三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備方法及所述的三維紙基比率計(jì)在鋅離子檢測中的應(yīng)用。通過蠟打印技術(shù)在紙芯片上制備工作區(qū)，并借助絲網(wǎng)印刷技術(shù)，印制三電極，進(jìn)而對工作區(qū)功能化，實(shí)現(xiàn)了亞甲基藍(lán)和鄰苯二胺兩種電活性物質(zhì)的雙重信號放大，利用金屬離子識別模擬酶鏈，斷裂底物鏈，借助電化學(xué)工作站，實(shí)現(xiàn)Zn2+的高靈敏、便攜式檢測。
【專利說明】
三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備方法，更具體地說是一種三維紙基電化學(xué)比率計(jì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)平臺的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]防治水體污染，對環(huán)境保護(hù)以及人類的健康至關(guān)重要。一些無機(jī)污染物，特別是金屬離子，如Pb2+，Mg2+，Zn2+，Hg2+等是水體污染中常見的物質(zhì)，但目前廣泛使用的色譜法、熒光檢測方法所需儀器昂貴，且儀器相對笨重，不利于即時現(xiàn)場檢測。因此，尋找和建立一種低成本、高效快速金屬離子的檢測方法成為科研工作者的任務(wù)之一。
[0003]紙，作為中國的四大發(fā)明產(chǎn)物之一，廣泛應(yīng)用在書寫、印刷、繪畫、包裝等領(lǐng)域。眾橫交錯的紙纖維使得紙內(nèi)部呈現(xiàn)三維多孔結(jié)構(gòu)，且紙纖維表面富含豐富的含氧基團(tuán)，因此，易于實(shí)現(xiàn)紙纖維的表面功能化。近年來，功能化紙基實(shí)驗(yàn)檢測平臺規(guī)模日益擴(kuò)增，由簡單的醫(yī)療工具驗(yàn)孕棒發(fā)展到各式各樣的生物傳感器件，包括紙基電化學(xué)生物傳感器，紙基光電化學(xué)生物傳感器，紙基比色生物傳感器，紙基電化學(xué)發(fā)光生物傳感器等。
[0004]電化學(xué)生物傳感器，因其具有低成本、靈敏度高，易于實(shí)現(xiàn)小型化及集成化，且所需儀器簡單等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的電化學(xué)生物傳感器攜帶不便，且容易受到外部環(huán)境的影響，如電解液PH的變化、H2O2濃度的改變等，而使得測定結(jié)果準(zhǔn)確度降低。為了解決這一問題，我們首次將比率型熒光檢測方法的思想引入到電化學(xué)生物傳感器中，結(jié)合功能化紙芯片，我們構(gòu)建了一種新型的紙基電化學(xué)比率計(jì)檢測平臺，所構(gòu)建的生物傳感平臺不僅具有低成本、可折疊、易于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，同時檢測結(jié)果靈敏度以及準(zhǔn)確度獲得大幅度的提高，因此，所構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)平臺有望在資源有限、經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對落后的邊遠(yuǎn)地區(qū)得到應(yīng)用及推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對目前存在的問題，本發(fā)明制作了一種成本低、準(zhǔn)確度高且攜帶方便的三維紙基電化學(xué)比率計(jì)并將其應(yīng)用到Zn2+的檢測中。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的:一種三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備，其特征是包括以下步驟:
(1)在計(jì)算機(jī)上利用Al軟件設(shè)計(jì)如附圖1所示的比率型電化學(xué)紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
(2)將比率型電化學(xué)紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機(jī)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區(qū)域；
(3)采用絲網(wǎng)印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟
(2)中所得紙上，樣式如附圖2所示，其中右側(cè)為工作區(qū)，上面印有工作電極，左側(cè)為參比區(qū)，上面印有參比電極和對電極； (4)對(3)中親水區(qū)域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，其堿基序列如核苷酸序列表所示，固定在親水區(qū)域，實(shí)現(xiàn)信號的第一次放大，隨后用巰基己醇封鎖活性位點(diǎn)；
(5)將一定濃度的亞甲基藍(lán)修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的引物鏈，定義為鏈3，其堿基序列如核苷酸序列表所示，按一定比例混合在一起，然后加入到(4)所得電極表面43 °C下反應(yīng)3 h;
(6)將一定濃度的環(huán)形模板探針，定義為鏈4，其堿基序列如核苷酸序列表所示，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應(yīng)2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環(huán)擴(kuò)增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應(yīng)I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面，完成滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)二次信號放大；
(7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得電極表面，混勻，室溫下反應(yīng)40min；
(8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學(xué)工作站，在-0.8?O V電位范圍內(nèi)，測定亞甲基藍(lán)和鄰苯二胺的電流強(qiáng)度；
(9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍(lán)電流強(qiáng)度比率的變化與Zn2+濃度關(guān)系曲線，完成Zn2+的測定；
步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙；
