊霉素所致的肺內(nèi)膠原沉積。在肺纖維化發(fā)展中，肺巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞可能是TGFe的主要來源。轉(zhuǎn)化生長因子e1(Transforminggrowthfactore1，TGF01)在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對成纖維細(xì)胞具有趨化作用，并能刺激未成熟成纖維細(xì)胞的生長，損傷部位出現(xiàn)的TGFel能夠從周圍組織中募集成纖維細(xì)胞并能刺激未成熟成纖維細(xì)胞增生和分化，促進(jìn)膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖等在ECM中沉積，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。膠原纖維(collagenousfiber)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其生化成分是膠原蛋白(collagen,簡稱膠原)，目前已發(fā)現(xiàn)至少有l(wèi)l種不同的膠原蛋白。I型和III型膠原稱為間質(zhì)膠原，分布廣泛，也是肺內(nèi)主要的間質(zhì)型膠原。羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4%，其他除彈性蛋白含有少量HYP(約1%)夕卜，均不含HYP。因此組織中HYP含量可作為膠原組織代謝的重要指標(biāo)。近年來脂質(zhì)過氧化成為肺纖維化的研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，接觸二氧化硅和石棉的工人，其巨噬細(xì)胞有脂質(zhì)過氧化損傷，從而被激活釋放致纖維化因子，導(dǎo)致肺纖維化。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物。如醛基(丙二醛，malondialdehyde,MDA)、酮基、羥基、羰基以及新的自由基等。因此MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在肺纖維化的治療上，目前公認(rèn)療效確切的糖皮質(zhì)激素，早期應(yīng)用效果好，能夠抑制炎癥及免疫過程。中晚期則療效不佳，且長期應(yīng)用副作用大，嚴(yán)重影響機(jī)體免疫功能，增加繼發(fā)感染和呼吸衰竭的可能性。臨床資料顯示僅有30%以下的患者激素治療有效。因此國內(nèi)學(xué)者多用中醫(yī)中藥來治療肺纖維化，而且已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但實驗研究中，復(fù)方多限于幾味活血化瘀藥，且藥味過多也不利于藥理機(jī)制的研究，目前發(fā)現(xiàn)對肺纖維化有一定治療效果的中藥研究主要集中于(l)抗自由基損傷；(2)抑制炎性因子的釋放，發(fā)揮抗炎性損傷作用；(3)影響膠原代謝過程，從而減少纖維蛋白的形成；(4)影響機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，降低應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度。隨著中藥單體活性成分的提取分離技術(shù)研究的進(jìn)一步深入，從天然產(chǎn)物中尋找藥理作用明確的活性單體，進(jìn)一步闡明不同單體或有效部位的作用機(jī)理，針對肺纖維化發(fā)病的多層面特點(diǎn)進(jìn)行治療，發(fā)揮中藥的多靶位治療優(yōu)勢，已成為目前治療肺纖維化的一個發(fā)展方向。丹參總酚酸(salvianolicacids，Sals)是從唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBuiige)中分離得到的水溶性部位，是一類多酚羥基化合物，含有丹參酚酸A，丹參酚酸B和迷迭香酸等成分。現(xiàn)代實驗研究及臨床應(yīng)用均表明，丹參在抗肺纖維化中作用確切、效果顯著，其防治肺纖維化的作用機(jī)制與氧自由基清除有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)治療組動物肺系數(shù)，羥脯氨酸(HYP)、表面活性物質(zhì)含量，成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)活性均明顯低于模型組，認(rèn)為其作用機(jī)制與抗氧化性損傷、維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定及抑制成纖維細(xì)胞向膠原纖維的轉(zhuǎn)化有關(guān)。文獻(xiàn)中，關(guān)于丹參對肺纖維化影響的研究，采用的是丹參水煎液、丹參注射液(丹參酮)及丹參脂質(zhì)體。丹參總酚酸具有活血化瘀、抗氧化、降血脂及抗肝纖維化形成等多種作用。但是，丹參總酚酸作為丹參的有效部位，是否具有抗肺纖維化的作用，至今未見報導(dǎo)。博萊霉素(bleomycin,BLM)是臨床上一種常用的腫瘤化療藥物，對多種類型的腫瘤均具有較好的治療效果，但是絕大多數(shù)病人會在使用過程中產(chǎn)生劑量依賴性的肺纖維化，因為在科研中BLM廣泛用于肺纖維化動物模型的制備。向嚙齒類動物氣管內(nèi)注入BLM，可導(dǎo)致肺泡上皮受損，炎性細(xì)胞滲出、成纖維細(xì)胞增生及膠原沉積，BLM所致早期肺損傷無論是在病理組織學(xué)上還是生理學(xué)上均與人類纖維化肺部疾病相似。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明通過博萊霉素復(fù)制小鼠、大鼠肺纖維化動物模型，首次選用丹參總酚酸作為治療藥物，研究肺纖維化動物肺組織的病理學(xué)改變，觀察丹參總酚酸對肺纖維化動物模型的治療作用，從而為丹參總酚酸治療肺纖維化提供實驗依據(jù)。圖1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數(shù)的影響(X土S，n=10);圖2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；±s，n=10);圖3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFP1陽性細(xì)胞數(shù)的影響(x±s，n=10);圖4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFe1IOD的影響(；土s,n=10);圖5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIOD的影響(；±s,n=10);圖6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIIIOD的影響(；±s,n=10);圖7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響(；±s，n=10);圖8丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺系數(shù)的影響(S±s，n=6);圖9丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；土s，n=6);圖10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFe1陽性細(xì)胞數(shù)的影響(x±s，n=6);圖11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFe1IOD的影響(；土S,11=6);圖12丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIOD的影響(x±s，n=6);圖13丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIIIOD的影響(x±s，n=6);圖14丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(^士s，11=6);圖15丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(；±s,n=6);圖16s，n=6);丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(；士丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響(.