一種制備γ-癸內(nèi)酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種Y-癸內(nèi)酯，具體來說是一種制備Y-癸內(nèi)酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ-癸內(nèi)酯(gamma decalactone)，又名丙位癸內(nèi)酯，是一種重要的含有五元內(nèi)酯環(huán)的芳香化合物，呈愉快桃子和椰子香氣，在香料工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)階段γ-癸內(nèi)酯的獲取方式有三種方法:天然提取、化學(xué)合成和生物法制備。γ-癸內(nèi)酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，因此可以從水果中提取得到γ-癸內(nèi)酯，但其在水果中的含量極少，經(jīng)濟效益低?；瘜W(xué)合成法也可以得到γ-癸內(nèi)酯，但其合成的γ-癸內(nèi)酯主要為無旋光的外消旋體，沒有從水果中提取出的具有光學(xué)活性的γ-癸內(nèi)酯具有優(yōu)勢，且無法滿足人們對天然產(chǎn)物的追求。生物法制備γ-癸內(nèi)酯以其天然性及原料的廉價性日益成為中內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點，并在這方面的研究越來越深入，為以后的產(chǎn)業(yè)化打下了基礎(chǔ)。
[0003]生物法制備γ -癸內(nèi)酯的研究中，較為成熟的為生物轉(zhuǎn)化法。在生物轉(zhuǎn)化法制備γ-癸內(nèi)酯的研究中，采用最多的底物為蓖麻油，也有少量文獻(xiàn)中提到用蓖麻油酸作為轉(zhuǎn)化合成γ-癸內(nèi)酯的底物。當(dāng)?shù)孜餅楸吐橛退釙r，該生物轉(zhuǎn)化體系中存在很多困難，如蓖麻油酸對酵母細(xì)胞的毒性、酵母對蓖麻油酸的利用率低、轉(zhuǎn)化周期長、γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量低等，嚴(yán)重阻礙了對以蓖麻油酸為底物生物轉(zhuǎn)化制備γ-癸內(nèi)酯的研究及其工業(yè)化的路程。而且，在生物轉(zhuǎn)化制備γ-癸內(nèi)酯時，當(dāng)發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量累積到一定濃度時，γ-癸內(nèi)酯會與酵母細(xì)胞中的內(nèi)酯酶的結(jié)合位點結(jié)合，進(jìn)而造成產(chǎn)物的開環(huán)降解，即使當(dāng)發(fā)酵液中底物充足時，γ-癸內(nèi)酯被大量降解的情況依然存在。因此，有研究采用原位分離的方法，如向發(fā)酵液中添加大孔吸附樹脂、利用雙液相萃取法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化等，以此來將發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯部分移除，降低酵母對γ-癸內(nèi)酯的降解；但這些方法在生產(chǎn)中仍存在明顯的缺點，如生產(chǎn)成本高、兩相分離提純復(fù)雜、樹脂易被污染造成轉(zhuǎn)化過程非常容易染菌或交叉污染等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種制備γ -癸內(nèi)酯的方法，所述的這種制備γ -癸內(nèi)酯的方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中的方法成本高，分離困難的技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明提供了一種制備γ -癸內(nèi)酯的方法，以酵母CICC32859為菌種制成種子培養(yǎng)液，然后接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，以蓖麻油酸為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制備γ-癸內(nèi)酯，在生物轉(zhuǎn)化過程中向發(fā)酵液中添加γ-內(nèi)酯化合物，添加到發(fā)酵液中的γ-內(nèi)酯化合物的含量為0.01 ?0.5g/L0
[0006]進(jìn)一步的，所述的制備方法包括如下步驟:
[0007](I) 一個選取菌種的步驟，以酵母CICC32859為菌種；
[0008](2) 一個斜面培養(yǎng)的步驟，將酵母CICC32859接種于斜面培養(yǎng)基上，20?35°C培養(yǎng)24?36H ;所述的斜面培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖10g/L，氯化鈉4g/L，氯化鈣5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨 10g/L，瓊脂 20g/L，pH 為 7 ;
[0009](3) 一個配制種子液的步驟，將步驟(2)所得的菌株，接種到種子培養(yǎng)基中，在20?35°C條件下，150?250r/min搖床培養(yǎng)20?24H，得到成熟的種子培養(yǎng)液；所述的種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20g/L，磷酸氫二銨2g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨 5g/L，pH 為 7 ;
[0010](4) 一個轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的步驟，將步驟(3)獲得的成熟種子液，按接種量10?20 %接種到含有L-肉堿的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的配方為:蓖麻油酸10?40g/L，L-肉堿0.01?0.5g/L，葡萄糖I?20g/L，氯化鈉I?10g/L，磷酸氫二鉀0.5?10g/L，七水硫酸鎂3?15g/L，磷酸二氫銨0.5?15g/L，酵母膏I?20g/L，吐溫-800.5?10g/L，pH為
5.5?7.5，以蓖麻油酸為底物，在轉(zhuǎn)速為150?250r/min，溫度為25?35°C的條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)36?60H，然后無菌條件下添加γ-內(nèi)酯化合物，所述的γ-內(nèi)酯化合物的添加量為
0.01?0.5g/L，在轉(zhuǎn)速為150?250r/min，溫度為25?35°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)12?24H，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)結(jié)束，獲得含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液。
[0011]進(jìn)一步的，所述的γ-內(nèi)酯化合物為γ-己內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、或者γ-十四內(nèi)酯。
[0012]本發(fā)明是一種通過酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸制備γ-癸內(nèi)酯的方法，通過向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加L-肉堿，促進(jìn)了酵母對底物蓖麻油酸的利用，縮短了轉(zhuǎn)化周期、提高γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量，另一方面，L-肉堿還能在一定程度上降低底物蓖麻油酸對酵母的毒害作用，維護酵母細(xì)胞的活性。更重要的是，在生物轉(zhuǎn)化過程中，通過向發(fā)酵液中添加少量或微量的其它的γ-內(nèi)酯化合物，使其與γ-癸內(nèi)酯對內(nèi)酯酶的結(jié)合位點形成競爭，從而抑制酵母對γ-癸內(nèi)酯的降解，從而極大地提高γ -癸內(nèi)酯的累積濃度和產(chǎn)量。
