一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒及其制備方法，包括的成分及相應(yīng)含量為：試劑R1：緩沖液20~180 mmol/L、吐溫?20 0.1~1.0 g/L，其溶劑為純化水，試劑R2：緩沖液20~180 mmol/L、L?亮氨酰?P?硝基苯胺0.1~15.0 mmol/L、復(fù)合酶穩(wěn)定劑0.1~1.0mL/L，其溶劑為純化水，制備方法和使用方法包括以下步驟：按照組分含量配制好試劑；將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的亮氨酰氨基肽酶的濃度。本發(fā)明具有穩(wěn)定性好、測(cè)定準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
-種測(cè)定亮氨醜氨基化酶的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 亮氨酷氨基膚酶(LAP)是一種蛋白分解酶，能水解膚鏈N端并由亮氨酸與其它氨基 酸形成膚鍵的酶，其廣泛分布于肝、膜、腎等組織中，其中肝內(nèi)含量最高，當(dāng)肝內(nèi)外膽渺時(shí)， 亮氨酷氨基膚酶活力顯著增高，尤其在惡性膽渺時(shí)，其活力隨病情進(jìn)展而持續(xù)增高，除了肝 臟病變外，亮氨酷氨基膚酶在膽囊、膜腺等組織病變時(shí)，亦可出現(xiàn)血清亮氨酷氨基膚酶的升 高，亮氨酷氨基膚酶不像其它肝功的酶，只能檢測(cè)血液樣本，亮氨酷氨基膚酶還可W檢測(cè)尿 液，在一些病例中，可W檢測(cè)尿液中亮氨酷氨基膚酶的變化，而不必采血。
[0003] 亮氨酷氨基膚酶亦可W反應(yīng)早期的腎功能的損害和程度，并為臨床鑒別腎小球、 腎小管損傷提供可能的幫助。
[0004] 目前，市場上的對(duì)亮氨酷氨基膚酶的檢測(cè)試劑盒不僅操作復(fù)雜，而且測(cè)定的準(zhǔn)確 度、精密度均比較差，需要進(jìn)行改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的技術(shù)操作復(fù)雜、準(zhǔn)確度和精密度均 比較差的缺陷，而提供一種測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測(cè)定亮氨酷氨基 膚酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 試劑 R2: 緩沖液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.1~1.0血/L 其溶劑為純化水。
[000引作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試 劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: 緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: 緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液采用憐酸鹽緩沖液、=徑甲基氨基甲燒 緩沖液、1,4-贓嗦二乙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦丙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖 液、=徑甲基甲胺基丙橫酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、棚酸緩沖液、3-嗎嘟丙橫酸緩沖液、3-(N-嗎嘟基)-2-徑丙基橫酸緩沖液、2-嗎嘟乙橫酸緩沖液、憐酸二氨鋼緩沖液中的一種或多 種的組合，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用憐酸鹽緩沖液、=徑甲基氨基甲燒緩沖液、 1,4-贓嗦二乙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦丙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液、S徑 甲基甲胺基丙橫酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、棚酸緩沖液、3-嗎嘟丙橫酸緩沖液、3-(N-嗎嘟 基)-2-徑丙基橫酸緩沖液、2-嗎嘟乙橫酸緩沖液、憐酸二氨鋼緩沖液中的一種或多種的組 厶 1=1 O
[0011] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的復(fù)合酶穩(wěn)定劑采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山 梨醇、牛血清白蛋白中的一種或多種的組合。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括W下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[OOU]試劑 R2: 緩沖液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.1~1.0血/L 其溶劑為純化水。
[0014] (b)將待測(cè)樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (C)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的亮氨酷氨基膚酶的濃度。
[0015] 本發(fā)明的檢測(cè)原理是:樣品中的亮氨酷氨基膚酶催化水解底物k亮氨酷-P-硝基 苯胺，生成亮氨酸和對(duì)硝基苯胺，用405nm波長檢測(cè)吸光度的變化率，求出樣品中亮氨酷氨 基膚酶的活性。 「mi Al T干斗、下 OXH白 I主 VU/Ly- LS 八 V U/Ly
式中：A Au/min 待測(cè)樣品平均每分鐘的吸光度變化值 A Ae/min 校準(zhǔn)液平均每分鐘的吸光度變化值 Cs 校準(zhǔn)液中亮氨酷氨基膚酶的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明所述的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試 劑盒通過添加復(fù)合酶穩(wěn)定劑，復(fù)合酶穩(wěn)定劑可W有效的提高k亮氨酷-P-硝基苯胺的穩(wěn)定 性，運(yùn)樣在測(cè)試的過程中，整個(gè)反應(yīng)也就更趨于穩(wěn)定，因此本發(fā)明所述的測(cè)定亮氨酷氨基膚 酶的試劑盒的穩(wěn)定性好、測(cè)定準(zhǔn)確度高，另外本發(fā)明制備方法簡單、成本低，另外操作也比 較方便。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于運(yùn)些實(shí)施例。
[001引實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: S徑甲基氨基甲燒緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0019] 試劑R2: 2-嗎嘟乙橫酸緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0020] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 甘氨酸緩沖液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[00別]試劑R2: 4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶劑為純化水。
[0022]實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: S徑甲基氨基甲燒緩沖液100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[002；3]試劑 R2: 2-嗎嘟乙橫酸緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0024] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長:主波長405皿、副波長505皿； (C)反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，解育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度Al, 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)。
[00巧]3、檢測(cè)步驟 (a) 取2(K)山試劑Rl與12.5山待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入50iil試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1； 'J、訪舊
巧奪T 的巧化W/ U= LS A I U/ L八T異卞奪T的巧勃?腳:安L萃趴曬:的W議。
[00%] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 甘氨酸緩沖液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0027]試劑 R2: 4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶劑為純化水。
[0028] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長:主波長405皿、副波長505皿； (C)反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，解育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度Al, 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)。
[0029] 3、檢測(cè)步驟 (a) 取2(K)山試劑Rl與12.5山待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入50iil試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1； (d)巧據(jù)
巧傘中LAF的巧巧W/U= Us X LU/U訂昇出巧傘中的兌到斷到巷職暇的m設(shè)。
[0030] 表1為實(shí)施例1所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒W及實(shí)施例2所制得的測(cè)定 亮氨酷氨基膚酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品1進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的亮氨酷氨基膚 酶的濃度為14U/L，測(cè)定結(jié)果見表1: 泰1
由表1可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對(duì)質(zhì)控品1的測(cè)定結(jié)果偏差 較小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0031] 表2為實(shí)施例1所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒W及實(shí)施例2所制得的測(cè)定亮氨 酷氨基膚酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品2進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的亮氨酷氨基膚酶的 濃度為21U/L，測(cè)定結(jié)果見表2: 表2
出巧ZKi畑，奪乂明所明巧的觀U疋巧安L腳:安L萃趴贈(zèng)的W化I品:刈胸巧而ZtfJ觀U疋巧宋1炯左 較小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0032] 表3為實(shí)施例3所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測(cè)定W及實(shí)施例4所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測(cè)定，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測(cè)定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒的精密度比較好，而且由表1 可知，實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0033]上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人±皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所掲示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1-1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.1~1. OmL/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú) 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.5mL/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸 緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸 緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩 沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多種的組合，所述的試劑R2中， 所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘 氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎 啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多種的組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的復(fù)合酶穩(wěn)定劑采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白中的一 種或多種的組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1-1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 復(fù)合酶穩(wěn)定劑 0.1~1. OmL/L 其溶劑為純化水 (b) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的亮氨酰氨基肽酶的濃度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/37GK105838775SQ201610279879
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司