圖17s，n=6);圖18n=6);丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響P土s，圖19第圖20第圖21第圖22第100;圖23X100;圖24構(gòu)X8000;圖25第28天大鼠肺組織病理改變—丹參總酚酸小劑量組28天HE第28天大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變一正常對照組28天超微結(jié)第28天大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變一模型組28天超微結(jié)構(gòu)X5000;圖26第28天大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變一醋酸潑尼松組28天超微結(jié)構(gòu)X10000;圖27第28天大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變一丹參總酚酸大劑量組28天超微結(jié)構(gòu)X8000;圖28第7天大鼠肺組織TGFP1的表達(dá)一模型組7天TGFP1的表達(dá)SABCX200;圖29第7天大鼠肺組織TGF01的表達(dá)一丹參總酚酸小劑量組7天TGFP1的表達(dá)SABCX200;圖30第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)一模型組28天CollagenI的表達(dá)SABCX200;圖31第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)一丹參總酚酸大劑量組28天CollagenI的表達(dá)SABCX200;圖32第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)一模型組28天CollagenIII的表達(dá)SABCX200;圖33第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)一丹參總酚酸大劑量組28天CollagenIII的表達(dá)SABCX200。實施例第一部分博萊霉素致肺纖維化小鼠病理觀察及丹參總酚酸干預(yù)作用研究材料與方法材料1、實驗動物昆明種小鼠，180只，雌雄各半，體重18-22g，清潔級，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號XCYK(蘇)2002-0008,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2002-0037.2、藥物與試劑2.1藥物博萊霉素A5(BLM),日本化藥株式會社，產(chǎn)品批號640110,藥品進(jìn)口注冊證號H20040205;4%水合氯醛；丹參總酚酸，蘇州中藥研究所植化室提供；醋酸潑尼松片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號32022681;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657.2.2試劑羥脯氨酸含量測定試劑，南京建成生物制劑公司購買。兔多克隆抗體TGF01、CollagenI、CollagenIII，即用型SABC試劑盒，DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。3、儀器光學(xué)顯微鏡，OLYMPUSCX31;分光光度計722型，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，出廠編號7070309047;離心機(jī)，80-2型，上海手術(shù)器械廠。一、方法1、分組及造模昆明種小鼠，180只，稱重，編號，隨機(jī)分為正常對照組，模型組，醋酸潑尼松組(6.67mg.kg-l.d-l)，丹參總酚酸(160mg'kg-l'd-l)大劑量組，丹參總酚酸(80mg*kg-l'd-l)中劑量組，丹參總酚酸(40mg'kg-l'd-l)小劑量組，每組30只。實驗小鼠用4%水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉后，取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組、醋酸潑尼松組、丹參總酚酸大劑量組、丹參總酚酸中劑量組和丹參總酚酸小劑量組于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺緩緩注入BLM(5mg/kg)，正常對照組注入等體積生理鹽水。注藥后縫合皮膚，立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)3-5min,使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，手術(shù)前一日及術(shù)后三天連續(xù)肌肉注射青霉素(0.8萬U-只-1-天-1)4天。各治療組造模后次日開始灌服給藥，正常對照組與模型組灌服蒸餾水。2、肺系數(shù)(pulmonaryindex)各組動物分別于實驗第7、14、28天經(jīng)頸椎"脫舊"法處死10只，分離出雙肺，稱重，根據(jù)公式肺重(mg)/體重(g)[18，計算肺系數(shù)。3、組織病理學(xué)觀察取右肺，4%中性福爾馬林固定，按常規(guī)病理學(xué)方法包埋、切片。將病理切片進(jìn)行HE染色，然后根據(jù)Szaopiel等19方法將肺泡炎和肺纖維化的程度分為四級0級，無明顯改變；1級，輕度改變，病變范圍小于全肺的20%;2級，中度改變，病變范圍占全肺的20%-50%;3級，重度改變，病變范圍占全肺的50%以上。4、免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)染色步驟主要參照試劑公司試劑盒說明書進(jìn)行，對切片行高溫高壓處理代替胰酶消化，促進(jìn)抗原暴露。4.1抗體工作濃度TGFP1為1:100,CollagenI為1:200，CollagenIII為1:100。4.2工作流程①3jim厚石蠟切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60'C烤片2hr;②切片常規(guī)脫蠟至水；③0.05M(PH7.2)PBS洗3次，每次2min;④抗原修復(fù)于高壓鍋內(nèi)加入PH6.0檸檬酸鹽緩沖液1500ml并加熱至沸騰，將置于不銹鋼架上的切片放入緩沖液內(nèi)，繼續(xù)加熱至噴氣后2min,冷卻至室溫，取出玻片，蒸餾水沖洗2次，PBS(PH7.2)沖洗3次，每次2min;⑤滴加5XBSA封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗；⑥滴加適當(dāng)稀釋的一抗，37'C1hr左右。PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑦滴加生物素化二抗，37°C20min。PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑧滴加SABC試劑(鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物)；37'C孵育20min，PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑨滴加新鮮配置DAB顯色劑(取3ml蒸餾水，加A、B、C試劑各3滴，混勻)，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，充分水洗；0⑩蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。4.3圖像分析及處理采用PAS9000病理圖像分析系統(tǒng)(Ver9.2.1)，用積分光密度(Integralopticaldensity,IOD)來衡量肺組織中TGF-P1、CollagenI、III的含量。細(xì)胞的密度參數(shù)是利用攝像機(jī)輸入細(xì)胞圖像信息的光電轉(zhuǎn)換原理，將細(xì)胞在同一光源下吸收或透過光的數(shù)值作為光密度(也稱吸光度)。測量目標(biāo)顏色越深，透過的光線越少，光密度越大。因此，光密度值可用于衡量組織或細(xì)胞中某種成分的含量。積分光密度是整個視野內(nèi)每一點(diǎn)光密度的疊加。是對免疫組化染色結(jié)果分析的一個較為準(zhǔn)確的方法。每次取圖前均預(yù)熱20分鐘以上，并保持光源、電壓、對比度、敏感度等穩(wěn)定。①TGFei:每張切片選取5個高倍視野(X400)，以巨噬細(xì)胞胞漿染為棕色、棕黃色、褐色為陽性，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野[23]。同時采用PAS9000病理圖像分析系統(tǒng)(Ver9.2.1),進(jìn)行定量分析，根據(jù)免疫組化陽性著色的深淺計算每個視野的IOD[241，求平均值。②CollagenI、CollagenIII:采用PAS9000病理圖像分析系統(tǒng)(Ver9.2.1)，進(jìn)行定量分析，每張切片選取5個僅含肺間質(zhì)的高倍視野(X400)，根據(jù)免疫組化陽性著色的深淺計算每個視野的IOD24，求平均值。5、肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定按羥脯氨酸含量測定試劑盒說明書采用樣本堿水解法進(jìn)行HYP含量測定稱取小塊肺組織(約30mg)放入試管內(nèi)，準(zhǔn)確加水解液0.1ml，混勻，加蓋后沸水浴水解20min，之后將各試管液體PH值調(diào)至6.0-6.8,加適量活性炭，混勻，3500r/min離心10min，取上清0.6ml,依次加入三種試劑后，混勻，60°C7jC浴15min,3500r/min離心10min,取上清在550腿，0.5cm光徑下測定各管的吸光度，之后按照說明書公式計算肺組織中HYP含量。