氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中氯福克酚是一種治療上呼吸道感染藥物，其相對(duì)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞，人神經(jīng)干細(xì)胞，可顯著特異性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性，且經(jīng)氯?？朔犹幚砗竽z質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、腫瘤球形成、裸鼠體內(nèi)成瘤能力也明顯降低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，利用斑馬魚膠質(zhì)瘤移植瘤模型、裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤模型，在體驗(yàn)證該藥物對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果。具體而言，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用于治療上呼吸道感染藥物——氯福克酚可通過靶向性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞達(dá)到用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物目的。本發(fā)明為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了新的治療藥物。
【專利說明】
氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，具體涉及氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的來源于神經(jīng)上皮的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，其惡性程度高、 生長(zhǎng)迅速、浸潤性強(qiáng)，具有高發(fā)病率的特點(diǎn)。雖然目前腫瘤綜合治療技術(shù)已取得長(zhǎng)足進(jìn)步， 但因其位于腦部重要位置，且伴隨微血管增生，呈現(xiàn)明顯的浸潤性生長(zhǎng)等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的手 術(shù)、放療都無法徹底根治，而導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率高、病死率高和治愈率低。目前臨床上化療的藥 物以烷基化藥物為主，但傳統(tǒng)烷化劑副作用大，易產(chǎn)生耐藥性；新型烷化劑替莫唑胺 (temozo I omi de，TMZ)雖毒副作用小，且長(zhǎng)時(shí)間用藥耐受性好，但TMZ治療后引起的骨髓增生 異常綜合征（my elodysplastic syndrome，MDS)、急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML)以及急性成淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的報(bào) 道與日倶增，具體原因也在進(jìn)一步研究中。因此，尋找新一代治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效藥物， 改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療迫在眉睫。
[0003] 近年來，科學(xué)家們結(jié)合膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的機(jī)理，在其新藥探索與開發(fā)方面做出 了諸多努力。研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展主要與RTK/RAS/PI3K通路，p53通路，RB通路 中的相應(yīng)關(guān)鍵分子的異常表達(dá)或突變相關(guān)。因而近年來的研究都在開發(fā)相應(yīng)的藥物分子的 抑制劑用以抵消某種關(guān)鍵分子的作用效果，但都只是在臨床前研究結(jié)果中表現(xiàn)出強(qiáng)的治療 前景，在I、Π 期臨床結(jié)果，或是批準(zhǔn)上市后表現(xiàn)得不盡人意或療效頗微。如EGFR的抑制劑： 吉非替尼和埃羅替尼被證實(shí)患者服用后極易產(chǎn)生耐藥，而且有療效的患者非常罕見，并且 病人服用之后無進(jìn)展生存期皆未有所延長(zhǎng)。同時(shí)EGFR/Her2抑制劑拉帕替尼，EGFR的單克隆 抗體西妥昔單抗都被證實(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果頗微;除此以外還有mTOR相關(guān)抑制劑:雷帕 霉素、替西羅莫司、依維莫司、地磷莫司，脫乙酰酶(Histone deactyIase，HDAC)抑制劑:伏 立諾他等單獨(dú)治療或與替莫唑胺聯(lián)合治療都被證實(shí)沒有或只有極小的作用效果。與此同 時(shí)，研究還針對(duì)膠質(zhì)瘤微血管形成豐富的特點(diǎn)，開發(fā)了被證實(shí)有部分效果的抗血管生成的 分子如貝伐單抗、西地尼布，它們可以快速的減少癌旁水腫，有效的延長(zhǎng)了患者的無進(jìn)展生 存期，但是也無法逆轉(zhuǎn)病程的進(jìn)展。接受抗血管療法的患者最終也無法成功治愈，還是無法 改變大多數(shù)患者在診斷后數(shù)月死亡的現(xiàn)狀?？傮w而言，盡管國內(nèi)外科學(xué)家，藥物公司在膠質(zhì) 瘤的新藥探索中付出諸多人力物力，目前都沒有找到一種新的，有效的藥物分子。由于膠質(zhì) 瘤復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前我們尚不知道在不同發(fā)病機(jī)理導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤患者中哪個(gè)關(guān)鍵分子 需要被抑制。此外，另一些科學(xué)家提出，膠質(zhì)瘤組織內(nèi)細(xì)胞存在異質(zhì)性，以上探索的藥物分 子之所以結(jié)果頗微，可能與我們沒有針對(duì)對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用的細(xì)胞類型 有關(guān)。