步驟(4)中所述親水區(qū)域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長石墨烯導(dǎo)電層，而后滴加殼聚糖溶液:向紙芯片表面三次重復(fù)滴加氧化石墨烯的溶液，室溫下干燥后，將滴加有氧化石墨烯的紙芯片轉(zhuǎn)移到含有0.1 M Na2SO4溶液中，0.9 V電位下，電還原氧化石墨烯，反應(yīng)完成后將紙芯片取出，二次水清洗表面，再次室溫下干燥即可獲得生長有石墨烯的紙芯片，而后在紙芯片表面滴加2.0 yL的0.5 mg mL—1的殼聚糖，室溫下干燥40 min。
[0007]步驟(4)中所述修飾有Au納米粒子-鐵卩卜啉金屬有機(jī)框架材料的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，其特征在于:首先制備鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料，即39.54 mg的5，10，15，20-四(四羧基)-21!1，23!1-卟啉和40.55 mg氯化鐵，0.1 M的鹽酸加入到12 mL的體積比1:2混合的二甲基甲酰胺和乙醇的混合液中，超聲40 min，隨后將混合液150 °C反應(yīng)50 h，反應(yīng)停止后將產(chǎn)物用二甲基甲酰胺和乙醇清洗三次，而后將產(chǎn)物60 °(:真空干燥，即可獲得鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料;其次制備Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料:稱取6 mg的上述制備的鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料，將其溶解到I mL的乙醇中，然后將其分散到0.2 mL的氨水、13.8 mL乙醇、1.8 mL四甲氧基娃燒混合液中，室溫下攪拌2 h，將產(chǎn)物于12000 r/min離心10 min,用乙醇清洗產(chǎn)物，將所獲得的產(chǎn)物與4 mL 20 mM的三甲氧基巰丙基硅烷的乙醇溶液中，65°C回流4 h，將產(chǎn)物離心，二次水沖洗，然后向溶液中加入4 mL Au納米粒子的溶液，室溫下反應(yīng)3 h，將產(chǎn)物離心，用二次水沖洗，即可獲得Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料;最后將Zn2+特異性DNA模擬酶鏈連接在Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料表面:移取90 yL10 μΜ的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，加入到Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料溶液中，室溫下震蕩24 h，所獲得的產(chǎn)物用巰基己醇封鎖活性位點(diǎn)，最后將產(chǎn)物分散到0.5 mL 50 mM的三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液中。
[0008]步驟(4)中所述鏈I，其特征在于:其特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。
[0009]步驟(6)中所述DNA鏈4，其特征在于:其特定的堿基序列以及其5，端修飾上磷酸基團(tuán)。
[0010]本發(fā)明的有益效果
(I)采用比率型電化學(xué)方法對Zn2+進(jìn)行檢測，使得測定結(jié)果準(zhǔn)確度提高。
[0011](2)功能化紙芯片作為電化學(xué)檢測基底，具有活性位點(diǎn)多、易于批量生產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0012](3)整個比率型紙基電化學(xué)器件制備過程簡單，所需費(fèi)用低，有望實(shí)現(xiàn)Zn2+的低成本、便攜式檢測。
【附圖說明】
[0013]圖1:三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
圖2:疏水蠟打印圖案上絲網(wǎng)印刷上工作電極、參比電極和對電極，其中，右側(cè)為工作電極，左側(cè)為參比和對電極。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了更好地理解本發(fā)明，下面通過實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0015]實(shí)施例1
一種三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的的制備及其在Zn2+檢測中的應(yīng)用:
(1)在計(jì)算機(jī)上利用Al軟件設(shè)計(jì)比率型電化學(xué)紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
(2)將比率型電化學(xué)紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機(jī)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區(qū)域；
(3)采用絲網(wǎng)印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟
(2)中所得紙上，其中右側(cè)為工作區(qū)，上面印有工作電極，左側(cè)為參比區(qū)，上面印有參比電極和對電極；
(4)對(3)中親水區(qū)域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，固定在親水區(qū)域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點(diǎn)；
(5)將一定濃度的亞甲基藍(lán)修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和引物鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，43 °C下反應(yīng)3 h，然后加入到(4)所得電極表面；
(6)將一定濃度的環(huán)形模板探針，定義為鏈4，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應(yīng)2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環(huán)擴(kuò)增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應(yīng)I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面；
(7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得混合液中，混勻，室溫下反應(yīng)40min；
(8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學(xué)工作站，在-0.8?O V電位范圍內(nèi)，測定亞甲基藍(lán)和鄰苯二胺的電流強(qiáng)度；
