小分子抑制劑mln4924在制備抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種NEDD8活化酶的小分子抑制劑MLN4924 在制備抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的藥物中的應(yīng)用、以及MLN4924在制備抑制炎癥反應(yīng) 中NF- κ B和MPK信號(hào)通路激活的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺纖維化是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，通常是由于嚴(yán)重的外部創(chuàng)傷，感染，自 發(fā)免疫反應(yīng)，藥物不良副反應(yīng)等因素，引起肺的永久性損傷，導(dǎo)致肺泡外基質(zhì)反復(fù)破壞，過 度修復(fù)重建并沉積，最終導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失。肺纖維化是一種以肺部永久 性損傷為特征的、伴隨著高死亡率的嚴(yán)重疾病，目前仍缺少有效的治療方法。肺纖維化發(fā)病 過程是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，每個(gè)過程有多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與其中，目前其發(fā)病機(jī)理 尚未完全闡釋清楚，并且缺乏有效的治療藥物。
[0003] 以往人們對(duì)于肺纖維化治療和發(fā)病機(jī)制研究大多主要集中于纖維化形成過程中 起主要作用的成肌纖維細(xì)胞的增殖，凋亡和活化等方面，近年來(lái)大量的臨床與實(shí)驗(yàn)研究證 實(shí)在肺纖維化的形成過程中支氣管肺泡灌洗液（BALF)中的炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、蛋白和酶 異常增多，它們與肺組織細(xì)胞之間的相互作用在肺纖維化形成過程中具有重要作用，提示 我們抑制早期炎癥反應(yīng)可能也是預(yù)防纖維化形成的一種有效手段。
[0004] MLN4924是最近報(bào)道的一種選擇性NEDD8活化酶（NAE)的小分子抑制劑，它是 AMP類似物，主要通過與形成NAE-MLN4924復(fù)合物抑制NAE活性，從而抑制了部分依賴于 Cullin-Ring E31igase (CRL)酶的蛋白質(zhì)泛素化降解途徑，由此導(dǎo)致了此類蛋白質(zhì)的積聚， CRL的底物蛋白包括DNA復(fù)制剪切蛋白CDT1，0RC1，細(xì)胞周期抑制因子如p21，p27, Weel。 此前，關(guān)于MLN4924的研究報(bào)道多集中于其通過阻滯癌細(xì)胞周期或者引起細(xì)胞凋亡而發(fā)揮 其抗腫瘤特性，而關(guān)于其在炎癥反應(yīng)中的作用知之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首次提出了小分子化合物MLN4924即NEDD8活化酶的小分子抑制劑 MLN4924在有效抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中的應(yīng)用。本發(fā)明為肺纖維化的治療提供了 一條新的途徑和選擇。
[0006] 本發(fā)明提出了小分子抑制劑MLN4924在制備抑制博來(lái)霉素（Bleomycin)誘導(dǎo)的肺 纖維化的藥物中的應(yīng)用。
[0007] MLN4924,其結(jié)構(gòu)式如下所示，分子式為C21H25N5O 4S,分子量為443. 52,是 NEDD8活化酶（NAE)的小分子抑制劑，主要通過與NAE形成NAE-MLN4924復(fù)合物抑 制NAE活性，抑制了部分依賴于Cul I in-Ring E31 igase (CRL)介導(dǎo)的一類蛋白質(zhì)的泛 素化降解。MLN4924已被發(fā)現(xiàn)可作為一種潛在的新型抗癌藥物（Teresa A. Soucy, et al. Nature. 2009(458):732-736)。
[0008]
[0009] 本發(fā)明中，所述博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化包括博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化病變及肺 纖維化早期急性肺損傷，具體包括但不限于因肺間質(zhì)組織（如膠原蛋白等）過量積累而導(dǎo) 致的肺組織纖維樣病變、肺泡上皮細(xì)胞受損、羥脯氨酸含量升高、肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多、 肺部細(xì)胞因子和趨化因子過度表達(dá)等，從而導(dǎo)致肺部漸漸失去正常生理功能。目前研究人 員已建立多種動(dòng)物模型模擬肺纖維化的過程，包括藥物誘導(dǎo)（如博來(lái)霉素）、顆粒物誘導(dǎo) (如石棉）、輻射誘導(dǎo)等。本發(fā)明中所用的博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化的方法是一種可以有效模 擬該疾病的方法。在具體實(shí)施方案中，在用博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化的小鼠體內(nèi)注射MLN4924 后，小鼠肺纖維化的病理組織學(xué)評(píng)分、組織學(xué)病變、羥脯氨酸含量和膠原蛋白含量等都有明 顯減少或減輕。
[0010] 本發(fā)明中，所述博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化包括小鼠或人或其他哺乳動(dòng)物的博來(lái)霉 素誘導(dǎo)的肺纖維化。