[0004] 1994年，Lapidot等從白血病患者身上首次分離獲得腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞理論 逐漸被接受。隨后Singh等在膠質(zhì)瘤中分離得到極少數(shù)具有自我更新及分化能力的CD133+ 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，且其相對(duì)于CD133_的細(xì)胞具有更強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力，僅100個(gè)細(xì)胞就可在裸 鼠內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤。Jian Chen等通過細(xì)胞體內(nèi)示蹤技術(shù)，從在體的水平，證明了膠質(zhì)瘤干 細(xì)胞的存在。隨著研究的深入，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)性質(zhì)，以及與膠質(zhì)瘤的關(guān)系逐漸被揭 示。研究表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因，且膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可通過激活Wnt 信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤血管形成，增強(qiáng)腫瘤的低氧應(yīng)激以及侵襲能力等。不僅如此，Bao等證實(shí) 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞也能產(chǎn)生放化療抗性。然而，目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化療藥物只針對(duì)整個(gè)腫瘤組 織，病人在接受一段時(shí)間的治療后，腫瘤組織縮小取得一定的效果，但是對(duì)化療產(chǎn)生抵抗的 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可通過增殖和分化進(jìn)一步形成新的腫瘤組織，從而促使腫瘤復(fù)發(fā)。由此可見， 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，及放化療抗性的形成，腫瘤的復(fù)發(fā)息息相關(guān)，是膠質(zhì)瘤 難以攻克的一個(gè)重要因素。因此，我們?cè)O(shè)想，是否可以通過獲得靶向性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥 物，并結(jié)合傳統(tǒng)的放化療，達(dá)到最終徹底消滅整個(gè)腫瘤組織的目的。
[0005] 近幾年，國內(nèi)外科學(xué)家分別在不同腫瘤中報(bào)道了幾種能靶向腫瘤干細(xì)胞的藥物， 其中包括一些新的藥物分子和已在臨床上使用的藥物分子。如天然的多酚白藜蘆醇，具有 抗菌活性的離子載體鹽霉素，衣霉素，滅絳蟲活性的藥物氯硝柳胺，以及用以治療糖尿病的 藥物二甲雙胍及用以治療肝癌的藥物索拉非尼，都利用裸鼠成瘤模型，驗(yàn)證了藥物相對(duì)于 目前的一線藥物TMZ更具抑瘤效果。但是以上藥物都無法在保證安全性的前提下，發(fā)揮靶向 腫瘤干細(xì)胞的功能，因而效果有限。
[0006] 氯?？朔邮且环N抗菌藥物，主要用于治療有革蘭氏陽性菌引起的上呼吸道，耳， 鼻，喉的感染。目前，主要用于法國和意大利，其首先法國在1980年期間批準(zhǔn)上市。該要對(duì)革 蘭氏陽性菌的抑制可能是通過抑制胞壁質(zhì)的合成、影響能量代謝實(shí)現(xiàn)的，但它不影響DNA、 RNA及蛋白的合成。而革蘭氏陰性菌對(duì)氯福克酚的抵抗可能是由于其不能通過革蘭氏陰性 菌外膜的原因。其給藥方式為口服及直腸栓劑（1.5g/人，每日，主要給藥方式)置肛給藥的 方式。臨床觀察結(jié)果顯示，該藥物的副作用不大，但在該藥物使用過程中，部分患者會(huì)出現(xiàn) 斑狀丘疹或直腸擴(kuò)張等副作用。目前對(duì)于氯?？朔拥膱?bào)道，主要集中于其對(duì)革蘭氏陽性菌 的抑制，及在上呼吸道感染后的治療。而在2014年有一篇文獻(xiàn)由蘇州大學(xué)和約翰霍普金斯 醫(yī)學(xué)院合作的文章報(bào)道了氯?？朔涌梢酝ㄟ^誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制細(xì)胞蛋白翻譯及細(xì) 胞周期阻滯等發(fā)揮對(duì)前列腺癌的抑制作用，如此揭示了氯?？朔拥囊至鲎饔?。
[0007] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)相對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株、人胚腎細(xì)胞，人神經(jīng)干 細(xì)胞，氯福克酚在細(xì)胞水平對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的四株膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株具有特異性抑制效 果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明從細(xì)胞水平驗(yàn)證了氯福克酚可特異性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更 新能力，腫瘤球形成能力;并通過斑馬魚、裸鼠膠質(zhì)瘤移植模型驗(yàn)證了氯?？朔訉?duì)膠質(zhì)瘤的 治療效果。由此，氯?？朔訉⒑苡锌赡艹蔀樯窠?jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的有力治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于上述目的，本發(fā)明提供了一種氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的 用途。
