一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物殘留物的快速檢測(cè)設(shè)備的設(shè)計(jì)及制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備，由底物反應(yīng)區(qū)和底物基底區(qū)組成，底物反應(yīng)區(qū)置于底物基底區(qū)表面，由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲及通過浸潤(rùn)方式包埋于其內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層制成；底物基底區(qū)是疏水性的有機(jī)材質(zhì)。制備方法：（1）取市售疏水性的材質(zhì)無菌處理后，裁剪成底物基底區(qū)；（2）無菌條件下，將親水性的whatman濾紙置于底物基底區(qū)上，即形成底物反應(yīng)區(qū)；然后，將制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液滴加在whatman濾紙上，25?40℃條件下，浸潤(rùn)0.5?2h；無菌條件下晾干，即制成“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備。使用本檢測(cè)設(shè)備能對(duì)動(dòng)物源性食品病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確快速粗定量檢測(cè)。
【專利說明】
一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物殘留物的快速檢測(cè)設(shè)備的設(shè)計(jì)及制備和使用方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食源致病微生物污染是困擾食品安全的主要問題之一，而其快速準(zhǔn)確檢測(cè)與監(jiān)測(cè)是保障食品安全的第一道防線。目前常用的檢測(cè)技術(shù)主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、液相色譜技術(shù)和新近發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)具有特異準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，但程序復(fù)雜、耗時(shí)耗力，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無法滿足快速檢測(cè)需要，基于免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來的檢測(cè)技術(shù)具有良好的特異性和靈敏性，準(zhǔn)確快速，但對(duì)昂貴儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的依賴程度較高，無法滿足食品生產(chǎn)一線的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)需要。
[0003]紙基微流控檢測(cè)裝置(microf luidic paper based analytical devices，μPADs)是近幾年發(fā)展起來的一種制備簡(jiǎn)便、成本低廉、幾無污染的快速檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是:通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)圖形，噴蠟打印濾紙，制備疏水隔離區(qū)，在隔離區(qū)內(nèi)包被反應(yīng)物，通過紙上反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢物的快速檢測(cè)，該方法與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、液相色譜技術(shù)和的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有很好的互補(bǔ)性，彌補(bǔ)了前述幾種方法的不足和局限性，非常適合食品生產(chǎn)一線的快速檢測(cè)需要。
[0004]然而，由于噴蠟打印技術(shù)近幾年退出了市場(chǎng)，噴蠟打印機(jī)已市場(chǎng)難覓，導(dǎo)致紙基微流控檢測(cè)技術(shù)陷入困境，而其替代方法如光刻膠技術(shù)、十八烷基三甲氧基硅烷(TMOS)蝕刻技術(shù)等又都存在檢測(cè)紙片制備復(fù)雜、穩(wěn)定性較差、不易保存的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于:設(shè)計(jì)一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備，使用這種設(shè)備，能對(duì)動(dòng)物源性食品病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確快速定性檢測(cè);更進(jìn)一步的利用已知酶底物反應(yīng)原理中的數(shù)學(xué)模型，在預(yù)設(shè)檢測(cè)設(shè)備中底物一定量的基礎(chǔ)上，通過已知的數(shù)學(xué)模型關(guān)系式，間接的計(jì)算出待測(cè)微生物的基本定量，能較好的滿足食品生產(chǎn)一線的質(zhì)控、抽檢、初篩等便捷檢測(cè)要求。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案:一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備，該檢測(cè)設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)和底物基底區(qū)，所述底物反應(yīng)區(qū)垂直置于底物基底區(qū)表面;所述底物反應(yīng)區(qū)由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲及通過浸潤(rùn)方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層制成;所述底物基底區(qū)是由疏水性的有機(jī)材質(zhì)制成。
[0007]所述的底物反應(yīng)區(qū)為圓形或矩形或不規(guī)則形狀，或依據(jù)檢測(cè)目要求的任意形狀。所述的底物反應(yīng)區(qū)高于底物基底區(qū)l_5mm。所述的底物反應(yīng)區(qū)為含有反應(yīng)底物及呈色劑層的whatman濾紙。所述的底物基底區(qū)為具備疏水性的單面或雙面膠。所述的反應(yīng)底物及呈色劑層為能在待測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。