[0013]本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明提供的γ-癸內(nèi)酯制備方法除了提升產(chǎn)物生成速率、縮短發(fā)酵周期，更重要的是提供了一種新的抑制酵母菌對產(chǎn)物γ-癸內(nèi)酯開環(huán)降解的方法，從而極大的提高了 γ-癸內(nèi)酯的一次性累積量，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0014]下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0015]本發(fā)明采用的酵母CICC32859是公開銷售的微生物，來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，該機構(gòu)的地址為:北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓(100015)，可以通過電話購買，也可以通過網(wǎng)站訂購(http://www.china-cicc.0rg)，任何人只要支付相關(guān)的費用均可以購買。
[0016]實施例1
[0017]—種酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸制備γ-癸內(nèi)酯的方法，包括下列步驟:將酵母CICC32859制成種子液，然后將其接種到含有L-肉堿的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，以蓖麻油酸為底物，在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧生物轉(zhuǎn)化，溫度控制在25?35 °C，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)36?48H后，于無菌條件下向發(fā)酵液中添加γ -內(nèi)酯0.01?0.5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)12?24H，生物轉(zhuǎn)化結(jié)束，得到含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；培養(yǎng)結(jié)束后，取一定體積的發(fā)酵液，用三倍體積的正己烷萃取，取有機相進(jìn)行氣相檢測，得到發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量，以下各實施例中均以此方法得到γ-癸內(nèi)酯。
[0018]所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的配方為:蓖麻油酸10?40g/L，L-肉堿0.01?0.5g/L，葡萄糖I?20g/L，氯化鈉I?10g/L，磷酸氫二鉀0.5?10g/L，七水硫酸鎂3?15g/L，磷酸二氫銨 0.5 ?15g/L，酵母膏 I ?20g/L，吐溫-800.5 ?10g/L，pH 5.5 ?7.5。
[0019]所述轉(zhuǎn)化過程，搖瓶培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速150?250r/min ;發(fā)酵罐培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速為200 ?600r/min,通氣比為 0.2 ?3.0v.v、m、
[0020]實施例2對照實施例
[0021]將酵母CICC32859接種于斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，用接種環(huán)從活化的斜面中挑取兩環(huán)菌體接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于28 °C恒溫?fù)u床中，180r/min培養(yǎng)20H，得到成熟的種子液；按體積百分比10%的接種量，轉(zhuǎn)接到裝有50mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于30°C恒溫?fù)u床中，200r/min轉(zhuǎn)化培養(yǎng)84H，生物轉(zhuǎn)化結(jié)束，獲得含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；取2mL含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液，用6mL正己烷萃取，取有機相進(jìn)行氣相檢測，測得60H時發(fā)酵液中的γ -癸內(nèi)酯的含量最高且為3.5g/L，72H時發(fā)酵液中的γ-癸內(nèi)酯的含量為3.lg/L，84H時發(fā)酵液中的γ-癸內(nèi)酯的含量為2.7g/L。
[0022]所述的斜面培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖10g/L，氯化鈉4g/L，氯化鈣5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，pH 7 ;所述的種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20g/L，磷酸氫二銨2g/L，磷酸氫二鉀5g/L，氯化鈉5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7 ;所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的配方為:蓖麻油酸15g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉7g/L，磷酸氫二鉀3g/L，七水硫酸鎂5g/L，磷酸二氫銨 2g/L，酵母膏 10g/L，吐溫-800.7g/L，pH 6.5。
[0023]實施例3 L-肉堿的添加對γ -癸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化的影響
[0024]將酵母CICC32859接種于斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，用接種環(huán)從活化的斜面中挑取三環(huán)菌體接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于28°C恒溫?fù)u床中，230r/min培養(yǎng)22H，得到成熟的種子液；按體積百分比12%的接種量，將種子液轉(zhuǎn)接到裝有50mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于32°C恒溫?fù)u床中，250r/min轉(zhuǎn)化培養(yǎng)84H，生物轉(zhuǎn)化結(jié)束，獲得含有Y-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液；取2mL含有γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵液，用6mL正己烷萃取，取有機相進(jìn)行氣相檢測；當(dāng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中L-肉堿的濃度為0.3g/L，測得36H時發(fā)酵液中的γ -癸內(nèi)酯的含量最高且為4.7g/L，測得48H時發(fā)酵液中的γ -癸