[0009] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性以治療所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、腫瘤球 形成，及體內(nèi)腫瘤形成的能力以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0011] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物通過誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡以治療所述人神 經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0012] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述膠質(zhì)瘤干細(xì)胞包括但不限于：U87MG SLC、 U251SLC、GSC2、GSC5。
[0013] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述藥物還通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞以治療所述人神經(jīng)膠 質(zhì)瘤。
[0014] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述膠質(zhì)瘤細(xì)胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。
[0015] 在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤處于I到IV級(jí)。
[0016] 術(shù)語的定義
[0017] "膠質(zhì)瘤干細(xì)胞"：存在于膠質(zhì)瘤組織內(nèi)存在的一類極少數(shù)的具有自我更新能力， 多項(xiàng)分化能力，體內(nèi)成瘤能力的細(xì)胞，它與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，復(fù)發(fā)以及膠質(zhì)瘤對(duì)放療化療 抗性形成密切相關(guān)。
[0018] "MTS方法"：一種用比色法來檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè) 試劑。MTS是一種新型四唑化合物，PMS是一種電子偶聯(lián)劑。PMS具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，這使 它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。MTS被細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶 解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作 用下完成的。在490nm處檢測(cè)到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。
[0019] "相對(duì)細(xì)胞存活率"：運(yùn)用據(jù)上MTS方法檢測(cè)吸光度值后，根據(jù)吸光值A(chǔ)計(jì)算相對(duì)細(xì) 胞存活率，相對(duì)細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A) X 100%。
[0020] "自我更新"：指干細(xì)胞(此處特指膠質(zhì)瘤干細(xì)胞)通過對(duì)稱或者不對(duì)稱分裂產(chǎn)生至 少一個(gè)保留干細(xì)胞特性子細(xì)胞的過程，自我更新能夠維持干細(xì)胞具有多分化的潛能，對(duì)于 組織特異性干細(xì)胞而言，自我更新是維持其終生具有分化潛能的基礎(chǔ)。
[0021] "腫瘤球形成能力"：指腫瘤干細(xì)胞(此處特指膠質(zhì)瘤干細(xì)胞)在體外含EGF，bFGF的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)形成腫瘤球的能力。
[0022] 綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)臨床藥物氯?？朔涌捎糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物，從而 為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的有力藥物，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0023] 圖1:氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性。MTS(四唑化物)方法檢測(cè)氯 福克酚在不同濃度（〇.3以]?、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\〇下對(duì)四株膠質(zhì)瘤干細(xì)胞株(1]87]\?；31^(：、 1]2513^：、6302、6305)，三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞株〇]251、1]871?；、似(從病人腫瘤組織分離得到的原 代膠質(zhì)瘤細(xì)胞））、三種人正常細(xì)胞株（人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA)、人神經(jīng)干細(xì)胞 (Hlp56NSC)、人胚腎細(xì)胞(293ET))作用48小時(shí)后細(xì)胞存活率，"--"表示Ι(^Ι>10 6μΜ。