[0008]—種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備的制備方法，該制備方法包括下述步驟:(I)取市售疏水性的單面或雙面膠帶無菌處理后，裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū)，備用；(2)在無菌條件下，將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀，并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上，即形成底物反應(yīng)區(qū)；然后，將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上，通過浸潤(rùn)方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細(xì)小的木質(zhì)纖維絲中，25-40 °C條件下，浸潤(rùn)0.5_2h ；無菌條件下瞭干，即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備。
[0009]有益效果:使用本檢測(cè)設(shè)備能對(duì)動(dòng)物源性食品病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確快速粗定量檢測(cè);利用已知酶底物反應(yīng)原理中的數(shù)學(xué)模型，在預(yù)設(shè)檢測(cè)設(shè)備中底物一定量的基礎(chǔ)上，間接的計(jì)算出待測(cè)微生物的基礎(chǔ)數(shù)量，實(shí)現(xiàn)快速，基本定量的檢測(cè)要求。同時(shí)，本發(fā)明克服了噴蠟打印技術(shù)退市后采用光刻和化學(xué)蝕刻等替代技術(shù)制備紙基微流控檢測(cè)設(shè)備的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，保持了紙基微流控檢測(cè)設(shè)備制備方法簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，并且材料簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、幾無污染。
【附圖說明】
[0010]附圖1為實(shí)施例1主視結(jié)構(gòu)示意圖；附圖2為A-A剖視圖；附圖3為實(shí)施例2的主視結(jié)構(gòu)示意圖；附圖4為實(shí)施例3的主視結(jié)構(gòu)示意圖；附圖5為實(shí)施例4的主視結(jié)構(gòu)示意圖；附圖6為L(zhǎng)M菌液濃度與灰度值的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1、一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備，如圖1-2所示，該檢測(cè)設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)I和底物基底區(qū)2，所述底物反應(yīng)區(qū)I垂直置于底物基底區(qū)2表面;所述底物反應(yīng)區(qū)I由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲4及通過浸潤(rùn)方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲4內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層5制成;所述底物基底區(qū)2是由疏水性的有機(jī)材質(zhì)3制成。
[0012]所述的底物反應(yīng)區(qū)I高于底物基底區(qū)21-5mm。所述的底物反應(yīng)區(qū)I為含有反應(yīng)底物及呈色劑層5的whatman濾紙。所述的底物基底區(qū)2為具備疏水性的單面或雙面膠。所述的反應(yīng)底物及呈色劑層5為能在待測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。
[0013]實(shí)施例2、3及4，如圖2-5所示，所述的底物反應(yīng)區(qū)I為圓形或矩形或不規(guī)則形狀，或依據(jù)檢測(cè)目要求的任意形狀。
[0014]實(shí)施例5、一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備的制備方法，該制備方法包括下述步驟:(I)取市售疏水性的單面或雙面膠帶無菌處理后，裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū)，備用；(2)在無菌條件下，將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀，并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上，即形成底物反應(yīng)區(qū);然后，將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上，通過浸潤(rùn)方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細(xì)小的木質(zhì)纖維絲中，25-40°C條件下，浸潤(rùn)0.5_2h ；無菌條件下晾干，即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備。
[0015]具體實(shí)踐:無菌條件下，將whatman濾紙裁制成圓形或矩形或依據(jù)檢測(cè)目要求的任意形狀的親水反應(yīng)區(qū)，將市售單面或雙面透明膠帶制備成大于親水反應(yīng)區(qū)直徑2倍以上的條狀作為疏水基底區(qū)；將制備好的親水反應(yīng)區(qū)whatman濾紙片粘貼其上即可。將待檢微生物產(chǎn)生的特異性酶的底物和顯色劑包埋于親水反應(yīng)區(qū)內(nèi)，例如:X-1nP(5-溴-4-氯-3-吲羥肌醇磷酸銨)等，在25-40°C條件下，浸潤(rùn)0.5-2h;烘干放入無菌自封袋包裝，用做食源微生物快速檢測(cè)之用。
[0016]其中，最佳親水反應(yīng)區(qū)直徑、疏水效果篩選。(I)參照文獻(xiàn)資料設(shè)定6、7、8、9和10_直徑的親水區(qū)，滴加顏色水溶液(藍(lán)色墨水)測(cè)試，經(jīng)灰度值轉(zhuǎn)換計(jì)算，獲得最佳顯色反應(yīng)區(qū)直徑為6-8 _。(2)采用7mm直徑親水反應(yīng)區(qū)，滴加市售墨水原液，滴加量分別為1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60微升共13個(gè)梯度，測(cè)定其最佳疏水效果，經(jīng)比對(duì)分析，I和5微升親水反應(yīng)區(qū)充盈不完全，10和15微升雖充盈完全，但尚未形成明顯的表面張力，不足以反映疏水區(qū)的隔離作用，20微升側(cè)面觀已開始形成略凸于親水區(qū)表面的張力層，25微升以后表面張力層升高，到60微升仍然可以表現(xiàn)出完整的疏水效果，底層疏水基質(zhì)層無滲漏，以最佳經(jīng)濟(jì)實(shí)用角度考慮，篩選20-25微升作為最佳疏水劑量。
