本發(fā)明屬于材料學(xué)及生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種纖維材料，具體來說是一種天然香料γ-癸內(nèi)酯的制備方法。

背景技術(shù)：

γ-癸內(nèi)酯（gammadecalactone），簡稱gdl，是一種帶有桃香味的內(nèi)酯類香味物質(zhì)。它是一個含有五元內(nèi)酯環(huán)的十碳化合物，為無色液體，分子式為c10h18o2，分子量為170.25，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，被廣泛用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等型香精中，是香料中需求較大的產(chǎn)品之一。隨著γ-癸內(nèi)酯在香料香精行業(yè)的廣泛應(yīng)用，很多香料公司將興趣投向了這一潛在市場并開始進(jìn)行研發(fā)，使得γ-癸內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)有了快速發(fā)展，天然γ-癸內(nèi)酯的售價也由20000美元/kg降至1000美元/kg(2014年)。

以蓖麻油酸為底物，利用發(fā)酵法制備γ-癸內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝，目前存在的最大問題是：由于蓖麻油酸具有難溶于水的特性，其在水中的分散性較差，這就導(dǎo)致蓖麻油酸分子在水相介質(zhì)中向酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運的過程受到極大限制，酵母與底物接觸不充分，致使酵母對底物的利用率降低，最終嚴(yán)重影響γ-癸內(nèi)酯的生成速率和產(chǎn)量。據(jù)目前相關(guān)文獻(xiàn)及專利報道，為了解決上述發(fā)酵過程中存在的問題，一般采用兩種方式來解決：（1）向發(fā)酵液中添加表面活性劑，以增強(qiáng)底物在水相中的分散性，而表面活性劑的加入雖然有利于底物在水相中的分散，提升底物向細(xì)胞內(nèi)的運輸速率，但其不利于細(xì)胞的正常生長，甚至高濃度的表面活性劑還會抑制酵母細(xì)胞活性，使γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量不能得到較大提升；（2）向發(fā)酵液中添加高濃度蓖麻油酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。高濃度蓖麻油酸的添加有助于增加水相中底物的有效濃度，一定時期內(nèi)可提升γ-癸內(nèi)酯的生成量，但水相中過高濃度的蓖麻油酸對酵母細(xì)胞具有較為明顯的抑制作用，不利于酵母細(xì)胞活性的維持，使最終γ-癸內(nèi)酯的總產(chǎn)量沒有較大提升，同時較大量的底物添加量增加了γ-癸內(nèi)酯生產(chǎn)的一次性投入成本，不利于產(chǎn)品的工業(yè)放大。

因此，建立一種生物毒性低及生物相容性好并且對底物分散性具有積極促進(jìn)作用的轉(zhuǎn)化體系，用于γ-癸內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化，成為目前該產(chǎn)品向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然趨勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種天然香料γ-癸內(nèi)酯的制備方法，所述的這種γ-癸內(nèi)酯的制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的方法制備γ-癸內(nèi)酯的生成速率和產(chǎn)量低的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種天然香料γ-癸內(nèi)酯的制備方法，包括如下步驟：

1)一個對改性纖維材料進(jìn)行處理的步驟，先用粉碎機(jī)將改性纖維粉碎，然后利用20、50、80或者120目的篩子對改性纖維進(jìn)行篩選；

2)一個制備包埋物的步驟，將步驟1）中篩選出的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:0.5-2混合，在30℃-60℃的溫度下水浴0.5-1.5h，并持續(xù)攪拌，獲得包埋物；

3)一個制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的步驟，所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基由七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、甘油、l-肉堿和水組成，在所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，七水硫酸鎂的濃度為7-14g/l，磷酸氫二鉀的濃度為7-14g/l，甘油的濃度為8-18g/l，l-肉堿的濃度為0.08-0.2g/l，所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的ph為6.0-6.8；

4)一個加入包埋物的步驟，將步驟2）的包埋物按照45-150g/l的量加入到上述步驟（3）的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，加入后使得蓖麻油酸的濃度為30-50g/l；

5)一個滅菌的步驟，將上述步驟4）中含有包埋物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基于115~130℃的溫度下濕熱滅菌15min；