[0024] 圖2Α和圖2Β:氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細(xì)胞。將帶由綠色熒光標(biāo)記的GSC2-GFP(圖2Α)或U87MG SLC-GFP(圖2Β)與不帶熒光標(biāo)記的HA 1:1混勻于體系中，而后氯?？朔?分別在1以1、3以1、1(^1、3(^1濃度下作用24小時(shí)，而后流式細(xì)胞儀分析不同處理組下存活細(xì) 胞中GSC2-GFP或U87MG SLC-GFP及HA的比例，并結(jié)合共培養(yǎng)模型在不同濃度、不同作用時(shí)間 下的細(xì)胞存活率，統(tǒng)計(jì)分析共培養(yǎng)模型中各細(xì)胞成分的相對(duì)細(xì)胞存活率。
[0025]圖3A至圖3H:氯?？朔右种颇z質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤球的生長(zhǎng)與維持。96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿 中每孔加入IOOyL含5000個(gè)GSC2的單細(xì)胞懸浮液，自然生長(zhǎng)4天后，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入 含各濃度藥物的IOOyL新鮮培養(yǎng)基，并使其藥物濃度分別為:ΟμΜ(對(duì)照，圖3A)、0.03μΜ(圖 3B)、0·lμM(圖3C)、0·3μM(圖3D)、lμM(圖3E)、3μM(圖3F)、10μM(圖3G)、30μM(圖3H)，藥物作 用時(shí)間為48小時(shí)，利用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形成腫瘤后檢測(cè)氯福克酚的抑制 效果。氯?？朔涌娠@著減小腫瘤球的體積、數(shù)量，且低濃度(〇.〇3μΜ、0.1μΜ)6302可長(zhǎng)出突 起，呈現(xiàn)明顯的分化樣特征，高濃度下（1〇μΜ、30μΜ)，可使腫瘤球邊緣細(xì)胞死亡并直至整個(gè) 腫瘤球;圖3Α至圖3Η為光鏡下檢測(cè)形態(tài)改變。
[0026]圖4:圖3Α至圖3Η中實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0027]圖5:氯福克酚抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新能力。將GSC5細(xì)胞稀釋為25、50、100、 200個(gè)/100yL，氯福克酚在1以1、3以11、1(^1、3(^1濃度下處理2周，而后統(tǒng)計(jì)無腫瘤球孔百分 比，縱坐標(biāo)表示無腫瘤球孔百分比的對(duì)數(shù)值。
[0028]圖6A和圖6B:氯福克酚對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用效果一定程度上是不可逆的。藥物 處理GSC2 24小時(shí)，48小時(shí)后分別撤藥物，換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后利用MTS的方 法檢測(cè)各處理組細(xì)胞存活率，并比較其與一直用藥物處理組的細(xì)胞活性改變。"1天"、"2天" 表示藥物處理24小時(shí)或48小時(shí)后MTS檢測(cè)；"藥物繼續(xù)作用"表示藥物處理24小時(shí)、48小時(shí)后 撤藥物，并繼續(xù)加入相應(yīng)藥物濃度的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后MTS檢測(cè)；"撤去藥物"表示藥 物處理24小時(shí)、48小時(shí)后撤藥物，并加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后MTS檢 測(cè) 。
[0029]圖7A和圖7B:氯?？朔釉?0μΜ濃度下，可明顯抑制其裸鼠原位腫瘤球形成能力。氯 ?？朔釉?0μΜ濃度下對(duì)GSC2預(yù)處理時(shí)間24小時(shí)，而后收集活細(xì)胞，取部分細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色 后細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞顱內(nèi)成瘤，IO 5個(gè)活細(xì)胞/只（5只裸鼠），并設(shè)置DMSO對(duì)照組（5只裸鼠）， DMSO處理組（圖7Α)，及氯?？朔宇A(yù)處理組（圖7Β)裸鼠原位成瘤后HE染色結(jié)果。
[0030] 圖8A和圖8B:氯?？朔涌娠@著抑制斑馬魚膠質(zhì)瘤移植瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)。48小時(shí) 斑馬魚胚胎的卵黃囊內(nèi)注射3000個(gè)帶有綠色熒光標(biāo)記的U87MG SLC-GFP，自然生長(zhǎng)48小時(shí) 后，氯福克酚1〇μΜ濃度下對(duì)其治療48小時(shí)（圖8B)，熒光顯微鏡檢測(cè)斑馬魚卵黃囊部位綠色 熒光的強(qiáng)弱，用以判斷氯?？朔訉?duì)斑馬魚移植瘤模型的抑瘤效果，圖8Α為對(duì)照組。
[0031] 圖9Α至圖9C:氯?？朔涌娠@著抑制斑裸鼠移植瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)，且副作用較小。 將GSC2細(xì)胞接種于15只5周大的Balb/C裸鼠腋下皮下，接種數(shù)目為IO 5個(gè)/只，當(dāng)裸鼠皮下腫 瘤長(zhǎng)至約IOOmm3，將其分為DMSO組、及氯?？朔铀幬锝o藥組，給藥劑量為20mg/kg，腹腔注射 給藥，給藥時(shí)間為11天，期間記錄兩組裸鼠腫瘤的體積（圖9A和圖9B)及體重（圖9C)變化。
