聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌 藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近30年來，我國癌癥發(fā)病率及死亡率一直呈持續(xù)增長的趨勢。皮膚鱗狀細(xì)胞癌是 發(fā)病率較高的皮膚惡性腫瘤，其在皮膚惡性腫瘤中占有較大比例，一般為80%至90%，其發(fā) 病率有逐年增高趨勢，在老年人中尤其明顯。該類癌癥因其惡性程度高，西醫(yī)治療目前無有 效且經(jīng)濟(jì)的手段。
[0003] 信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator oftranscription3，STAT3)是多種致癌性信號通路的關(guān)鍵分子，其下游調(diào)控著許多與腫瘤 細(xì)胞生長、調(diào)亡、血管生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)的關(guān)鍵分子，如切ClinDl ,Survivin,Bcl-2等。STAT3 參與細(xì)胞生長、分化、分裂及發(fā)育等多種生理過程，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。STAT3 是轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)子與激活子家族(STAT)的重要成員。STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子在沒有特異性的 刺激時(shí)定位于胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，STAT3上的SH2結(jié)構(gòu)域與受體上被憐酸化的酪氨 酸的殘基結(jié)合，同時(shí)自身被JAK憐酸化。STAT3是EGFR，IL-6/JAK等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信 號通道的匯聚焦點(diǎn)，STAT3激活后誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、分化、生存、調(diào)亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的 異常表達(dá)，通過各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，惡性轉(zhuǎn)化，阻礙細(xì)胞調(diào)亡表達(dá)出致癌作用，目前被 定義為一種癌基因。
[0004] 其中，姜黃素作為一種中藥在抗癌應(yīng)用中被廣泛應(yīng)用。姜黃素是一種天然植物多 酪類色素，從姜科植物姜黃中提取，也存在其它姜科植物中。姜黃素廣泛存在于我國傳統(tǒng)中 藥姜黃的根莖中。近年來研究表明，姜黃素在抗腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗類風(fēng)濕等方 面具有很好的藥理作用。姜黃素在動物模型上對皮膚癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯地抑制作用，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，但是姜黃素水 溶性差，生物利用度低等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了臨床的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中姜黃素不能在臨床上廣泛應(yīng)用的缺陷，本發(fā)明提供了聯(lián)氨基 姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了一種聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
[0007] 其中，質(zhì)量濃度大于15WH01/L的聯(lián)氨基姜黃素能明顯抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431 細(xì)胞的生長。
[000引其中，聯(lián)氨基姜黃素通過抑制STAT3信號通路及STAT3基因表達(dá)來降低人皮膚鱗狀 細(xì)胞癌A431細(xì)胞的侵襲性。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首次提出了聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥 物中的應(yīng)用。聯(lián)氨基姜黃素通過抑制STAT3信號通路的活化及該信號通路祀基因STAT3的表 達(dá)來降低皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的侵襲性。聯(lián)氨基姜黃素易溶于水，生物利用度高，能替 代姜黃素在臨床上廣泛地應(yīng)用。
【附圖說明】
[0010]圖1是聯(lián)氨基姜黃素對A431細(xì)胞體外侵襲能力的影響，A:陰性對照組;B: 5皿01/L 聯(lián)氨基姜黃素處理組;CaOwnol/L聯(lián)氨基姜黃素處理組;D:15wiiol/L聯(lián)氨基姜黃素處理組；
[0011] 圖2是Western blot檢測聯(lián)氨基姜黃素處理后A431細(xì)胞中STAT3和P-STAT3蛋白的 相對表達(dá)量；
[0012] 圖3是Western blot檢測姜黃素處理后A431細(xì)胞中STAT3和P-STAT3蛋白的相對表 達(dá)量；
[OOK]圖4是聯(lián)氨基姜黃素對A431細(xì)胞中STAT3和P-STAT3蛋白表達(dá)的影響；
[0014] 圖5是聯(lián)氨基姜黃素對A431細(xì)胞中STAT3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地解釋說明。
[0016] 本發(fā)明中用到的主要儀器及試劑：
[0017] 人皮膚鱗癌細(xì)胞A431由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供；STAT3鼠單克隆抗 體及P-STAT3鼠單克隆抗體由美國Cell Si即aling Technologies公司提供;聯(lián)氨基姜黃素 購自中國藥品生物制品檢定所;MTT購自美國Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公 司；Transwe 11小室購自Mi Iliproe公司；PCR引物及BSA稀釋液由上海生工合成， ReverTraAce-Q-RT-PCR kit購自TOYOBO公司，蛋白干粉購自中國博±德公司。
[0018] 細(xì)胞培養(yǎng)方法:A431細(xì)胞在含10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中 (37°C、5%C〇2)，當(dāng)細(xì)胞生長至80 %融合時(shí)，用0.化％膜酶傳代。
[0019]實(shí)施例1
[0020] MTT法檢測聯(lián)氨基姜黃素對細(xì)胞的殺傷力：
[0021 ]取對數(shù)生長期細(xì)胞，按4 X IO3個(gè)/孔接種于96孔板中，邊緣孔加入無菌PBS，培養(yǎng) 2地后，分別加入濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、50皿〇1/1聯(lián)氨基姜黃素，同時(shí)設(shè)陰性對 照組(0.1 %二甲基亞諷DMSO)和空白對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，0.1 % DMSO可抑制人皮膚鱗狀 細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)24、48、7化后，10(K)r/min離屯、，棄去培養(yǎng)液，每孔加入18化1無 血清RPMI1640培養(yǎng)基及20山MlT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)地，lOOOr/min離屯、，棄去上清，每 孔加入10化1 DMSO，搖床振蕩IOmin。酶標(biāo)儀49化m波長處測定光密度A值，并按W下公式計(jì) 算細(xì)胞生存率（％ )。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0022] 細(xì)胞生存率（％ )=(實(shí)驗(yàn)組A490-空白對照組A490)/實(shí)驗(yàn)對照組A490 X 100%。
[0023] SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，W均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于各實(shí)驗(yàn) 組組間均數(shù)分析，單因素方差分析多組數(shù)據(jù)，P<〇.05為在統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。
[0024] 結(jié)果如表1所示，聯(lián)氨基姜黃素濃度15皿ol/L，作用時(shí)間24h為臨界點(diǎn)，聯(lián)氨基姜黃 素濃度>15皿ol/L，作用時(shí)間>2地細(xì)胞的生長抑制呈時(shí)間和劑量依懶性，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 有意義(P<〇.〇〇l);聯(lián)氨基姜黃素濃度< 15皿ol/L，作用時(shí)間<24h時(shí)，聯(lián)氨基姜黃素對細(xì) 胞毒性作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞存活率>85%。所W W聯(lián)氨基姜黃素濃度^ 15WH01/L，作用 時(shí)間為^ 24h時(shí)為侵襲和粘附試驗(yàn)的條件。
[0025]表1不同濃度的聯(lián)氨基姜黃素對A431細(xì)胞的抑制率
[0027] 注：*VS 5、10、15 皿 〇1/L，P<0.05; AVS 5、10 皿 ol/L，P<0.0;〇VS 5、10、20、25y mol/L，P<0.05;#VS 5、15、20、25皿〇1/1，？<0.05;國￥5 2地，？<0.05;參￥5 4化，？<0.05
[0028] 實(shí)