6、統(tǒng)計方法將等級資料轉(zhuǎn)化為計量資料，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以^士s表示，比較組間差異性，進(jìn)行t檢驗。結(jié)果1、丹參總酚酸對小鼠肺系數(shù)的影響造模后各時間點(diǎn)模型組小鼠肺系數(shù)均高于正常對照組(p<0.01)，28天實測數(shù)值增高最顯著；丹參總酚酸及醋酸潑尼松組小鼠肺系數(shù)均比同期模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05)。(見表l-l，圖1)。表1-1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數(shù)的影響(x土s，n=io)組別齊慢(mg/kg)7天14天28天正常對照組7.318±0.4126.481±0.5625.775±0.473模型組10.266±1.552##10.030土1.751湘10.655±5.213##醋酸潑尼松組6.677.705±1.278**8.109±1.279*6.391±0.926*大劑量組跳07.635±1.157**7.187±1.434**6.351±1.037*丹參總酚酸中劑量組80.07.328±1.288**7.630±1細(xì)**6.661±1.412*小劑量組40.08扁±1.165**8.464±1.425*6.343±1.148*注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比。圖1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數(shù)的影響(；±s,11=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比。)2、丹參總酚酸對小鼠肺病理形態(tài)的影響組小鼠第7天雙肺呈暗紅色，體積較大，彈性差；第14、28天時雙肺蒼白，體積縮小，硬度增加。其余各治療組均輕于模型組。2.2光鏡觀察正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組7天時肺泡炎明顯，肺泡腔見大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞滲出，肺泡間隔增寬，可見少量成纖維細(xì)胞及其基質(zhì)增生；14天時肺泡炎減輕，肺泡間隔見成纖維細(xì)胞及基質(zhì)大量增多；28天時肺泡炎輕微，肺泡間隔顯著增寬，可見大量成纖維細(xì)胞及膠原纖維增生，少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤。丹參總酚酸及醋酸潑尼松治療組小鼠肺泡間隔增寬較各時間點(diǎn)模型組明顯減輕，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和槳細(xì)胞浸潤較輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，與模型組相比纖維化程度均有不同程度減輕(見表1-2，圖2)。表l-2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>。圖2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x士s,n=10)(#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比)3、丹參總酚酸對小鼠肺組織TGF01蛋白表達(dá)的影響TGF61表達(dá)在胞漿，表達(dá)的細(xì)胞有支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。正常對照組小鼠的少數(shù)細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿有少量陽性表達(dá)；模型組小鼠細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞TGFP1表達(dá)更明顯和范圍更廣；其余各治療組小鼠細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF01表達(dá)減少。與正常對照組相比模型組小鼠在7天肺泡腔和間質(zhì)中出現(xiàn)大量的TGFPI陽性的肺泡巨噬細(xì)胞(P<0.01),以單個或成群肺泡巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，14天和28天時在肺泡腔和間質(zhì)中TGFe1陽性的肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目減少，與正常對照組相比仍有顯著性差異(P^.01):醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、"天、28天陽性細(xì)胞數(shù)比模型組相應(yīng)時間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)減少，7天和14天有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，28天無顯著性差異。(見表1-3，圖3)模型組各時間點(diǎn)IOD均明顯高于正常對照組(P<0.01)，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天IOD比模型組明顯降低(P<0.01，P<0.05)，28天與正常對照組相比無顯著性差異。(見表1-4，圖4)表1-3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFP1陽性細(xì)胞數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>組別劑量(mg/kg)7天14大28天正常對照組277.23±22.87260.97±10.52268.09±23.48模型組416.94土81.87賴391.34±85.65##316.18士50.69糾醋酸潑尼松組6.67338.34±48.35*310.34±44.14*293.99±53.20人劑量組跳0323.85±42.18**298.51土47.94林304.40±42.49丹參總酚酸中劑量組80.0313.94±39.50**310.24±36.73*307.68±21.95小劑量組40.0313.80±40.70**305.79±40.21*305.17±36.50注#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.0]，與模型組相比。(x±s,n,圖4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFe1IOD的影響(x士s，n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比)4、丹參總酚酸對小鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)的影響CollagenI、CollagenIII經(jīng)免疫組化染色后呈現(xiàn)棕色、棕黃色或棕褐色。正常對照組小鼠肺組織中血管壁、支氣管、細(xì)支氣管壁有Collagenl、CollagenIII的表達(dá)，肺間質(zhì)內(nèi)有散在性的表達(dá)；模型組小鼠肺間質(zhì)內(nèi)可見CollagenI、CollagenIII呈局灶性、斑片狀、條索狀分布。兩者IOD皆于第7天開始增多，并逐步增加。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組各時間點(diǎn)IOD與模型組相比，都有顯著性降低(P<0.01，P<0.05)。(見表1-5，圖5,表1-6,圖6)表l-S丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenI積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組189.03±8.01190.13±16.84181.47±17.95模型組302.71土21.90絲326.30±31.06##361.42士47.99糊醋酸潑尼松組6.67280.43±23.13*287.88±28.56*311.65±28.32*大劑量組跳O274.92±24.32*294.05±20.23*314.27±35.38*丹參總酚酸中劑量組80.0281.37±22.40*287.47±19.98**302.44±24.59"小劑量組40.0272.88±34.16*2%.18±14.8*312.47±32.9*注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01,與模型組相比。