[0032] 圖10A-1至圖10A-5:氯福克酚可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡。氯?？朔釉讦苔?對(duì)照，圖 IOA-1)、ΙμΜ(圖 10Α-2)、3μΜ(圖 10Α-3)、1 ΟμΜ(圖 10Α-4)、30μΜ(圖 10Α-5)濃度下處理GSC2 12 小時(shí)后，AnnexinV/PI雙染，流式分析各處理組內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況，圖10Α-1至圖10Α-5中 (門：P2)發(fā)現(xiàn)氯?？朔涌擅黠@誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡。
[0033] 圖10B-1至圖10B-5:氯?？朔涌烧T導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡。氯?？朔釉讦苔?對(duì)照，圖 10Α-1)、1μΜ(圖 10Α-2)、3μΜ(圖 10Α-3)、10μΜ(圖 10Α-4)、30μΜ(圖 10Α-5)濃度下處理 24 小時(shí) 后，AnnexinV/PI雙染，流式分析各處理組內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況，圖10Β-1至圖10Β-5中（門： P2)發(fā)現(xiàn)氯?？朔涌擅黠@誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面將通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0036] 實(shí)施例1:MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率
[0037] (1)按照產(chǎn)品說明書配制以下溶液：
[0038] a、DPBS:依次加入0 · 2gKCl，8 · OgNaCl，0 · 2gKH2P〇4，1 · 15gNa2HP〇4至IL，調(diào)pH至 7.35，之后加入0.1 gMgCl2.6H20,充分混勻至溶液清澈后，加入0.133gCaCl2.2H 20后，在此充 分混勻至溶液清澈。用0.2μΜ濾器過濾除菌兩次后，分裝保存在4°C ;
[0039] b、PMS溶液的配制：使用DPBS配制0.92mg/mL的PMS溶液，用0.2μΜ濾器過濾除菌兩 次后，分裝于用錫泊紙包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0040] c、MTS溶液的配制:按照Img MTS粉末用0.5mL DPBS來溶解的比例配制，輕輕混勻， 約15min，至MTS完全溶解。測(cè)量pH，使其保存在6.0-6.5之間。用0.2μΜ濾器過濾除菌兩次后， 分裝于用錫泊紙包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0041 ] d、MTS/PMS溶液的配制：分別融化MTS和PMS，37°C孵育15min，之后按照4 · 2mg MTS 粉末溶于2. ImL DPBS中，使用時(shí)加入0.1 mL PMS的比例來配制。
[0042] (2)對(duì)于氯?？朔訉?duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞活性的影響檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 用100ug/mL多聚賴氨酸包被過夜，次日生理鹽水洗兩遍，晾干后待用。將細(xì)胞消化后重懸為 單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)（U87MG SLC(5000個(gè)/孔）、U251SLC(10000 個(gè)/孔）、GSC2(10000個(gè)/孔）、GSC5(10000個(gè)/孔）），生長(zhǎng)過夜。次日加入氯?？朔?購自美國 MicroSource公司），其化學(xué)式如式I所不，氯?？怂峄瘜W(xué)分子式為C21H26CI2O,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為 <：1。1。。（<：1)。。。1(：。2。。（。。。20)(：((：)((：)(：(：((：)((：)(：，其系統(tǒng)名稱為2-[(2,4-dichlorophenyl )methyl ]_4_(2，4，4_trimethylpentan-2-yl )phenol。并設(shè)置如下濃度梯 度:0.3μΜ、ΙμΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ，每個(gè)藥物濃度3個(gè)復(fù)孔，作用48小時(shí)。
[0043]
[0044] (3)對(duì)于三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251 (購自美國ATCC)、U87MG(購自美國ATCC)、Ν3(從 病人腫瘤組織分離得到的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞，獲贈(zèng)于天壇醫(yī)院江濤老師實(shí)驗(yàn)室））、三種人正 常細(xì)胞株(人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(ΗΑ，購自美國ATCC)、人神經(jīng)干細(xì)胞(Hlp56NSC，本實(shí)驗(yàn)室建 立的細(xì)胞株）、人胚腎細(xì)胞(293ET，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心））則無需 包被實(shí)驗(yàn)用96孔細(xì)胞進(jìn)行包被。其細(xì)胞鋪板濃度均為:5000個(gè)/孔。其它操作如上。
[0045] (4)氯?？朔幼饔?8小時(shí)后，根據(jù)需要配制相應(yīng)體積的MTS/PMS檢測(cè)液，然后按照 檢測(cè)液:培養(yǎng)基=1:5的比例加入無血清培養(yǎng)基。最終每孔體系120yL，37°C，5%C02孵育2小 時(shí)。根據(jù)MTS還原后產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物的吸光度光譜，在吸收峰490nm讀取數(shù)據(jù)。并減去630nm 所讀取的數(shù)據(jù)，用以減去細(xì)胞碎片等造成的噪音值，以及其它非特異性吸光度值。