6)一個接菌的步驟，將高活性酵母粉加入到步驟5）的物料中，菌種接種量為10-20g/l；

7)一個轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的步驟，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中的搖瓶條件為：轉(zhuǎn)速為200-300r/min，溫度為22-33℃，轉(zhuǎn)化50-90h；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐條件為：轉(zhuǎn)速為300-600r/min，溫度為22-33℃，轉(zhuǎn)化50-90h，通氣量3.0-6.0v?v^-1?m^-1，發(fā)酵結(jié)束后獲得γ-癸內(nèi)酯。

進(jìn)一步的，所述改性纖維是一種對油脂具有較強(qiáng)吸附能力并對酵母細(xì)胞無毒害作用的天然來源纖維。

進(jìn)一步的，所述改性纖維是經(jīng)過粉碎后篩選出20-120目范圍內(nèi)的用于包埋蓖麻油酸的改性纖維顆粒。

進(jìn)一步的，所述的高活性的酵母粉為市售安琪高糖型高活性干酵母。

本發(fā)明提供了一種提高底物分散性且進(jìn)一步提高γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量的方法，本發(fā)明通過將底物蓖麻油酸包埋進(jìn)入改性纖維，再利用包埋物進(jìn)行γ-癸內(nèi)酯生產(chǎn)。所述方法中所采用的包埋物（改性纖維-蓖麻油酸）具有兩個優(yōu)點：（1）提高底物在水中的分散性；（2）對底物具有緩釋作用，降低高濃度底物對細(xì)胞的抑制作用。

本發(fā)明是一種通過將蓖麻油酸與打碎的不同粒徑的纖維顆?；旌显谝黄疬M(jìn)行包埋處理,通過酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸制備天然香料γ-癸內(nèi)酯的方法。改性纖維主要包括纖維素醚類、纖維素酯類和改性纖維素的接枝共聚物。同時纖維表面布滿一些納米級和微米級的小孔，具有很強(qiáng)的吸附能力和簡單的脫附能力。本發(fā)明所使用的改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）是一種經(jīng)過改性處理的纖維材料，所以當(dāng)改性纖維在吸附蓖麻油酸飽和以后，再投入發(fā)酵液，一是對底物起到了一定的分散作用，使酵母細(xì)胞更有利于吸附到油滴表面；二是改性纖維會對蓖麻油酸具有一種緩釋作用，同時也降低了底物對于細(xì)胞的抑制作用。

本發(fā)明是以一定粒徑大小的改性纖維和蓖麻油酸形成的包埋物為底物，利用高活性酵母發(fā)酵制備天然γ-癸內(nèi)酯。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過改性纖維包埋的實驗組γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量可達(dá)8.2g/l，比對照組5.1g/l提高了60.7%。本發(fā)明提供的方法相比常規(guī)油水兩相的發(fā)酵體系具有以下優(yōu)勢：（1）有助于提升產(chǎn)物生成速率；（2）縮短發(fā)酵周期；（3）能夠緩解底物蓖麻油酸對酵母細(xì)胞的抑制作用，使細(xì)胞活性能夠達(dá)到較好的狀態(tài)，從而較大地提高了γ-癸內(nèi)酯的一次積累量。

本發(fā)明與已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明能夠打破常規(guī)的油水兩相的發(fā)酵體系，提升了產(chǎn)物生成速率，縮短了發(fā)酵周期，更重要的是能夠緩解底物蓖麻油酸對酵母細(xì)胞的抑制作用，從而較大地提高了γ-癸內(nèi)酯的一次積累量，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實施例1和2、5和6、9和10的實施例方法獲得的用不同粒徑改性纖維包埋底物和對照的產(chǎn)物生成柱狀圖。