Cx±S,"=/0」圖5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIOD的影響("±s,n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比)表1-6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIII積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組288.75±22.78278.28±2U2290.43±6.65模型組388.89±23.11##409.32±31.71##457.42±40.11##醋酸潑尼松組6.67355.79±36.61*379.17±20.39*416.89±44.62*大劑量組160.0365.30±15.57*378.14±19.06*406.25±24.49**丹參總酚酸中劑量組80.0359.02±12.73**370.10±11.23**401.18±24.22**小劑量組40.0359.87±26.67*373.07±15.38**417.37土25.83*注#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。Cx±S,"=/C()圖6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIIIOD的影響(x±s，n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)5、丹參總酚酸對小鼠肺組織HYP含量的影響模型組小鼠肺HYP含量和正常對照組相比于14天開始升高，28天最顯著；丹參總酚酸大劑量治療后各時間點(diǎn)HYP含量均比模型組明顯降低(P<0.05,P<0.01);中、小劑量小鼠治療后7天、28天肺HYP含量顯著降低(P4.01)。給藥14天時小鼠肺HYP含量有下降趨勢；醋酸潑尼松治療后雖可見HYP含量比模型組降低，但無顯著差異。(見表1-7，圖7)表1-7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量(Wg/mg)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。d±s,=7W圖7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響(x±s，n=10)(#P<0.05，p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)小結(jié)1、丹參總酚酸給藥7、14、28天后均可明顯降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠的肺系數(shù)；2、丹參總酚酸早期可減輕博萊霉素致肺纖維化小鼠肺部的炎癥反應(yīng)，晚期可抑制肺組織膠原沉積和纖維化形成；3、丹參總酚酸早期能降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺組織TGFPl的表達(dá)；4、丹參總酚酸能降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺間質(zhì)中I型、III型膠原的沉積；5、丹參總酚酸可降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠的肺羥脯氨酸的含量。第二部分博萊霉素致肺纖維化大鼠病理觀察及丹參總酚酸干預(yù)作用研究材料與方法一、材料1、實驗動物SD大鼠，108只，雌雄各半，體重180-220g，清潔級，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號XCYK(蘇)2002-0008，實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2002-0037.2、藥物與試劑2.1藥物同第一部分。2.2試劑SOD活力測定試劑、MDA含量測定試劑，南京建成生物制劑公司購買。其它試劑同第一部分。3、儀器內(nèi)切式組織勻漿機(jī)，ZS88-1型，浙西機(jī)械廠；臺式低溫離心機(jī)，5180R型，美國Effendorf公司；日立H-600透射電鏡；其它儀器同第一部分。二、方法1、分組及造模[16、17SD大鼠，108只，稱重，編號，隨機(jī)分為正常對照組，模型組，醋酸潑尼松組(3.33mg*kg-l*d-l)，丹參總酚酸(80mg'kg-l'd-l)大劑量組，丹參總酚酸(40mg'kg-l'd-l)中劑量組，丹參總酚酸(20mg'kg-l'd-l)小劑量組，每組18只。實驗大鼠用4%水合氯醛(lml/g)腹腔注射麻醉后，取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組、醋酸潑尼松組、丹參總酚酸大劑量組、丹參總酚酸中劑量組和丹參總酚酸小劑量組于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺緩緩注入BLM(5mg/kg)，正常對照組注入等體積生理鹽水。注藥后縫合皮膚，立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，手術(shù)前一日及術(shù)后三天連續(xù)肌肉注射青霉素(8萬1>只-1-天-1)4天。各治療組造模后次日開始灌服給藥，正常對照組與模型組灌服蒸餾水。2、肺系數(shù)各組動物分別于實驗第7、14、28天經(jīng)頸椎離斷法處死6只，分離出雙肺，稱重，根據(jù)公式肺重(mg)/體重(g)，計算肺系數(shù)。3、組織病理學(xué)觀察方法同第一部分。4、透射電鏡觀察取28天大鼠肺組織經(jīng)4%戊二醛固定液固定后，再用鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，618環(huán)氧樹脂包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，日立H—600透射電鏡觀察。5、免疫組織化學(xué)技術(shù)5.1抗體工作濃度TGFP1為1:150，CollagenI為1:200,CollagenIII為1:100。5.2工作流程同第一部分。5.3圖像分析及處理同第一部分。6、血清SOD、MDA的測定取血清5jil按SOD測定試劑盒說明書采用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行SOD活力測定；取血清0.1ml按MDA測定試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行MDA含量測定。7、肺組織SOD、MDA指標(biāo)測定7.1組織勻漿的制備稱取肺組織塊(約150mg)，除去血液，用濾紙拭干，加入冷生理鹽水，體積為肺組織塊重量的9倍，用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制成10%肺組織勻漿。7.2SOD、MDA測定取10%肺組織勻漿用臺式低溫離心機(jī)10000r/min離心4min，留上清，取O.lml按MDA測定試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行MDA含量測定；另取0.1ml加0.9ml生理鹽水制成1%肺組織勻漿，取30fU按SOD測定試劑盒說明書采用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行SOD活力測定。8、肺組織HYP含量測定方法同第一部分。9、統(tǒng)計方法將等級資料轉(zhuǎn)化為計量資料，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以；士s表示，比較組間差異性，進(jìn)行t檢驗。結(jié)果1、丹參總酚酸對大鼠肺系數(shù)的影響造模后各時間點(diǎn)模型組大鼠肺系數(shù)均顯著高于正常對照組(p<0.01);丹參總酚酸及醋酸潑尼松組大鼠肺系數(shù)均比同期模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05)。(見表2-1，圖8)。表2-l丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺系數(shù)的影響(；±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2、丹參總酚酸對大鼠肺組織病理形態(tài)的影響-2.1大體觀察正常對照組雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性較好。模型組大鼠第7天雙肺呈暗紅色，體積較大，彈性差；第14、28天時雙肺蒼白，體積縮小，硬度增加。其余各治療組均輕于模型組。2.2光鏡觀察正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組7天時肺泡炎明顯，肺泡腔見大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞滲出，肺泡間隔增寬，可見少量成纖維細(xì)胞及其基質(zhì)增生；14天時肺泡炎減輕，肺泡間隔見成纖維細(xì)胞及基質(zhì)大量增多；28天時肺泡炎輕微，肺泡間隔顯著增寬，可見大量成纖維細(xì)胞及膠原纖維增生，少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤。丹參總酚酸及醋酸潑尼松治療組小鼠肺泡間隔增寬較各時間點(diǎn)模型組明顯減輕，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤較輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，與模型組相比纖維化程度均有不同程度減輕(見表2-2，圖9)。