[0046] (5)根據(jù)吸光值A(chǔ)計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組）X 100%。計(jì)算 IC50值，并繪制劑量反應(yīng)曲線。
[0047] 結(jié)果見圖1，氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性。
[0048]實(shí)施例2:真核細(xì)胞慢病毒感染
[0049] 具體步驟如下：
[0050] (1)感染前將GSC2、U87MG SLC、HA細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以相應(yīng)密度（1-3 X IO5個(gè)/mL)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，體系為2mL，讓GSC2、U87MG SLC自然生長(zhǎng)2小時(shí)，HA細(xì) 胞自然生長(zhǎng)直至細(xì)胞貼壁(大約4小時(shí)）；
[0051] (2)分別往GSC2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入帶有綠色熒光的含LV3載體(帶嘌呤霉素篩選標(biāo) 記），往U87MG SLC細(xì)胞培養(yǎng)基中加入帶有綠色熒光的含pLenti6載體帶殺稻瘟素 (Blasticidin)篩選標(biāo)記，購自Promega公司）的慢病毒2yL，往HA細(xì)胞培養(yǎng)基中加入帶有紅 色熒光的慢病毒(不帶篩選標(biāo)記)2yL，充分混勻，過夜培養(yǎng)；
[0052] (3)次日上午，移去含病毒培養(yǎng)基，各加入新鮮培養(yǎng)基2mL，讓其自然生長(zhǎng)；
[0053] (4)48小時(shí)~72小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，檢測(cè)是否有相應(yīng)熒光表達(dá)，以確定 是否感染成功；
[0054] (5)確定有熒光表達(dá)后，用相應(yīng)濃度的殺稻瘟素篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的U87MG SLC細(xì)胞，用相應(yīng)濃度的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的GSC2細(xì)胞，并通過挑選單克隆的 方法篩選穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的HA細(xì)胞。
[0055]實(shí)施例3:流式細(xì)胞分析
[0056] 預(yù)先用lOOyg/mL的多聚賴氨酸包被6孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C過夜，生理鹽水洗 兩遍，晾干。將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的GSC2-GFP細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的HA細(xì)胞，消化為單 細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，均稀釋為5 X IO4個(gè)/mL，兩種細(xì)胞1:1充分混勻，分為五 管，分別加入氯?？朔?，混勻，使其濃度分別為ΟμΜ、1μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ。分別加入6孔細(xì)胞 培養(yǎng)板(2mL)及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（100yL，每組3個(gè)復(fù)孔），分別待其作用24小時(shí)，MTS方法檢測(cè) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中各處理組細(xì)胞活性，并分別收集6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞，PBS洗兩遍，各用 IOOyL重懸細(xì)胞，流式分析各處理組活細(xì)胞中GSC2-GFP、HA-RFP所占比例。并結(jié)合共培養(yǎng)模 型經(jīng)藥物處理后細(xì)胞活性變化，統(tǒng)計(jì)分析共培養(yǎng)模型中各細(xì)胞成分的相對(duì)細(xì)胞存活率。共 培養(yǎng)模型--U87MG SLC-GFP+HA-RFP的操作如上；
[0057]結(jié)果見圖2A、圖2B，相對(duì)于人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，氯?？朔涌商禺愋缘囊种乒才囵B(yǎng) 模型中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性。
[0058]實(shí)施例4:腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)
[0059] 96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿包被后每孔加入IOOyL含5000個(gè)GSC2單細(xì)胞懸浮液，自然生長(zhǎng)4天 后，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入各濃度氯?？朔拥腎OOyL新鮮培養(yǎng)基，藥物濃度分別為:0.03μ Μ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ，藥物作用時(shí)間為處理48小時(shí)后鏡下觀察各處理組腫 瘤球的形態(tài)變化，并同時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理組腫瘤球數(shù)目；