[0011] 本發(fā)明中，所述藥物可以通過抑制早期炎癥過程來(lái)抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維 化。所述"早期炎癥過程"是包括肺泡上皮細(xì)胞受損、肺泡結(jié)構(gòu)和功能異常、細(xì)胞因子及趨 化因子的過度表達(dá)、炎癥細(xì)胞向肺部的過度浸潤(rùn)等。在具體實(shí)施方案中，在以LPS誘導(dǎo)急性 肺損傷的小鼠體內(nèi)注射MLN4924后，小鼠的肺損傷指標(biāo)，如肺的濕干比、組織學(xué)病變、肺部 細(xì)胞因子的表達(dá)量及炎性細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）向肺部的迀移數(shù)量等都有明顯 減少或減輕。
[0012] 本發(fā)明還公開了小分子抑制劑MLN4924在制備抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化早 期炎癥過程的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提出了一種新的小分子抑制劑MLN4924在制備抑制炎癥反應(yīng)中NF- κ B 和MPK信號(hào)通路的激活的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)CRL的底物包括NF- κ B抑制因 子I κ B- α，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MLN4924可有效抑制炎癥反應(yīng)。小分子抑制劑MLN4924可抑制 NF- κ B負(fù)調(diào)控因子I κ B- α的降解從而阻斷NF- κ B信號(hào)通路的激活；另一方面，小分子抑 制劑MLN4924還可抑制Ρ38、Erk、Jnk的磷酸化，從而抑制MAPK信號(hào)通路的激活。
[0014] 本發(fā)明中，所述"炎癥反應(yīng)"是包括炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)受損肺組織、細(xì)胞因子和趨 化因子在受損肺組織細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞中大量表達(dá)、肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上 升、肺組織濕干比上升等。
[0015] 本發(fā)明中，在所述炎癥反應(yīng)中，小分子抑制劑MLN4924可抑制上皮細(xì)胞中IL-8、 CXCL5、KC等趨化因子的表達(dá)。
[0016] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明研究表明MLN4924可有效抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小 鼠肺纖維化病變，明顯改善博來(lái)霉素引起的小鼠肺泡炎及肺纖維化癥狀。在一個(gè)具體實(shí)施 方案中，本發(fā)明研究表明MLN4924可有效抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化早期急性肺 損傷，有效減輕LPS(脂多糖）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明 研究表明MLN4924有效抑制小鼠急性肺損傷的分子機(jī)制，MLN4924可以顯著抑制炎癥反應(yīng) 中NF- κ B和MAPK信號(hào)通路的激活，抑制炎癥的發(fā)生，MLN4924可通過抑制早期炎癥過程 來(lái)抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的分子機(jī)制。本發(fā)明研究表明，小分子抑制劑MLN4924對(duì) EMT (上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）過程沒有明顯的影響。小分子抑制劑MLN4924在其可發(fā)揮抑制炎癥的 濃度（0.5 μM)時(shí)，對(duì)中性粒細(xì)胞的凋亡沒有明顯的影響。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1表示MLN4924顯著抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
[0018] 圖I(A)表示，用博來(lái)霉素和MLN4924共同處理小鼠，只用博來(lái)霉素處理小鼠或不 做任何處理后，對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行HE (蘇木精-伊紅）染色和MASSON染色的結(jié)果。
[0019] 圖I(B)表示，用圖UA)所述方法處理小鼠后，對(duì)小鼠肺纖維化程度的組織學(xué)評(píng) 分。
[0020] 圖I(C)表示，用圖UA)所述方法處理小鼠后，小鼠肺泡灌洗液中羥脯氨酸的含 量。
[0021] 圖I(D)表示，用圖1⑷所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織中Collagenl和 Collagen3的表達(dá)量。
[0022] 圖2表示MLN4924對(duì)EMT過程沒有顯著影響。
[0023] 圖3表示MLN4924可以顯著抑制LPS (脂多糖）誘導(dǎo)的急性肺損傷。
[0024] 圖3(A)表示，用LPS和MLN4924共同處理小鼠，只用博來(lái)霉素處理小鼠或不做任 何處理后，對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行HE和MASSON染色的結(jié)果。
[0025] 圖3(B)表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織濕干比的變化。
[0026] 圖3(C)表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺泡灌洗液中的總蛋白量的變 化。
[0027] 圖3(D，E，F(xiàn))分別表示，用圖3㈧所述方法處理小鼠后，小鼠肺組織中細(xì)胞因子 IL-I β (白介素-1 β )