(第28天大鼠肺組織病理改變見附圖19、20、21、22、23)表2-2丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；土s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。圖9丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x土s,n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)2.3超微結(jié)構(gòu)觀察28天時，正常對照組I、II型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間連接正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜完好。模型組部分I、II型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體腫脹，其嵴稀疏，胞核固縮，胞質(zhì)內(nèi)可見壞死自溶改變；II型肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)板層小體增多，有排空現(xiàn)象；血管內(nèi)皮細(xì)胞核變形，基膜增厚。肺泡腔萎縮，其中可見壞死游離的II型上皮細(xì)胞；肺泡間隔增寬尤為明顯，可見成纖維細(xì)胞增多，其間有大量不規(guī)則、排列紊亂的膠原纖維沉積，間質(zhì)輕度水腫，并有單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞浸潤。醋酸潑尼松組及丹參總酚酸組I、II型肺泡上皮細(xì)胞仍可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體輕度腫脹偶見少量炎細(xì)胞浸潤；間質(zhì)中膠原纖維的沉積較模型組有不同程度的減輕。(第28天大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變見附圖24、25、26、27)3、丹參總酚酸對大鼠肺組織TGFP1蛋白表達(dá)的影響TGF01定位于胞漿，支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)。正常對照組大鼠的少數(shù)細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿有少量陽性表達(dá)；模型組大鼠細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞則TGFP1表達(dá)更明顯和范圍更廣；其余各治療組大鼠細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞TGFe1表達(dá)減少。與正常對照組相比模型組大鼠在7天肺泡腔和間質(zhì)中出現(xiàn)大量的TGFPI陽性的肺泡巨噬細(xì)胞(P<0.01)，以單個或成群肺泡巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，14天和28天時在肺泡腔和間質(zhì)中TGFP1陽性的肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目減少，與正常對照組相比仍有顯著性差異(P^.01);醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天、28天陽性細(xì)胞數(shù)比模型組相應(yīng)時間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)減少，7天和14天有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，28天無顯著性差異。(見表2-3，圖10)表2-3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFel陽性細(xì)胞數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比;*P<0.05,**pO.Ol，與模型組相比。"±s，《=》圖10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFP1陽性細(xì)胞數(shù)的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比)模型組各時間點(diǎn)IOD均明顯髙于正常對照組(P<0.01)，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天IOD比模型組明顯降低(P<0.01,P<0.05),28天與正常對照組相比無顯著性差異。(見表2-4，圖11)，(第7天大鼠肺組織TGFP1的表達(dá)見附圖28、29)表2-4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFel積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組211.90±20.3422U7±36.14226.82±27.29模型組312.81士21.79絲299.88±23.55##276.25±5.固醋酸潑尼松組3.33269.11±20.85**268.19±21.68*255.37±21.20大劑量組肌0276.50±35.22*263.95±12.16**260.12±13.47丹參總酚酸中劑量組40.0273.25±16.17**266.61±15.08*264,11±24.69小劑量組20.0275.48±19.15*268.85±14.95*263.53±12.37注#P<0.05，絲pO.Ol，與正常對照組相比;*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。(X±S,M=6)圖11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFP1IOD的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)4、丹參總酚酸對大鼠肺組織CollagenI、Collagenin的表達(dá)的影響CollagenI、CoHagenIH經(jīng)免疫組化染色后呈現(xiàn)棕色、棕黃色或褐色。正常對照組大鼠肺組織中血管壁、支氣管、細(xì)支氣管壁有CollagenI、CollagenIII的表達(dá)，肺間質(zhì)內(nèi)有散在性的表達(dá)；模型組大鼠肺間質(zhì)內(nèi)可見CollagenI、CollagenIII呈局灶性、斑片狀、條索狀分布。兩者IOD皆于第7天開始增多，并逐步增加。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組各時間點(diǎn)IOD與模型組相比，都有顯著性降低(P<0.01，P<0.05)。(見表2-5，圖12，表2-6，圖13)，(第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達(dá)見附圖30、31、32、33)表2-5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenI積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組238.13±31.73242.39±15.08248.53±23.17模型組329.30±17.93##352.82±9.51##394.27±17.05##醋酸潑尼松組3.33300.84±10.03**328.49±35.15**340.72士16.50**大劑量組80.0300.78±9.96**311.42±28.21**330.35±14.48**丹參總酚酸中劑量組御299.95±13.39*323.55±22.72*332.71±23.73**小劑量組20.0302.23±11.13*323.86±21.25*335.61±13.78**注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比。Cjc士s，"=<5,圖12丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIOD的影響(x±s，ii=6)(#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)表2-6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠Collagenin積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組24U3±20.53251.65±12.71253.09±19.86模型組332.73±13.55##371.95±12.41##380.64±11.74##醋酸潑尼松組3.33290.77±6.56**348.65±15.37*347.80±9.73**大劑量組80.0305.81±9.71**349.30±5.73**354.34±5.65**丹參總酚酸中劑量組40.0308.30土8.