[0060]結(jié)果見圖3Α至圖3Η和圖4,利用該體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形成腫瘤后 檢測(cè)氯?？朔拥囊种菩Чl(fā)現(xiàn)氯?？朔涌娠@著減小腫瘤球的體積、數(shù)量，且低濃度(0.03μ M、0. lyM)GSC2可長(zhǎng)出突起，呈現(xiàn)明顯的分化樣特征，高濃度下（10μΜ、30μΜ)，可使腫瘤球邊 緣細(xì)胞死亡并直至整個(gè)腫瘤球。
[0061]實(shí)施例5:有限稀釋實(shí)驗(yàn) [0062] 步驟如下：
[0063] (1)將懸浮培養(yǎng)的GSC5腫瘤球細(xì)胞收集到15mL離心管中，加入0.5mL ACCUTASE酶 (購自sigma公司）37°C消化5mins，將細(xì)胞吹成單細(xì)胞，離心去上清；
[0064] (2)加入新鮮的Neurobasal培養(yǎng)基(購自gibco公司），并取部分細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色后 細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0065] (3)計(jì)算所需細(xì)胞液的體積，設(shè)置細(xì)胞濃度梯度，200，100，50，25個(gè)/孔，每種濃度 設(shè)置10個(gè)重復(fù)孔。設(shè)置DMSO對(duì)照組，及氯?？朔应苔?μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ藥物處理組；
[0066] (4)將細(xì)胞接種于96孔板中，IOOyL/孔，37°C，5%C02，孵箱中培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計(jì)無腫 瘤球孔的比例；
[0067] 結(jié)果見圖5,氯?？朔釉?μΜ、3μΜ、10μΜ濃度下可顯著抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞克隆形成， 即能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新能力。
[0068]實(shí)施例6:回復(fù)試驗(yàn)(Recovery assay)
[0069] (1)用100ug/mL多聚賴氨酸包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0070] (2 )ACCUTASE酶將GSC5消化為單細(xì)胞，新鮮Neurobasal培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞鋪于預(yù) 先包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜；
[0071] (3)加入氯?？朔?，使其濃度為0.03以]?、0.1以]\1、0.3以]\1、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1，每個(gè)濃 度9個(gè)復(fù)孔；
[0072] (4)作用24小時(shí)后，往每個(gè)濃度的3個(gè)復(fù)孔中加入20yL MTS/PMS混合試劑，檢測(cè)其 細(xì)胞活性。吸去其它6個(gè)復(fù)孔加藥培養(yǎng)基，往其中3個(gè)孔中加入新鮮培養(yǎng)基，另外3個(gè)復(fù)孔中 加入相同濃度的含氯?？朔优囵B(yǎng)基；
[0073] (5)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，MTS檢測(cè)細(xì)胞活性。
[0074]藥物作用48小時(shí)，而后檢測(cè)恢復(fù)48小時(shí)的情況，操作如上。
[0075]結(jié)果見圖6A和圖6B，氯?？朔訉?duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用效果一定程度上是不可逆 的。
[0076]實(shí)施例7:裸鼠原位成瘤
[0077] 收集經(jīng)氯?？朔?0μΜ度下預(yù)處理24小時(shí)后細(xì)胞，PBS洗兩遍，部分細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染 色，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞原位注射于5~7周齡Balb/C裸鼠顱內(nèi)紋狀體，IO5個(gè)細(xì)胞/只，每組5 只，并設(shè)置DMSO對(duì)照組。
[0078]結(jié)果見表1、圖7A和圖7B，氯福克酚預(yù)處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞GSC2,可顯著抑制其裸鼠 原位成瘤能力。
[0079]表 1
L 0081J 實(shí)施例8:斑馬魚膠質(zhì)瘤移植模型給藥實(shí)驗(yàn)
[0082] 往48小時(shí)斑馬魚胚胎的卵黃囊內(nèi)注射3000個(gè)帶有綠色熒光標(biāo)記的U87MG SLC-GFP，讓其自然生長(zhǎng)48小時(shí)，利用熒光顯微鏡檢測(cè)斑馬魚體內(nèi)腫瘤形成情況，而后往斑馬魚 孵化液中加入氯?？朔?，使其濃度為1〇μΜ，藥物處理48小時(shí)，熒光顯微鏡檢測(cè)斑馬魚卵黃囊 部位綠色熒光的強(qiáng)弱，用以判斷氯?？朔訉?duì)斑馬魚移植瘤模型體內(nèi)腫瘤的抑制效果。
[0083]結(jié)果見圖8Α和圖8Β，氯?？朔涌娠@著抑制斑馬魚移植瘤模型體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。 [0084] 實(shí)施例9:
