一種化學?酶法制備熊去氧膽酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化學?酶法制備熊去氧膽酸的方法，以鵝去氧膽酸為初始底物，依次經(jīng)過化學法和生物酶法制備熊去氧膽酸，期間采用了7?KLCA還原酶作為生物催化劑，不會出現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中采用化學法制得7?酮石膽酸過程中殘留的氧化劑導致后期酶失活的情況發(fā)生，且采用本發(fā)明的制備方法所制得的產(chǎn)物的ee值高，綜合成本低。
【專利說明】
一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)結(jié)構(gòu)如式1所示，用于治療膽固醇型膽 結(jié)石，形成及膽汁缺乏性脂肪瀉，也可用于預防藥物性結(jié)石形成。
[0003]
[0004]目前已經(jīng)公開的制備熊去氧膽酸的方法中，"活熊引流取膽"的方法由于與野生動 物保護法規(guī)沖突，且違反人道主義，受到限制。因此，從家禽的膽汁中提取膽酸類物質(zhì)，如鵝 去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，⑶CA)并轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸的方法的報道較多（式2)。 例如專利CN201210473483等報道了將CDCA酶法氧化為7-酮石膽酸(7-KLCA)，后經(jīng)酶法還原 獲得UDCA的方法，由于采用的兩步酶反應的輔酶均沒有循環(huán)再生，因此需按當量加入，用量 較高(式3)。而專利201310002127.2等報道了將CDCA化學法氧化為7-KLCA，并化學法還原為 UDCA?；瘜W法通常采用NBS等氧化劑，和硼氫化鈉或醇鈉等還原劑，存在的問題是產(chǎn)物ee不 高，通常僅為90%，因此需要額外的后處理步驟，降低了收率，提高了成本(式4)。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種化學-酶法制備熊去氧膽酸 的方法。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方 法，包括如下步驟：
[0009] 1)以鵝去氧膽酸為底物，在酒石酸及溶劑條件下，室溫加入氧化劑，氧化反應生成 7-酮石膽酸，其中，所述的溶劑為甲醇，所述的氧化劑為次氯酸鈉溶液，起始反應體系中，所 述鵝去氧膽酸的底物濃度為0.1~〇.2g/mL;所述酒石酸與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比為1:2 ~1:3，所述氧化劑與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比為4:1~6:1;
[0010] 2)以步驟1)制得的7-酮石膽酸為底物，在生物催化劑、輔因子和輔酶再生系統(tǒng)的 存在下，發(fā)生還原反應生成目標產(chǎn)物熊去氧膽酸，其中，所述的生物催化劑為7-KLCA還原 酶，所述的輔酶再生系統(tǒng)為一水葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述反應在溫度為25~40°C、pH為 6~7的水相緩沖溶液中，在助溶劑條件下進行，其中，所述的一水葡萄糖:7-KLCA還原酶:葡 萄糖脫氫酶:7-酮石膽酸的投料質(zhì)量比為:0.8~1.2:0.005~0.02:0.005~0.02:1。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟2)中的輔因子為NADP，所述輔因子與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比 為0.001~0.0005:1。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟2)在pH為6.5的磷酸緩沖溶液進行。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述的助溶劑為正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助 溶劑的投料體積為反應總體積的5%~30%。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2)中的葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌號 為EW002的葡萄糖脫氫酶。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟2)中的7-KLCA還原酶的基因序列與序列1-20中的任一序列具有 至少90 %的同源性。
[0016] 進一步優(yōu)選地，所述7-KLCA還原酶是在非致病微生物中的表達產(chǎn)物。
[0017] 更進一步優(yōu)選地，所述的非致病微生物為大腸桿菌。
[0018] 優(yōu)選地，具體實施過程如下：
[0019] 1)將鵝去氧膽酸、酒石酸加入到甲醇中，室溫條件下攪拌滴加次氯酸鈉溶液，滴加 完畢后，攪拌反應，HPLC檢測反應進程，當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率達90~99 %時，反應結(jié)束，加入亞硫酸 鈉，攪拌加水過濾，得到7-酮石膽酸；
[0020] 2)在反應容器中，依次加入步驟1)得到的7-酮石膽酸、所述的一水葡萄糖及緩沖 溶液，在25~40°C、pH為6~8的水浴鍋中，400~450rpm攪拌均勻，而后加入所述的助溶劑， 待攪拌均勻后加入所述的7-KLCA還原酶、葡萄糖脫氫酶、輔因子進行還原反應，控制反應體 系pH在6 · 5 ± 0 · I，HPLC檢測反應進程，當轉(zhuǎn)化率達90-99 %時，調(diào)節(jié)體系pH至3 · 0~3 · 2，等體 積乙酸乙酯多次萃取、合并有機相，調(diào)節(jié)pH至9.5~9.7,等體積水反萃取，合并水相，并旋蒸 得到熊去氧膽酸產(chǎn)品。
[0021] 由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點:本發(fā)明的化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法，采用了化學法將鵝去氧膽酸氧化成7-酮石膽酸，再通過生物 酶法將7-酮石膽酸還原至熊去氧膽酸，期間所采用的生物催化劑為7-KLCA還原酶，并對第 一步氧化過程進行了優(yōu)化，有效地杜絕了現(xiàn)有技術(shù)中采用在采用化學法制備7-酮石膽酸過 程中殘留的氧化劑導致第二步還原過程中酶失活的情況發(fā)生，大大提高了產(chǎn)物的ee值，且 綜合成本更低。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明的反應式如下：
