專利名稱：同時(shí)制備magnoloside A和magnoloside B化學(xué)對(duì)照品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)制備magnolosideA和magnoloside B化學(xué)對(duì)照品的制備工藝。主要包括提取、溶劑萃取、樹(shù)脂柱分離及中壓反相液相富集和高壓反相液相制備四步高
效純化，收集流份、干燥即可同時(shí)獲取兩種對(duì)照品。其結(jié)構(gòu)式如下
OHOH
背景技術(shù)：
厚樸為大宗常用中藥材之一，具有燥濕消痰、下氣除滿的功能，用于濕滯傷中、脫痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳。厚樸酚與和厚樸酚被認(rèn)為是厚樸的活性成分，同時(shí)也是《中國(guó)藥典》中厚樸藥材含量測(cè)定的成分；余盛賢等報(bào)道了苯乙醇苷類化合物為厚樸水溶性部位的主要成分，指出苯乙醇苷-magnoloside A在厚樸的產(chǎn)地加工過(guò)程中含量有較大變化(中國(guó)中藥雜志，2010，35 (14) 1831-1835)。苯乙醇苷類化合物具有廣泛的生物活性，而對(duì)中藥厚樸中苯乙醇苷類化合物的化學(xué)成分研究少有報(bào)道，對(duì)苯乙醇苷類成分的定性定量研究更是未見(jiàn)報(bào)道。因此，制備magnoloside A, magnoloside B對(duì)照品對(duì)于厚樸藥材及相關(guān)復(fù)方的多指標(biāo)質(zhì)量控制具有重要意義。目前，對(duì)照品市場(chǎng)上也未見(jiàn)magnoloside A和magnoloside B的供應(yīng)，其分離制備方法也少有報(bào)道。Hasegawa takashi首次報(bào)道了從日本厚樸(Magnolia obovata)中分離得至Ij magnoloside A 禾口 magnoloside B，并申請(qǐng)了新化合物專利(JP 63310899)。其制備步驟如下日本厚樸用甲醇提取物，混懸于水中，經(jīng)正丁醇萃取，正丁醇萃取部位反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析純化，最后經(jīng)HW-40F純化得到純品。該方法制備工藝較為復(fù)雜，制備周期較長(zhǎng)，且沒(méi)有進(jìn)行純度檢驗(yàn)。本發(fā)明以厚樸為原料，經(jīng)醇提取得到提取物，通過(guò)萃取、樹(shù)脂柱分離、反相中壓液相色譜制備和反相高效液相制備色譜四步高效純化，收集相應(yīng)流份，干燥，可批量同時(shí)獲取兩個(gè)個(gè)對(duì)照品。
三、發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種工藝較簡(jiǎn)單、易規(guī)?；闹苽湫路椒?，從厚樸中同時(shí)制備純度大于98%的magnoloside A和magnoloside B兩種化學(xué)對(duì)照品，制備規(guī)模為克級(jí)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案(1)將厚樸藥材粉碎，得到粗粉，用70%乙醇水加熱回流提取。(2)將(1)乙醇水提取的提取液濃縮至2g生藥/mL，用等體積的氯仿萃取三次。(3)將(2)中萃取后的水溶液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，用5倍柱體積的蒸餾水洗脫除雜，再用5倍柱體積20%乙醇水洗脫。(4)將(3)中20%乙醇水洗脫液濃縮至干，用0% -25%的甲醇水溶解，配置成濃度為 lOO-lOOOmg/mL。(5)中壓反相制備色譜柱的填充填料為C18，制備柱長(zhǎng)30-100cm、直徑2-5cm ；采用的流動(dòng)相為A:甲醇；B:pH 3-4的醋酸水溶液，兩相溶劑以按照體積分?jǐn)?shù)比為11 89到35 65進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量與色譜填料的比為1 30-1 100，流速控制在15-100ml/min ；收集兩個(gè)主峰。(6)兩個(gè)主峰收集液分別濃縮，經(jīng)高壓反相制備液相純化，填充填料為C18，制備柱長(zhǎng)25-50cm，直徑2-5cm ；采用的流動(dòng)相為30%甲醇水等度洗脫，流速為lO-lOOmL/min。(7)收集液40°C低壓回收有機(jī)溶劑，然后凍干。以本發(fā)明從厚樸中分離magnoloside A和magnoloside B化學(xué)對(duì)照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步(1)本發(fā)明針對(duì)性強(qiáng)，工藝較簡(jiǎn)單。氯仿萃取除去厚樸中的脂溶性化合物，再經(jīng)大孔樹(shù)脂分離，最大程度地富集目標(biāo)產(chǎn)物，有利于中壓反相制備色譜中填料的保護(hù)和分離效果的提高；中壓反相液相制備較文獻(xiàn)反復(fù)硅膠柱層析，具有較好的重現(xiàn)性和快速等優(yōu)點(diǎn)；高壓制備液相中采用甲醇-水溶劑等度洗脫，不需平衡柱子，提高了效率、節(jié)約了試劑。(2)本發(fā)明中采用的技術(shù)手段適于放大進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。大孔樹(shù)脂具有價(jià)格便宜、可再生反復(fù)使用等特點(diǎn)，適于規(guī)模化生產(chǎn)；采用的中壓反相色譜和高壓反相色譜也具有規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。(3)本發(fā)明得到的對(duì)照品具有純度高(大于99% )，色澤較好(淡黃色)。
四

圖 1 為 magnoloside A 的 HPLC 分析圖譜(3^nm)；圖 2 為 magnoloside B 的 HPLC 分析圖譜(3^nm)；圖 3 為 magnoloside A 的 1H-NMR 圖譜；圖 4 為 magnoloside A 的 13C-NMR 圖譜；圖 5 為 magnoloside B 的 1H-NMR 圖譜；圖 6 為 magnoloside B 的 13C-NMR 圖譜；圖7為厚樸中制備magnolosideA和magnoloside B對(duì)照品的工藝流程圖。