(9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍(lán)電流強(qiáng)度比率的變化與Zn2+濃度關(guān)系曲線，完成Zn2+的測定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備方法，其特征是包括以下步驟: (1)在計(jì)算機(jī)上利用Al軟件設(shè)計(jì)比率型電化學(xué)紙芯片的疏水蠟批量打印圖案； (2)將比率型電化學(xué)紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機(jī)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區(qū)域； (3)采用絲網(wǎng)印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙上，其中右側(cè)為工作區(qū)，上面印有工作電極，左側(cè)為參比區(qū)，上面印有參比電極和對電極； (4)對(3)中親水區(qū)域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，固定在親水區(qū)域，實(shí)現(xiàn)信號的第一次放大，隨后用巰基己醇封鎖活性位點(diǎn)； (5)將一定濃度的亞甲基藍(lán)修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的引物鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，然后加入到(4)所得電極表面43 °C下反應(yīng)3 h; (6)將一定濃度的環(huán)形模板探針，定義為鏈4，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應(yīng)2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環(huán)擴(kuò)增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應(yīng)I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面，完成滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)二次信號放大； (7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得電極表面，混勻，室溫下反應(yīng)40min； (8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學(xué)工作站，在-0.8?O V電位范圍內(nèi)，測定亞甲基藍(lán)和鄰苯二胺的電流強(qiáng)度； (9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍(lán)電流強(qiáng)度比率的變化與Zn2+濃度關(guān)系曲線，完成Zn2+的測定； 步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙； 步驟(4)中所述親水區(qū)域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長石墨烯導(dǎo)電層，而后滴加殼聚糖溶液:向紙芯片表面三次重復(fù)滴加氧化石墨烯的溶液，室溫下干燥后，將滴加有氧化石墨烯的紙芯片轉(zhuǎn)移到含有0.1 M Na2SO4溶液中，0.9 V電位下，電還原氧化石墨烯，反應(yīng)完成后將紙芯片取出，二次水清洗表面，再次室溫下干燥即可獲得生長有石墨烯的紙芯片，而后在紙芯片表面滴加2.0 yL的0.5 mg mL—1的殼聚糖，室溫下干燥40 min。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備，其特征在于:權(quán)利要求1步驟(4)中所述修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈:首先制備鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料，即39.54 mg的5 ,10,15,20-0 (四羧基)_21H，23H-卟啉和40.55 mg氯化鐵，0.1 M的鹽酸加入到12 mL的體積比1:2混合的二甲基甲酰胺和乙醇的混合液中，超聲40 min，隨后將混合液150 °C反應(yīng)50 h，反應(yīng)停止后將產(chǎn)物用二甲基甲酰胺和乙醇清洗三次，而后將產(chǎn)物60 °(:真空干燥，即可獲得鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料;其次制備Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料:稱取6 mg的上述制備的鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料，將其溶解到I mL的乙醇中，然后將其分散到0.2 mL的氨水、13.8 !^乙醇、1.8 mL四甲氧基硅烷混合液中，室溫下攪拌2 h，將產(chǎn)物于12000 r/min離心10 min，用乙醇清洗產(chǎn)物，將所獲得的產(chǎn)物與4 mL 20 mM的三甲氧基巰丙基硅烷的乙醇溶液中，65 °C回流4 h，將產(chǎn)物離心，二次水沖洗，然后向溶液中加入4 mL Au納米粒子的溶液，室溫下反應(yīng)3 h，將產(chǎn)物離心，用二次水沖洗，即可獲得Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料;最后將Zn2+特異性DNA模擬酶鏈連接在Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料表面:移取90 yL 10 μΜ的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，加入到Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機(jī)框架材料溶液中，室溫下震蕩24 h，所獲得的產(chǎn)物用巰基己醇封鎖活性位點(diǎn)，最后將產(chǎn)物分散到0.5 mL 50 mM的三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備，其特征在于:權(quán)利要求1步驟(4)中所述鏈I其特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維紙基電化學(xué)比率計(jì)的制備，其特征在于:權(quán)利要求1步驟(6)中所述DNA鏈4其特定的堿基序列以及其5 ’端修飾上磷酸基團(tuán)。
【文檔編號】G01N27/48GK105954346SQ201610595195
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月27日
【發(fā)明人】李麗, 張彥, 黃煜真, 葛慎光, 顏梅, 劉海云, 于京華
【申請人】濟(jì)南大學(xué)