圖2是實施例3、7和11的實施例方法獲得的不用改性纖維包埋底物的對照的產(chǎn)物生成曲線。

圖3是實施例4、8和12的實施例方法獲得的用最佳粒徑改性纖維包埋底物的產(chǎn)物生成曲線。

圖4是實施例3、7和11的實施例方法獲得的不用改性纖維包埋底物的對照的底物消耗曲線。

圖5是實施例4、8和12的實施例方法獲得的用最佳粒徑改性纖維包埋底物的底物消耗曲線。

圖6是實施例3的實施例方法獲得的對照實驗轉(zhuǎn)化18h時發(fā)酵液中油滴和酵母的顯微鏡圖。

圖7是實施例4的實施例方法獲得的用最佳粒徑改性纖維包埋底物轉(zhuǎn)化18h時發(fā)酵液中油滴和酵母的顯微鏡圖。

具體實施方式

實施例1對照實驗

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。本發(fā)明的實施例首先提供一種天然香料γ-癸內(nèi)酯的制備方法的對照實施例，包括如下步驟：

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸40g/l，七水硫酸鎂10g/l，磷酸氫二鉀10g/l，甘油15g/l，l-肉堿0.12g/l，ph為6.4，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉15g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）0.75g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)速250r/min，溫度28℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為3.5g/l。

實施例2底物包埋對γ-癸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化的影響

改性纖維材料的處理：用粉碎機(jī)將改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）粉碎，利用20、50、80、120目的篩子篩選纖維，將<20目的，20-50目的，50-80目的，80-120目的纖維顆粒分別篩選出來；包埋：將篩選出的不同目數(shù)的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:1混合，50℃水浴1小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂10g/l，磷酸氫二鉀10g/l，甘油15g/l，l-肉堿0.12g/l，ph為6.4，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸40g/l，包埋物加入量為4g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉15g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）0.75g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速250r/min，溫度28℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時用80-120目改性纖維包埋底物的搖瓶發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量最高，為5g/l。

實施例3生物發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化對照實驗

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸40g/l，七水硫酸鎂10g/l，磷酸氫二鉀10g/l，甘油15g/l，l-肉堿0.12g/l，ph為6.4，5l罐裝液量3l；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉15g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）45g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，溫度28℃，通氣量4.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時將轉(zhuǎn)速調(diào)高到600r/min，用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為5.1g/l。

實施例4生物發(fā)酵罐底物包埋轉(zhuǎn)化實驗

選擇改性纖維：將實施例2中效果最好的一組選出，選擇其對應(yīng)目數(shù)的改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）；包埋：將篩選出的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:1混合，50℃水浴1小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂10g/l，磷酸氫二鉀10g/l，甘油15g/l，l-肉堿0.12g/l，ph為6.4，5l罐裝液量3l；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸40g/l，包埋物加入量240g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉15g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）45g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，溫度28℃，通氣量4.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時將轉(zhuǎn)速調(diào)高到600r/min，用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為8.2g/l。

實施例5對照實驗

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸30g/l，七水硫酸鎂7g/l，磷酸氫二鉀7g/l，甘油8g/l，l-肉堿0.08g/l，ph為6.0，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉10g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）0.5g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床；轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)速200r/min，溫度22℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為2.6g/l。

實施例6底物包埋對γ-癸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化的影響

改性纖維材料的處理：用粉碎機(jī)將改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）粉碎，利用20、50、80、120目的篩子篩選纖維，將<20目的，20-50目的，50-80目的，80-120目的分別篩選出來；包埋：將篩選出的不同目數(shù)的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:2混合，30℃水浴0.5小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂7g/l，磷酸氫二鉀7g/l，甘油8g/l，l-肉堿0.08g/l，ph為6.0，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸30g/l，包埋物加入量為2.25g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉10g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）0.5g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速200r/min，溫度22℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時用80-120目改性纖維包埋底物的搖瓶發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量最高，為3.6g/l。

實施例7生物發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化對照實驗

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸30g/l，七水硫酸鎂7g/l，磷酸氫二鉀7g/l，甘油8g/l，l-肉堿0.08g/l，ph為6.0，5l罐裝液量3l；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉10g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）30g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，溫度22℃，通氣量3.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時將轉(zhuǎn)速調(diào)高到600r/min，用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為4.1g/l。