薩350.13±16.11*363.52±9.65*小劑量組20.0312.51±8.37*348.54±21.93*358.07±9.49**注#P<0.05，胖pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。(JC±S,圖13丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenfflIOD的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,"p<0.01,與模型組相比)5、丹參總酚酸對大鼠血清SOD、MDA的影響5.1SOD的變化模型組SOD數(shù)值逐漸增高，與正常對照組相比，第7、14天SOD活力有顯著性降低(P<0.01,P<0.05),第28天與正常對照組接近，無顯著差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天SOD活力均高于模型組，低于正常對照組，第28天逐漸恢復(fù)正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組在第7天有顯著性差異(P<0.05);丹參總酚酸中劑量組第7、14天均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。(見表2-7,圖14)表2-7丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(U/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比?！窼±S,"=6」圖14丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(S±s,n=6)(#P<0.05，p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)5.2MDA的變化模型組MDA數(shù)值逐漸降低，與正常對照組相比，第7、14天MDA含量均有顯著性升高(P<0.01)，第28天無顯著性差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天MDA含量低于模型組，高于正常對照組，第28天逐漸恢復(fù)正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組第7、14天有顯著性降低(P<0.01,P<0.05),丹參總酚酸中劑量組第7天有顯著性降低(P<0.01)。(見表2-8，圖15)表2-8丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(nmol/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注#P<0.05，絲pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比?！窲C土S,w=6J圖15丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(；±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)6、丹參總酚酸對大鼠肺組織SOD、MDA的影響6.1SOD的變化模型組SOD數(shù)值逐漸增高，與正常對照組相比，第7、14天SOD活力有顯著性降低(P<0.05)，第28天與正常對照組接近，無顯著差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天SOD活力均高于模型組，低于正常對照組，第28天逐漸恢復(fù)正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸小劑量組在第7天有顯著性差異(P<0.05);丹參總酚酸大、中劑量組第7、14天均有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。(見表2-9，圖16)表2-9丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響(U/mgprot)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組33.46±3.4234.60±5.7032.93±2.66模型組27.87±1.51#28.50±1.62#30.44±1.94醋酸潑尼松組33330.76±2.40*27.32±6.6927.08±4.10大劑量組訓(xùn)31.06±2.49*34.01±2.05**33.77±6.32丹參總酚酸中劑量組40.029.56±0.88*32.91±2.58**33.51±4.06小劑量組20.030.27±1.29*32.22±3.7630.09±3.03注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01,與模型組相比。"is,圖16丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響。土s，n=6)(#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)6.2MDA的變化模型組MDA數(shù)值逐漸降低，與正常對照組相比，第7、14天MDA含量均有顯著性升高(P<0.01)，第28天無顯著性差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天MDA含量低于模型組，高于正常對照組，第28天逐漸恢復(fù)正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組第7、14天有顯著性降低(P<0.01,P<0.05)，丹參總酚酸中劑量組第7天有顯著性降低(P<0.01)。(見表2-10，圖17)表2-10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(nmol/mgprot)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組3.556±.2153.528±1.043.447±0.925模型組6.094±2.126##6.268±0.880##5.026±1.041醋酸潑尼松組3.334.441±0.956*5.129±0.483*4.219±0.889大劑量組訓(xùn)4.610±0.472*5.113±0.389*4.380±1.989丹參總酚酸中劑量組40.04.453±0.699*4.667±2.3234.677±0.551小劑量組20.04.374±0.392*3.732±0.753**4.866±1.956注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比。f^f±S,"=0圖17丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(x士s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)7、丹參總酚酸對大鼠肺組織HYP含量的影響.-模型組大鼠肺HYP含量與正常對照組相比于14天開始升高，28天最顯著(P4.01);醋酸潑尼松組各時間點(diǎn)與模型組相比HYP雖有所下降，但都無顯著差異。丹參總酚酸治療后各時間點(diǎn)HYP含量均比模型組降低，第28天有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。(見表2-11，圖18)表2-11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響(iig/mg)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組0.63±0.0530.71±0.0520.87±0.096模型組0.62±0.1070.81±0.1311.35±0.104##醋酸潑尼松組3.330.55±0.0570.80±0.1221.26±0.222大劑量組80.00.46±0.0680.77±0.0691.18±0.134*丹參總酚酸中劑量組40.00.46±0.0760.8±0.0701.01±0.139**小劑量組20.00.43±0.0190.79±0.1190.96±0.249**注#P<0.05，湖pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**pO.Ol，與模型組相比?！?；±s,"=6」圖18丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響。士s，n=6)(#P<0.05,##p《0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p《0.01，與模型組相比)小結(jié)1、丹參總酚酸給藥7、14、28天后可明顯降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠的肺系數(shù)；2、丹參總酚酸給藥7天后可減輕博萊霉素致肺纖維化大鼠肺泡炎，給藥14、28天后可減輕肺纖維化程度；3、丹參總酚酸給藥7、14天能降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺組織TGFP1的表達(dá)；4、丹參總酚酸可明顯增強(qiáng)博萊霉素所致肺纖維化大鼠早期肺組織、血清SOD活力，明顯降低MDA含量；5、丹參總酚酸能減少博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺間質(zhì)中i型、m型膠原的沉積。