一種長鏈非編碼rna mrak053938在制備治療肺纖維化藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一個長鏈非編碼RNA-MRAK053938基因序列 在預防和治療特發(fā)性肺纖維化中的應用。
【背景技術】
[0002] 長鏈非編碼 RNA (long noncoding RNA，IncRNA)是由 Okazaki 等在 2002 年對小鼠 全長互補DNA(cDNA)文庫測序時首次發(fā)現(xiàn)的一類長度超過200nt的RNA分子，占哺乳動物 基因組序列4 %~9 %，它們缺乏蛋白編碼功能，位于細胞核或細胞質中，具有明顯的細胞、 組織特異性和發(fā)育階段特異性。IncRNA作為一類新的具有調控功能的非編碼RNA，其強大 的調控作用及復雜的調控機制引起了研究者的廣泛關注。隨著IncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，研究人 員越來越關注其在各種生物學過程以及疾病中的表達變化及調控機制。研究表明，IncRNA 的異常表達與人類多種疾病相關,如白血病、冠心病、糖尿病、阿爾茨海默病、自閉癥、非小 細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)、肝癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺纖維 化等，是重要的藥物作用及分子治療靶標。
[0003] 肺纖維化臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難并伴有刺激性干咳，肺功能為限制性通氣障 礙，病情一般持續(xù)惡化，最終因呼吸衰竭而死亡。近年來，由于環(huán)境污染導致的霧霾，使肺 纖維化的發(fā)病率逐年上升，一旦確診為肺纖維化，患者大多生存時間只有3至5年，病死率 高，五年生存率僅為23%，其治療仍屬世界性難題。傳統(tǒng)的治療以皮質激素類藥物為主，臨 床研究結果顯示這些藥物不能有效抑制肺纖維化的發(fā)生，反而可加重某些重癥患者肺纖維 化程度，亟需尋找新的、有效的治療肺纖維化的方法。本發(fā)明應用RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn) MRAK053938能夠抑制肺肌成纖維細胞的活化和遷移，是潛在的治療肺纖維化疾病的分子和 藥物靶點，具有很好的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一個長鏈非編碼RNA(lncRNA-MRAK053938)基因的應用方 法，具體為該基因在預防和治療肺纖維化中的應用。
[0005] 本發(fā)明所涉及的長鏈非編碼RNA(lncRNA-MRAK053938)基因序列如下所示（SEQ ID NO ：1)：
[0006] TTAAATTATTTCATGTAATTTATCCTCTGAAGAAGACAGTGTCTAGTTAGAAACACGAGGATCTTCATA TTGCATTCATTGCCCTTAAATGGCTCTCTTCTCTTCAAAGAAATGGTGGAAGGATGACATCAATTTTACAAGTTCAG GAGTGGACCCCAAAATTCTAGAAATGGTTTAAATCAAAATTACAAATATTCACTCAATGATACAAACAAAATGTTTA TTTTTGGTGAAATTTTGCTCTGTATGAAATTCACATTGAATTATGAAAATGTACA ATATTCGGGGTTCTCTTGCAT ATTTACAGTTTTTTCTACTTATACACATAGTTGAATCAACCATTATTTAGAGCTAAAAAAATACCTTTTCCCTAAAT GTGAATTATTCGTAAAATCCAAAATAACATAGCAAAATCATTTCGTTTTAAGATGAAATTTTTACTTGCAAATTTTA TATTAATAATGCAAATATTTTAGAATCATGGCTTGGACTTTATCAGTCAAGTCTCCAAATGTAAAGAAAACACACCT CCACTGTGTTACTTAAAAACTAAATACTGAGAAGTATTTGAAGGACTGGTGCTGGTTTTATAATAATAATAAGGTTC TCGGAATTTAACGTATTTATAAAATTGTTGCCTCTATCCTGAGATTAGGGGACCCAGCCATACTGGTTTTATATCTA TTACTGAGCTGGTAATCAATGTCAGTTTTGTAAAATGAGGGAAATATTTTTCTATATTTTCTATCTCTCCAAATACA TTTTAAACCAGAAAAAATAATAATCCAATTTCTGATGAGGTGTTTGGTGACTTCCAAACAGTAAGAGTCACTGACAT TTCCATCATGCTACAATGGCTTTTATCTTTTCTTACTATAGGACTCAGCCTTCTATAAAGATCTGGACAATTCCTAT TAGAGAAACCACTGAGTAATATTTTAAAACTGTAACAAATAAATAGAATCTATCCTGAACTCTCAGGCCACACCTTT AATCACAGCTGTGTGTGGTTTGCCCGAATGTGCTTCCCTGGAATTAGTTTCAGTTCCTTATGGCCCTTTCATTAAGC CTCTCTAGTTTTTATCTTTTCTATAAGTGGAATCTATTCTAAAAGTATGTGTTACTTTCTTATATTTTCAT