[0085]裸鼠腋下皮下成瘤:將離心消化后的重懸于PBS的GSC2單細(xì)胞接種于15只5周大的 Balb/C裸鼠腋下皮下，接種數(shù)目為IO5個(gè)/只，記錄裸鼠的腫瘤大小(裸鼠腫瘤體積=長(zhǎng)*寬2/ 2)，當(dāng)裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)至約IOOmm3時(shí)，將其分為DMSO組、及氯福克酚藥物給藥組，給藥劑量 為20mg/kg，腹腔注射給藥，給藥時(shí)間為11天，期間記錄兩組裸鼠腫瘤的體積及體重變化。 [0086]結(jié)果見圖9A至9C，氯?？朔涌娠@著抑制斑裸鼠移植瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)，且其副作 用較小。
[0087] 實(shí)施例10:AnnexinV/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡
[0088] 具體步驟如下；
[0089] (1)氯?？朔釉?以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1濃度下處理6302 12小時(shí)或24小時(shí)；
[0090] (2)收集細(xì)胞，PBS洗兩遍；
[0091] (3)取50yL 1*結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度約為1*106個(gè)/ mL ；
[0092] (4)加入2.5yL FTIC AnnexinV和2.5yL PI;
[0093] (5)避光情況下，室溫孵育15min;
[0094] (6)往體系中加入200yLl*結(jié)合緩沖液（binding buffer)，各處理管分別過細(xì)胞 篩；
[0095] (7)流式細(xì)胞儀分析；
[0096] 所用AnnexinV/PI雙染試劑盒購自BD pharmingen，產(chǎn)品批號(hào)為556547。
[0097] 結(jié)果見圖10A-1至圖10B-5,氯?？朔涌烧T導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞凋亡。
[0098]綜上，本發(fā)明在細(xì)胞水平證實(shí)氯?？朔酉鄬?duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251、U87MG、N3(從病 人腫瘤組織分離得到的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞））、人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA)、人胚腎細(xì)胞 (293ET)，人神經(jīng)干細(xì)胞(H1P56NSC)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的四株膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(U87MG SLC、 1]2513^：、6302、6305)具有明顯的特異性抑制效果(48小時(shí)作用的1(：5()值為：7.65~10.534 M)。并進(jìn)一步通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，腫瘤球抑制實(shí)驗(yàn)，原位成瘤實(shí)驗(yàn)等證實(shí)氯?？朔涌擅黠@抑 制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新，腫瘤球形成及腫瘤形成能力。而后本發(fā)明利用斑馬魚膠質(zhì)瘤 移植瘤模型、裸鼠膠質(zhì)瘤皮下移植瘤模型，在體水平證明了氯?？朔訉?duì)膠質(zhì)瘤的治療作用。 且本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氯?？朔用黠@的誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞凋亡，在一定程度上解釋了氯?？朔?發(fā)揮對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞抑制作用及其發(fā)揮對(duì)膠質(zhì)瘤抑瘤效果的機(jī)制。
[0099]因此，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)臨床藥物氯?？朔涌赏ㄟ^抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞達(dá)到治 療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的目的。眾所周知，小分子化合物在體內(nèi)發(fā)揮功能都需倚靠相關(guān)的關(guān)鍵基 團(tuán)，而在此基礎(chǔ)上其它基團(tuán)的改變雖能產(chǎn)生不同的化合物，但也能發(fā)揮其目的功能。因此， 任何在此基礎(chǔ)上對(duì)氯福克酚的修飾，修改后達(dá)到與本發(fā)明相同效果的研究均用于本發(fā)明。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、腫瘤球形成，及體內(nèi)腫瘤形成的能力以治療所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的 用途，其中，所述膠質(zhì)瘤干細(xì)胞包括但不限于:U87MG SLC、U251SLC、GSC2、GSC5。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物還通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中，所 述膠質(zhì)瘤細(xì)胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中，所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤處于I到IV級(jí)。
【文檔編號(hào)】A61K31/055GK105943522SQ201610333673
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】彭小忠, 胡艷, 韓為, 強(qiáng)伯勤
【申請(qǐng)人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所