6、丹參總酚酸給藥28天可降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠的肺組織羥脯氨酸含量。討論在本發(fā)明實施條件下，造模第7天時，模型組動物肺泡炎明顯(P4.01)，第28天肺組織中羥脯氨酸含量較正常組明顯增高(P<0.01)光鏡、免疫組化及電鏡觀察顯示肺纖維程度明顯升高，成纖維細(xì)胞和膠原纖維大量增生，纖維化已成為主要病變，說明BLM所致肺纖維化動物模型復(fù)制成功。在用BLM制備肺纖維化動物模型的基礎(chǔ)上，本文實驗結(jié)果表明，給予丹參總酚酸治療后，動物肺纖維化明顯減輕?，F(xiàn)將博萊霉素致肺纖維化動物模型的評價及丹參總酚酸對博萊霉素致肺纖維化動物模型的療效機(jī)制，討論如下一、博萊霉素致肺纖維化動物模型的評價肺纖維化的病因目前尚不清楚，其發(fā)病機(jī)制亦未完全闡明。一般認(rèn)為粉塵吸入、感染、吸入某些氣體以及使用某些藥物均可引起肺纖維化。為了初步探討丹參總酚酸對肺纖維化的治療作用及機(jī)制，首先必須復(fù)制穩(wěn)定的肺纖維化動物模型；而實驗動物模型選擇正確、復(fù)制穩(wěn)定是本實驗順利進(jìn)行的根本保證。在査閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本課題選擇了博萊霉素致肺纖維化的實驗動物模型。目前國內(nèi)外常用石英、博萊霉素致肺纖維化動物模型來研究肺纖維化形成的原因和機(jī)制。博來霉素(BLM)是從鏈霉菌屬中一個產(chǎn)抗生素的菌株中提取出的一組糖肽類，是一種癌癥化療制劑。肺纖維化是BLM常見的并發(fā)癥，常用于制作動物肺纖維化模型。BLM致纖維化機(jī)制尚不明確。比較公認(rèn)的觀點(diǎn)是BLM能和亞鐵離子形成Blemydn-Fe++復(fù)合物，在02存在下，這一復(fù)合物能為氧分子提供電子，形成過氧化物和游離羥基等中間體產(chǎn)物，使DNA的脫氧核糖產(chǎn)生自由基。大量的自由基對肺組織產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化損傷，促進(jìn)成纖維細(xì)胞等增生、增殖，使肺泡間質(zhì)發(fā)生纖維化。由于BLM分子量大，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫中2年不降低效價，進(jìn)入組織后被細(xì)胞緩慢攝取，所以BLM對組織的損傷具有持續(xù)性。經(jīng)氣管注入博萊霉素造成動物肺纖維化，其病理過程與人類特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化相似，作為肺纖維化的經(jīng)典動物模型而被廣泛應(yīng)用。本實驗應(yīng)用博萊霉素復(fù)制小鼠、大鼠肺纖維化模型，觀察發(fā)現(xiàn)模型組病理學(xué)改變7天肺泡炎明顯，14天、28天形成纖維化，主要病變與指標(biāo)都與文獻(xiàn)報道一致，同時肺組織超微結(jié)構(gòu)的改變顯示大鼠不僅有肺間質(zhì)的病變，還有明顯的肺實質(zhì)包括肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的損傷，與文獻(xiàn)報道一致，說明動物模型復(fù)制成功。二、丹參總酚酸抑制肺損傷及炎癥反應(yīng)肺纖維化過程起始于肺泡，肺泡上皮損傷、肺泡炎以及巨噬細(xì)胞數(shù)量增多可能是肺纖維化發(fā)生的早期事件。在本實驗中，通過氣管內(nèi)注入博萊霉素可使肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，受損肺組織產(chǎn)生的化學(xué)趨化物質(zhì)最初可使大量炎癥細(xì)胞游走到肺間質(zhì)及肺泡腔中，之后炎癥細(xì)胞可進(jìn)一步釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，例如IL-1、TGF-e、TNF-a、IFN-Y、PDGF、MMPs等，這些因子對肺纖維化形成均具有重要作用。此外，BLM所致肺損傷可使肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，血漿蛋白外滲，最終導(dǎo)致ECM沉積于肺泡腔和肺間質(zhì)中。由此可見，肺組織受損、炎癥細(xì)胞聚集可促進(jìn)纖維化形成，而保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞、減輕炎癥反應(yīng)、減少炎癥細(xì)胞滲出則可改善肺功能。目前針對肺纖維化的傳統(tǒng)治療藥物如糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制藥物其出發(fā)點(diǎn)就是抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕肺纖維化的程度。在本實驗中，經(jīng)丹參總酚酸治療后，可以顯著減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠、大鼠肺部早期急性期炎癥反應(yīng)，降低肺系數(shù)，病理形態(tài)學(xué)檢查及電鏡觀察顯示肺部炎癥細(xì)胞滲出明顯減少、肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，故推測抑制肺損傷及炎癥反應(yīng)是治療肺纖維化的主要機(jī)制之一。三、丹參總酚酸抑制肺纖維化模型氧自由基損傷自由基損傷在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用，是目前已知的重要機(jī)制之一。Murrel等報道氧自由基可刺激成纖維細(xì)胞增生。成纖維細(xì)胞是分泌膠原蛋白的主要細(xì)胞，其合成與分泌膠原能力的增強(qiáng)或成纖維細(xì)胞的大量增殖，都可能導(dǎo)致膠原總量的增加。本實驗表明注入博萊霉素后l-7天內(nèi)，病變以肺泡炎為主，第7天時肺泡炎達(dá)高峰，并開始出現(xiàn)肺泡間隔增厚，成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管增生，第28天時形成穩(wěn)定的纖維化，與文獻(xiàn)報道一致。因此博萊霉素致肺纖維化病理過程分兩期即早期為肺泡炎，晚期為肺纖維化。肺泡炎階段，博萊霉素刺激大量炎性細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基、細(xì)胞因子和酶參與了肺損傷，隨后氧自由基刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白形成肺纖維化。在生理條件下，氧自由基引發(fā)的組織損傷可被內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)所抑制。然而，當(dāng)這些抗氧化物不足以對抗大量的氧化物即氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡時，組織就會發(fā)生不可逆性損傷。博萊霉素在氧分子和Fe2+存在下可產(chǎn)生氧自由基，氧自由基可破壞生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，損傷DNA及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，最終引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生物膜功能喪失，從而使肺泡上皮遭到不可逆的破壞，導(dǎo)致肺損傷；另一方面，肺泡上皮細(xì)胞損傷可引起大量炎癥細(xì)胞浸潤到間質(zhì)或肺泡腔中，炎癥細(xì)胞的聚集和活化也可產(chǎn)生過量的氧自由基，除了進(jìn)一步加重脂質(zhì)過氧化和肺組織的損傷外，還可通過激活NF-kB上調(diào)致纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生，間接促進(jìn)肺纖維化的形成。因此，過氧化物和自由基反應(yīng)中間產(chǎn)物的過量產(chǎn)生在BLM誘導(dǎo)的炎癥和纖維化中起重要作用。SOD是體內(nèi)重要的清除氧自由基的酶，它的活性增加可阻止氧自由基的連鎖反應(yīng)，清除氧自由基及其氧化產(chǎn)物，保護(hù)肺組織細(xì)胞，減輕肺損傷。其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它的髙低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此兩者同時測定具有更好的評判價值。丹參的化學(xué)成分主要分為水溶性成分和脂溶性成分兩大部分。