[0024]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施 例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進一步調(diào)整，未注明的實施 條件為常規(guī)實驗中的條件。
[0025] 實施例1制備7-KLCA
[0026] 將⑶CA 5g，酒石酸2g加入50ml甲醇中，室溫攪拌10分鐘。緩慢滴加次氯酸鈉溶液 (活性氯5 % )25mL，3小時滴加完畢，繼續(xù)攪拌5小時，HPLC監(jiān)控反應，轉(zhuǎn)化率99 %。反應結(jié)束 后，加入亞硫酸鈉0.5g，攪拌后加入水200mL，過濾得7-KLCA 5g，含量95 %。
[0027] 實施例2制備UDCA
[0028] 向1001^三口反應燒瓶中，加入587-1^0厶，48-水葡萄糖，4511^0.謂？!16.5的 PBS緩沖溶液，置于35 °C水浴鍋中，400-450rpm機械攪拌5min;
[0029] 向反應瓶中加入5mL正己醇，曲拉通X-100 0.25mL，待攪拌均勻后，向反應瓶中加 入7-KLCA還原酶（由序列20在大腸桿菌中表達獲得)0.1g、葡萄糖脫氫酶(來自蘇州漢酶生 物技術(shù)有限公司，編號EW002)0.1g，NADP 0.005g，開始反應，反應過程中用IM NaOH溶液控 制pH在6.5 ±0.1。4小時后反應完畢，調(diào)節(jié)pH至3.0，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機相， 調(diào)節(jié)pH至9.5，等體積水反萃取三次，合并水相，旋蒸得到產(chǎn)品4.7g，HPLC檢測產(chǎn)品含量為 95%，純度 98 %。
[0030] 上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明 精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 以鵝去氧膽酸為底物，在酒石酸及溶劑條件下，室溫加入氧化劑，氧化反應生成7-酮 石膽酸，其中，所述的溶劑為甲醇，所述的氧化劑為次氯酸鈉溶液，起始反應體系中，所述鵝 去氧膽酸的底物濃度為0.1~0.2g/mL;所述酒石酸與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比為1:2~1:3， 所述氧化劑與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比為4:1~6:1; 2) 以步驟1)制得的7-酮石膽酸為底物，在生物催化劑、輔因子和輔酶再生系統(tǒng)的存在 下，發(fā)生還原反應生成目標產(chǎn)物熊去氧膽酸，其中，所述的生物催化劑為7-KLCA還原酶，所 述的輔酶再生系統(tǒng)為一水葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述反應在溫度為25~40°C、pH為6~7的 水相緩沖溶液中，在助溶劑條件下進行，其中，所述的一水葡萄糖:7-KLCA還原酶:葡萄糖脫 氫酶:7-酮石膽酸的投料質(zhì)量比為:0 · 8~1 · 2:0 · 005~0 · 02:0 · 005~0 · 02:1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中 的輔因子為NADP，所述輔因子與鵝去氧膽酸的投料質(zhì)量比為0.001~0.0005:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)在 pH為6.5的磷酸緩沖溶液進行。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中， 所述的助溶劑為正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助溶劑的投料體積為反應總體積的 5%~30%〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，步驟2)中的葡 萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌號為EW002的葡萄糖脫氫酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中 的7-KLCA還原酶的基因序列與序列1 -20中的任一序列具有至少90%的同源性。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述7-KLCA還 原酶是在非致病微生物中的表達產(chǎn)物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述的非致病 微生物為大腸桿菌。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，具體實施過程 如下： 1) 將鵝去氧膽酸、酒石酸加入到甲醇中，室溫條件下攪拌滴加次氯酸鈉溶液，滴加完畢 后，攪拌反應，HPLC檢測反應進程，當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率達90~99%時，反應結(jié)束，加入亞硫酸鈉，攪 拌加水過濾，得到7-酮石膽酸； 2) 在反應容器中，依次加入步驟1)得到的7-酮石膽酸、所述的一水葡萄糖及緩沖溶液， 在25~40 °C、pH為6~8的水浴鍋中，400~450rpm攪拌均勻，而后加入所述的助溶劑，待攪拌均 勻后加入所述的7-KLCA還原酶、葡萄糖脫氫酶、輔因子進行還原反應，控制反應體系pH在 6.5 ± 0.1，HPLC檢測反應進程，當轉(zhuǎn)化率達90-99%時，調(diào)節(jié)體系pH至3.0~3.2，等體積乙酸乙 酯多次萃取、合并有機相，調(diào)節(jié)pH至9.5~9.7，等體積水反萃取，合并水相，并旋蒸得到熊去 氧膽酸產(chǎn)品。
【文檔編號】C12P33/06GK106086149SQ201610439896
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】張躍
【申請人】蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司