[0017]實(shí)施例6、菌液濃度與灰度值量效關(guān)系確定:
(I)細(xì)菌復(fù)蘇:將用甘油保存于_20°C的單核增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 21633的菌液復(fù)蘇，之后進(jìn)行平板劃線，分離純化。(2)菌液富集:挑取純化后平皿中長(zhǎng)勢(shì)良好的單增李斯特菌菌落，進(jìn)行Sh的菌液富集。(3)將富集好的菌液分別進(jìn)行2、4、8、10、20倍的稀釋，混勻后分別滴加到試紙片上，1.5h后，終止反應(yīng)，觀察顯色結(jié)果并進(jìn)行掃描。(4)活菌計(jì)數(shù)
將富集8 h的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，得到所顯顏色對(duì)應(yīng)的菌液濃度。(5 )灰度轉(zhuǎn)換:用Imagejl.4u軟件對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行灰度讀數(shù)，得到顏色反應(yīng)的灰度值。(6)建立回歸方程:所得的菌液濃度和灰度值關(guān)系采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并建立回歸方程為:y=-0.03850 x + 9.615，r2=0.9357;如附圖6所示。
[0018]結(jié)論:通過實(shí)施例6的實(shí)踐能很好的證明，通過本發(fā)明浮雕式檢測(cè)試紙(設(shè)備)，可以得出待測(cè)細(xì)菌的半定量的分析結(jié)果。可滿足食品生產(chǎn)一線的質(zhì)控、抽檢、初篩等便捷檢測(cè)要求。
[0019]本發(fā)明技術(shù)原理:自主研發(fā)一種專用打孔機(jī)制備不同直徑不同形狀的濾紙片作為親水反應(yīng)區(qū)(底物反應(yīng)區(qū))，以市售普通單面或雙面膠帶作為疏水隔離基層載體(底物基底區(qū))，將親水反應(yīng)區(qū)濾紙片粘貼在疏水隔離基層上，形成“浮雕”樣親水檢測(cè)區(qū)(底物反應(yīng)區(qū))。
[0020]本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn):首創(chuàng)了將親水反應(yīng)區(qū)(底物反應(yīng)區(qū))突出在疏水隔離區(qū)基層(底物基底區(qū))之上，依靠親水反應(yīng)區(qū)濾紙的表面張力和周圍疏水阻隔作用制備紙基微流控檢測(cè)設(shè)備方法，該方法可將檢測(cè)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)限制一致特定區(qū)域內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)的可定量性，且制作材料可獲得性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)便、成本低廉，制作的檢測(cè)試紙可彌補(bǔ)當(dāng)前快速便捷檢測(cè)技術(shù)的匱乏，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:該檢測(cè)設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)(I)和底物基底區(qū)(2)，所述底物反應(yīng)區(qū)(I)垂直置于底物基底區(qū)(2)表面;所述底物反應(yīng)區(qū)(I)由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲(4)及通過浸潤(rùn)方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲(4)內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層(5 )制成;所述底物基底區(qū)(2 )是由疏水性的有機(jī)材質(zhì)(3 )制成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)為圓形或矩形或不規(guī)則形狀。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)高于底物基底區(qū)(2)l_5mm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)為含有反應(yīng)底物及呈色劑層(5)的whatman濾紙。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:所述的底物基底區(qū)(2)為具備疏水性的單面或雙面膠。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于:所述的反應(yīng)底物及呈色劑層(5)為能在待測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。7.一種“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備的制備方法，其特征在于:該制備方法包括下述步驟:(I)取市售普通雙面膠帶無菌處理后，裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū)，備用；(2)在無菌條件下，將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀，并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上，即形成底物反應(yīng)區(qū)；然后，將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上，通過浸潤(rùn)方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細(xì)小的木質(zhì)纖維絲中，25-40 °C條件下，浸潤(rùn)0.5_2h ；無菌條件下瞭干，即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測(cè)設(shè)備。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK105954273SQ201610288961
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】姚剛, 鄭曉風(fēng), 張琦, 王金泉, 趙紅瓊, 蘇戰(zhàn)強(qiáng), 鐘旗, 李宏波, 閆向民
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)