丹參酮是丹參主要的脂溶性有效成分，以往的研究表明丹參酮具有抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量、抑制血栓形成等心血管保護(hù)作用。丹參的水溶液性有效成分主要是酚酸類化合物，有研究結(jié)果顯示丹參總酚酸對于防治動脈粥樣硬化發(fā)揮重要作用。另有研究顯示，丹參總酚酸對11202氧化損傷的血管平滑肌有明顯的保護(hù)作用。本實驗結(jié)果表明，肺纖維化大鼠經(jīng)丹參總酚酸和醋酸潑尼松治療后，早期肺組織、血清SOD活力明顯高于模型組；MDA含量明顯低于模型組。說明肺纖維化早期，丹參總酚酸有很好的抗氧自由基的作用。四、丹參總酚酸抑制TGF-e大量分泌TGF-e廣泛分布于體內(nèi)，參與多種細(xì)胞的生理功能，如細(xì)胞的游走、分化和增殖。其在致纖維化作用方面表現(xiàn)尤為突出，涉及多個器官和多種原因所致的纖維化性病變。在參與肺纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，TGF-e是研究最深入、最重要的細(xì)胞因子。TGFP在哺乳類動物中共有三種異構(gòu)體，即TGF-ei，TGF-e2，TGF-P3，其中TGF-e1分布最廣，研究得也最多。Aubert報道TGF-e1廣泛分布于正常大鼠肺內(nèi)，包括肺泡巨噬細(xì)胞，肺內(nèi)間質(zhì)，支氣管上皮細(xì)胞，氣道和血管周圍的結(jié)締組織中。其中肺泡巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是分泌TGF-e1的主要細(xì)胞。TGF-e1是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，對成纖維細(xì)胞具有趨化作用，并能刺激未成熟成纖維細(xì)胞的生長，損傷部位出現(xiàn)的TGF-e1能夠從周圍組織中募集成纖維細(xì)胞并能刺激未成熟成纖維細(xì)胞增生和分化。體外研究表明，TGF-e1可刺激肺成纖維細(xì)胞合成大量膠原。以往研究顯示丹參可抑制肺纖維化小鼠肺組織TGF-P的表達(dá)，未見丹參總酚酸的相關(guān)報道。本實驗結(jié)果表明，模型組小鼠、大鼠肺組織TGF-ei積分光密度值明顯多于正常對照組，說明博萊霉素的可刺激肺組織中TGF-ei的產(chǎn)生，從而引起各種細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積；而醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組小鼠、大鼠早期肺組織TGF-ei積分光密度值明顯低于模型組，同時發(fā)現(xiàn)丹參總酚酸能降低TGF-ei在巨噬細(xì)胞的表達(dá)，說明肺纖維化早期，丹參總酚酸和醋酸潑尼松能抑制TGF-e1分泌，降低其在肺組織的表達(dá)。五、丹參總酚酸對肺纖維化模型膠原及HYP的影響膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原積聚是肺間質(zhì)纖維化的一個重要特征。其合成的速度大于降解的速度，肺內(nèi)膠原纖維顯著增多，最終導(dǎo)致膠原的逐漸積累。實驗還證實，在大鼠和人肺間質(zhì)纖維化的肺組織有膠原代謝紊亂，表現(xiàn)為I型和III型膠原比例失調(diào)，膠原在肺間質(zhì)中積聚。HYP是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4%，其他除彈性蛋白含有少量HYP(約1%)夕卜，均不含HYP。因此組織中HYP含量可作為其膠原組織代謝的重要指標(biāo)[9]。膠原合成的一個重要過程是脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉(zhuǎn)化成羥脯氨酸，每個膠原分子中每條a肽鏈里至少要有近IOO個羥脯氨酸殘基才能使膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。羥脯氨酸與膠原分子中a肽鏈的這種穩(wěn)定的比例關(guān)系，使羥脯氨酸含量的測定成為間接反映膠原含量的敏感指標(biāo)而被廣泛應(yīng)用于肺纖維化的研究。而通過羥脯氨酸測算膠原蛋白的含量，一方面可以直觀的反映膠原代謝的情況，判斷纖維化的程度，同時可以為篩選預(yù)防與治療的藥物提供依據(jù)。本實驗CollagenI、Collagenin免疫組化結(jié)果顯示小鼠、大鼠模型組I型和III型膠原積分光密度均在7天開始增加，而且直至28天，仍呈不斷增加趨勢，此時肺泡結(jié)構(gòu)已破壞，纖維化明確可見，纖維組織呈條索樣，斑片狀分布。而醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組小鼠、大鼠I、HI型膠原第7、14、28天積分光密度值明顯低于模型組。提示了丹參總酚酸能抑制I、III型膠原在肺間質(zhì)的沉積。本實驗肺組織HYP結(jié)果表明，在造模后14、28天時，與正常組相比，模型組小鼠、大鼠肺組織HYP含量明顯升高；14天丹參總酚酸組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比，均有不同程度下降，但無顯著性差異；28天丹參總酚酸組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比均有顯著下降，間接反映了丹參總酚酸可降低肺組織膠原的含量，起到減輕肺纖維化的作用。14天、28天醋酸潑尼松組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比，均有不同程度下降，但無顯著性差異。提示醋酸潑尼松遠(yuǎn)期治療效果不佳。綜上所述，PNS對BLM誘導(dǎo)的動物肺纖維化模型有明確的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供了一個新的選擇。PNS抗實驗性肺纖維化的機(jī)制為①抗損傷及抗炎效應(yīng)病理形態(tài)學(xué)觀察顯示PNS可以保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，顯著減輕肺泡炎的程度和范圍。②抗氧化作用本實驗中PNS可以顯著提高大鼠肺組織勻漿和血清中SOD活力，降低MDA含量，提示PNS可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而對肺損傷及纖維化起到一定的抑制作用。③調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)免疫組化顯示PNS可以顯著減少肺組織中致纖維化因子TGF-3的陽性表達(dá)，從而使膠原等ECM沉積減少。④抑制成纖維細(xì)胞增生、活化經(jīng)病理形態(tài)學(xué)和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PNS可以抑制由成纖維細(xì)胞大量增生引起的膠原沉積。結(jié)論1、本實驗實施結(jié)果表明通過氣管內(nèi)注入BLM，成功復(fù)制了小鼠、大鼠的肺纖維化模型；2、丹參總酚酸可明顯降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠的肺系數(shù)；3、病理觀察顯示丹參總酚酸早期可減輕博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺泡炎，晚期減輕纖維化程度；4、電鏡觀察顯示丹參總酚酸可減輕肺纖維化大鼠I、II型上皮細(xì)胞損傷的程度及間質(zhì)中膠原的沉積；5、丹參總酚酸可明顯升高博萊霉素所致肺纖維化大鼠早期肺組織、血清SOD活力，明顯降低MDA含量；6、丹參總酚酸早期能降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺組織TGF01的過高表達(dá)；7、丹參總酚酸能降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺間質(zhì)CollagenI、CollagenIII的表達(dá)；顯著降低肺組織HYP的含量。以上結(jié)果表明丹參總酚酸對博萊霉素所致動物肺纖維化具有明確的治療作用，該作用抑制與其抗損傷、抗炎癥反應(yīng)，抗氧自由基損傷、抑制TGF-0大量分泌及成纖維細(xì)胞增生、治療有關(guān)。權(quán)利要求1.一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途，本發(fā)明在以博萊霉素復(fù)制小鼠和大鼠的肺纖維化模型的基礎(chǔ)上，用三種不同劑量的丹參總酚酸予以治療，通過丹參總酚酸、免疫組織化學(xué)分析、電鏡觀察及生化測定等方法來證明丹參總酚酸對博萊霉素所致肺纖維化的療效、病理變化及作用機(jī)制。實施結(jié)果表明丹參總酚酸對博萊霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化有明確的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供了一個新的選擇。文檔編號A61P11/00GK101120962SQ20071002405公開日2008年2月13日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日發(fā)明者馮一中,周文軒,軍林,郭次儀,顧振綸申請人:蘇州中藥研究所