實施例8生物發(fā)酵罐底物包埋轉(zhuǎn)化實驗

選擇改性纖維：將實施例6中效果最好的一組選出，選擇其對應(yīng)目數(shù)的改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）；包埋：將篩選出的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:2混合，30℃水浴0.5小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂7g/l，磷酸氫二鉀7g/l，甘油8g/l，l-肉堿0.08g/l，ph為6.0，5l罐裝液量3l；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸30g/l，包埋物加入量135g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉10g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）30g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，溫度22℃，通氣量3.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時將轉(zhuǎn)速調(diào)高到600r/min，用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為6.2g/l。

實施例9對照實驗

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸50g/l，七水硫酸鎂14g/l，磷酸氫二鉀14g/l，甘油18g/l，l-肉堿0.2g/l，ph為6.8，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉30g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）1.5g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)速300r/min，溫度33℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為3.2g/l。

實施例10底物包埋對γ-癸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化的影響

改性纖維材料的處理：用粉碎機(jī)將改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）粉碎，利用20、50、80、120目的篩子篩選纖維，將<20目的，20-50目的，50-80目的，80-120目的分別篩選出來；包埋：將篩選出的不同目數(shù)的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:0.5混合，60℃水浴1.5小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂14g/l，磷酸氫二鉀14g/l，甘油18g/l，l-肉堿0.2g/l，ph為6.8，將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中，裝液量50ml；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸50g/l，包埋物加入量為7.5g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉30g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）1.5g，并接入搖瓶中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：搖瓶放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速300r/min，溫度33℃，轉(zhuǎn)化時間60h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時用80-120目改性纖維包埋底物的搖瓶發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量最高，為4.5g/l。

實施例11生物發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化對照實驗

配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：蓖麻油酸50g/l，七水硫酸鎂14g/l，磷酸氫二鉀15g/l，甘油20g/l，l-肉堿0.2g/l，ph為6.8，5l罐裝液量3l；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉30g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）90g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，溫度33℃，通氣量6.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為4.6g/l。

實施例12生物發(fā)酵罐底物包埋轉(zhuǎn)化實驗

選擇改性纖維：將實施例10中效果最好的一組選出，選擇其對應(yīng)目數(shù)的改性纖維（購自上海古陽實業(yè)有限公司，型號：gy131）；包埋：將篩選出的改性纖維與蓖麻油酸按質(zhì)量比1:0.5混合，60℃水浴1.5小時，并持續(xù)攪拌；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制：七水硫酸鎂14g/l，磷酸氫二鉀14g/l，甘油18g/l，l-肉堿0.2g/l，ph為6.8，5l罐裝液量3l；包埋物的加入：依據(jù)蓖麻油酸50g/l，包埋物加入量450g；滅菌：121℃，濕熱滅菌15min；接菌：滅完菌待冷卻后，依據(jù)酵母粉30g/l，在無菌條件下稱取高活性酵母粉（購自安琪酵母股份有限公司，型號：食品級）90g，并接入發(fā)酵罐中；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，溫度33℃，通氣量6.0v?v^-1?m^-1，轉(zhuǎn)化時間90h，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；檢測：取樣時用移液管取10ml，加入三倍體積的無水乙醇，充分震蕩搖勻，取樣處理進(jìn)行氣相色譜法檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為7.1g/l。

底物、產(chǎn)物檢測方法如下：

1、γ-癸內(nèi)酯的氣相色譜檢測方法：色譜柱為hp-5，載氣為n2，選擇恒定流量的進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量為0.2ul，進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為250℃和300℃，柱溫箱的升溫程序為：初始溫度120℃保持2min，30℃/min升溫到205℃，再4℃/min升溫到215℃，再20℃/min升溫到280℃，保持5min。

2、蓖麻油酸的高效液相色譜檢測方法：色譜柱為c18柱，uvd檢測器，檢測波長為205nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為2.0ul，流動相及其比例為含0.1%磷酸的水:甲醇＝5:95，流速為0.8ml/min。

發(fā)酵液鏡檢方法：

1、發(fā)酵液鏡檢方法：取發(fā)酵液，涂于載玻片，蓋玻片覆蓋時確保無氣泡，在顯微鏡下觀察發(fā)酵液中細(xì)胞和油滴的形態(tài)與分布并拍照。