五具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。厚樸干燥樹(shù)皮8. Okg,粉碎，用4倍量70%乙醇加熱回流提取池，提取3次，濃縮至4L，用4L氯仿萃取3次。水部位經(jīng)4L的DlOl大孔樹(shù)脂分離，5倍柱體積蒸餾水洗脫除雜后，再用5倍柱體積的20%乙醇洗脫，收集20%乙醇洗脫部分，濃縮干燥得棕色浸膏250g。取浸膏50g，用50mL 20%甲醇溶解，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，注入反相中壓色譜柱，色譜柱直徑5cm，長(zhǎng)50cm，色譜柱的填充填料為50 μ m C18 (YMC)，流速控制為100mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為328nm，流動(dòng)相梯度為0-1001^11,11^-35%甲醇-醋酸水(pH = 3)。收集兩個(gè)主峰，40°C減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，得至丨J magnoloside A 10. 5g, magnoloside B 7g。反相高壓液相制備取magnoloside A粗品1. 5g，溶于IOmL 20%甲醇水中，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，吸取ImL濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離，柱長(zhǎng)度為25cm，內(nèi)徑2cm，流速IOmL/min,合理收集主峰得到IOOmg的magnoloside A，純度大于98%。吸取5mL濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離，柱長(zhǎng)度為50cm，內(nèi)徑5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到480mg的magnoloside A，純度大于98%。外觀為淡黃色粉末。取magnoloside B粗品1. 5g，溶于IOmL 20%甲醇水中，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，吸取ImL濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離，柱長(zhǎng)度為25cm，內(nèi)徑2cm，流速lOmL/min，合理收集主峰得到90mg的magnoloside B,純度大于98%。吸取5mL濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離，柱長(zhǎng)度為50cm，內(nèi)徑5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到400mg的magnoloside B,純度大于98%。外觀為淡黃色粉末。
權(quán)利要求
1.同時(shí)制備magnolosideA和magnoloside B化學(xué)對(duì)照品的方法，其特征在于厚樸藥材經(jīng)醇提取得粗提物，經(jīng)萃取、樹(shù)脂柱分離、反相中壓液相制備及反相高效液相制備四步高效純化，同時(shí)獲取純度大于98%的magnoloside A和magnoloside B兩種化學(xué)對(duì)照品；具體步驟如下(1)提取和萃取厚樸藥材用乙醇溶液提取得粗提物，回收乙醇并濃縮至一定體積，用氯仿萃取除掉脂溶性雜質(zhì)。(2)樹(shù)脂柱粗分水層經(jīng)樹(shù)脂柱分離，先以水洗脫除去雜質(zhì)，然后以體積分?jǐn)?shù)在20%-30%之間的任一乙醇溶液洗脫，收集相應(yīng)乙醇洗脫物，濃縮干燥得棕色浸膏。(3)反相中壓液相色譜富集和高效液相制備色譜精制棕色浸膏用水或低濃度甲醇溶液溶解，微孔濾膜過(guò)濾，反相中壓液相色譜分離，以甲醇-醋酸水溶液為洗脫體系，紫外檢測(cè)器328nm下監(jiān)測(cè)，收集圖譜中兩個(gè)主要的色譜峰，蒸干，即可得到純度大于85%的magnoloside A和magnoloside B粗品；再經(jīng)反相高效液相制備色譜分離，甲醇-水溶液為洗脫體系，即可得到純度大于98%的對(duì)照品，其外觀為淡黃色粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中提取溶劑可為0-95%乙醇。其用量是藥材的4-10倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中加熱回流提取的時(shí)間為1-2小時(shí)，提取次數(shù)為2-4次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中濃縮至l_2g生藥/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中氯仿的用量為被萃取溶液體積的1-2倍，萃取次數(shù)2-3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟O)中粗分離中采用的樹(shù)脂為D101、HPD 100、Diaion HP-20 或AB-8。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟O)中各梯度洗脫的體積為3-5倍柱體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C3)樣品用水或者為體積分?jǐn)?shù)不高于25%的甲醇溶解，樣品濃度為lOO-lOOOmg/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中反相中壓液相制備柱的填充填料為C18，制備柱長(zhǎng)30-100cm、直徑2_5cm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C3)中反相高壓液相制備柱的填充填料為C18，制備柱長(zhǎng)25-50cm、直徑2_5cm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中反相中壓液相采用的流動(dòng)相為甲醇利含醋酸的水溶液兩相體系，醋酸水的PH值為3-4，兩相溶劑以體積分?jǐn)?shù)比為11 89 35 65進(jìn)行梯度洗脫，流速為30-100mL/min。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C3)中反相高壓制備液相進(jìn)樣體積為l-50mL，流速控制在10-200mL/min ；采用的流動(dòng)相為30%甲醇水溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中反相中壓液相和反相高壓制備液相上樣量與填料之比為1 30-1 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時(shí)制備magnoloside A和magnoloside B化學(xué)對(duì)照品的制備工藝。厚樸藥材經(jīng)醇提取得粗提物，經(jīng)萃取、樹(shù)脂柱分離、反相中壓液相色譜制備和反相高效液相色譜制備四步高效純化，即可獲得純度大于98％的magnoloside A和magnoloside B兩種化學(xué)對(duì)照品。本發(fā)明工藝步驟較簡(jiǎn)單、純度高、色澤好，并且適于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H1/08GK102391328SQ20111025932
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者余盛賢, 晏仁義, 楊濱 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所