[0007] AAGAAAAAGTGTTGAAGTATCTTTACCATTTAAGTGTTCTCAGAATAGAGTTTAGACATTGGAGAAATG TTTTCCATGAAGATCAAAATGTACTATGTCCTGAATATTGGACAACATGAAAATATGTTGTAGGTCACCATGTTCTG GGGTTGTTACAGACTATGGAAGAAAGCTGTAGAATATGCCTCGTAACCTAAACTCTATTCAGTTCTTTTTCTTGGAA AACAAAAAAGATTAATTTTATTTGC
[0008] 本發(fā)明設計出一個針對該lncRNA-MRAK053938基因的干擾序列，其是由SEQ ID NO :2所示的第一鏈和與其互補的SEQ ID NO :3所示的第二鏈通過堿基配對組成的RNA雙 鏈分子第一鏈和第二鏈各自在3'末端設計有兩個突出的堿基dT ;該干擾雙鏈RNA分子結 構如下：
[0009]
[0010] 本發(fā)明的目的通過下列步驟來實現(xiàn)：通過設計上述特異性的針對 lncRNA-MRAK053938的干擾序列，將其轉染至細胞中，起到下調lncRNA-MRAK053938表達的 作用，從而實現(xiàn)防治肺纖維化的目的。
【附圖說明】
[0011] 圖1是MRAK053938的表達變化圖：
[0012] A為lncRNA-MRAK053938在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織 中的表達變化；B為lncRNA-MRAK053938在TGFP 1誘導激活的RLE-6TN細胞中的表達變化； C為lncRNA-MRAK053938在TGFP 1誘導激活的RLl細胞中的表達變化。
[0013] 圖2是MRAK053938的siRNA干擾片段對肌成纖維細胞激活相關蛋白a -SMA表達 的影響圖：
[0014] A為a-SMA在給與不同處理RLE-6TN細胞中的表達變化；B為a-SMA在給與不同 處理細胞RLl中的表達變化。
[0015] 圖3是MRAK053938的siRNA干擾片段對肌成纖維細胞遷移能力的結果圖。
[0016] 圖4是miR-708-3P的表達變化圖：
[0017] A為miR-708_3P在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織中的表 達變化；B為miR-708-3P在給與不同處理RLE-6TN和RLl細胞中的變化圖。
[0018] 圖5是Vimentin的表達變化圖：
[0019] A為Vimentin在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織中的表達 變化；B為Vimentin在給與不同處理RLE-6TN細胞中的表達變化；C為Vimentin在給與不 同處理細胞RLl中的表達變化。 具體實施例
[0020] 下面的實例用以解釋本發(fā)明，但是并非對本發(fā)明實質內容的限制。
[0021] 實施例1. lncRNA-MRAK053938在正常肺組織與纖維化組織中的表達情況
[0022] - .材料SD大鼠，雄性，體重200±20克，清潔級，由山東綠葉制藥股份有限公司 實驗動物中心提供，合格證號：SYXK (魯）20030020,在清潔級動物觀察室，適應性喂養(yǎng)3天； 正常肺上皮細胞株（RLE-6TN)、成纖維細胞株（RLl)購自ATCC細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、高 糖 DMEM 培養(yǎng)基（DMEM-LG)、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國 Hyclone 公 司；TGF-β 1購自invitrogen公司；riboFECT? CP轉染試劑（銳博生物科技有限公司，廣 州，中國）；SYBR Green PCR Master Mix(TAKARA，大連，中國）。
[0023] 二·方法
[0024] 1.制備大鼠肺纖維化模型：30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組，大鼠用4%水 合氯醛（lml/lOOg體重）腹腔麻醉，麻醉后將其仰臥固定，用碘氟消毒皮膚，無菌操作下切 開長約Icm的頸中切口，逐層分離暴露氣管（如室溫低，注意保溫），模型組大鼠氣管內一 次性注入博萊霉素溶液（5mg/kg)，正常組大鼠注入等體積無菌生理鹽水；注射完畢縫合皮 膚，手術部位用碘氟或青霉素消毒預防感染，室溫保持在24°C~25°C待蘇醒，動物自然清 醒后常規(guī)飼養(yǎng)。
[0025] 2.細胞培養(yǎng)及分組：RLE-6TN細胞于含10%胎牛血清的RPMl 1640培養(yǎng)液，RLl細 胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37°C、5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。選取處于 對數(shù)生長期的細胞，制成單個細胞懸液，接種于六孔培養(yǎng)板。設空白對照組、TGF-β 1刺激 組，待細胞生長