d)中，收集洗脫液，主要含有PEG-ALD修飾后的低分子量尿激酶化合物。
[0027]修飾反應(yīng)緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液或者醋酸鹽緩沖溶液。作為優(yōu)選，修飾反應(yīng)緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液。
[0028]作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的摩爾比例為1~50。作為再優(yōu)選，所述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的摩爾比例為3-25 ο
[0029]作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的修飾反應(yīng)緩沖液PH值為5~7。
[0030]作為優(yōu)選，所述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的溫度為4~37°C0
[0031]作為優(yōu)選，所述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的反應(yīng)時間為4~24小時。
[0032]作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與低分子量尿激酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)采用NaCNBHjt為催化劑。
[0033]作為優(yōu)選，上述的陽離子層析凝膠為SP-Sepharose Fast Flow、CM-SepharoseFast Flow、SP-High Performance 或 Mono-S。
[0034]本發(fā)明還提供了聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶具有長效、高效和低免疫原性等長效制劑的特征，為制備治療高纖維蛋白原血癥和預(yù)防動脈粥樣硬化(AS)、血栓栓塞并發(fā)癥、糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病等疾病的長效制劑奠定了基礎(chǔ)。
[0035]一種聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的用途，用于制備治療高纖維蛋白原血癥和預(yù)防動脈粥樣硬化、血栓栓塞并發(fā)癥、糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病的藥物。
[0036]本發(fā)明還提供了一種治療高纖維蛋白原血癥的藥物。
[0037]—種治療高纖維蛋白原血癥的藥物，其含有聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶作為有效成分。
[0038]本發(fā)明還提供了一種預(yù)防動脈粥樣硬化、血栓栓塞并發(fā)癥的藥物。
[0039]一種預(yù)防動脈粥樣硬化、血栓栓塞并發(fā)癥的藥物，其含有聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶作為有效成分。
[0040]本發(fā)明還提供了一種預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病的藥物。
[0041]一種預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病的藥物，其含有聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶作為有效成分。
[0042]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明采用對低分子量尿激酶的N-末端選擇性高的修飾方法，即活化的聚乙二醇和低分子量尿激酶的N-末端通過共價鍵的方式連接，是產(chǎn)物的均一性和穩(wěn)定性得到大大提高，容易純化，純化產(chǎn)物的活性能夠得到較好地保留。修飾后的產(chǎn)物顯著提高了穩(wěn)定性、延長了體內(nèi)半衰期、并減輕了副作用、增加了作用特異性。聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶能夠用于治療高纖維蛋白原血癥和預(yù)防動脈粥樣硬化(AS)、血栓栓塞并發(fā)癥、糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病等疾病。聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶作為有效成分的藥物能夠有效治療高纖維蛋白原血癥和預(yù)防動脈粥樣硬化(AS)、血栓栓塞并發(fā)癥、糖尿病血管并發(fā)癥、糖尿病腎病等疾病的功效。聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的制備方法，該方法步驟簡單，易于實(shí)現(xiàn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0043]圖1 是采用 SP-S^harose Fast Flow 層析柱對 mPEG-ALD_20K 修飾后的 LMff-UK進(jìn)行純化后的SDS-PAGE電泳圖。
[0044]圖2是純化前mPEG-ALD-20K修飾LMff-UK樣品的反相色譜圖。
[0045]圖3是純化后mPEG-ALD-20K修飾LMff-UK樣品的反相色譜圖。
[0046]圖4是mPEG-ALD-20K與LMff-UK反應(yīng)混合物的MALD1-TOF MS檢測結(jié)果圖。
[0047]圖5是mPEG-ALD_20K偶聯(lián)蛋白和LMff-UK原蛋白大鼠靜脈給藥后的血藥濃度隨時間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0049]如圖1，泳道1:為mPEG-ALD-20K對LMff-UK修飾后的樣品；泳道4:為0.1M醋酸鹽+0.1M NaCl，pH5.5緩沖液洗脫制備的ALD-20K-LMW-UK純蛋白；泳道7:蛋白Marker。
[0050]如圖2和圖3所示，圖2為純化前mPEG-ALD-20K修飾蛋白，是未修飾的LMff-UK與mPEG-ALD-20K修飾的LMff-UK的混合物，可以看出修飾率高于50%。圖3為純化后mPEG-ALD-20K修飾蛋白，反相檢測結(jié)果顯示修飾蛋白呈單一吸收峰，單修飾產(chǎn)物純度在95%以上。
[0051]如圖4，mPEG-ALD-20K與LMff-UK反應(yīng)混合物的MALD1-TOF MS檢測結(jié)果圖，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合物中含有未修飾的LMff-UK和修飾后的ALD-20K-LMW-UK蛋白，修飾蛋白的分子量約為53kDa，與預(yù)期相符。
[0052]如圖5，通過同位素標(biāo)記示蹤法對LMff-UK及ALD-20K-LMW-UK的藥代動力學(xué)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未修飾的LMff-UK相比，ALD-20K-LMW-UK的血藥濃度降低較為緩慢，半衰期明顯增長，且AUC顯著增高，血漿清除速度明顯下降。
[0053]1、聚乙二醇醛對低分子量尿激酶的修飾:
(I)用10~100mM，pH5.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液將高純度低分子量尿激酶(LMff-UK)凍干粉配制成l~30mg/ml的溶液，優(yōu)選50mM、pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液溶解；優(yōu)選的LMff-UK反應(yīng)濃度為l~10mg/ml。
[0054](2)按摩爾比LMff-UK:PEG-醛:還原劑=1: 3-25: 30~250在4~37°C的條件下反應(yīng)4~24小時；優(yōu)選的反應(yīng)比例為LMff-UK:PEG:還原劑=1: 20: 200，PEG-醛優(yōu)選PEG-丙醛(PEG-ALD)，分子量20kDa ;優(yōu)選的反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)時間優(yōu)選為12小時，優(yōu)選的還原劑為NaCNBH3。
[0055]2、聚乙二醇修飾的低分子量尿激酶的分離純化:
(a)選用離子交換層析，優(yōu)選SP-SepharoseFast Flow ；
(b)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值和電導(dǎo)，用已經(jīng)平衡好的SP柱上樣，再用平衡液沖洗； (c)繼續(xù)用沖洗液進(jìn)行沖洗，收集沖洗峰；
Cd)最后用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。
[0056]步驟(b)中，SP層析柱平衡液為0.01~0.2M醋酸鹽緩沖液(pH4.0-8.0),氯化鈉濃度為0~0.2M氯化鈉，優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為0M、pH5.5。
[0057]步驟(b)中，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為4.0-8.0，電導(dǎo)l~10mS/cm ;優(yōu)選條件pH5.5，電導(dǎo) 5mS/cm。
[0058]步驟(c)為沖洗步驟，使用pH4.0-8.0,0.01-0.2M醋酸鹽緩沖液，含有0.05M-0.3M氯化鈉，優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，含有0.05M氯化鈉，pH5.5進(jìn)行沖洗。
[0059]步驟(d)為洗脫步驟，使用pH4.0-8.0,0.01-0.2M醋酸鹽緩沖液，含有0~1.0M氯化鈉，優(yōu)選0.1M醋酸鹽緩沖液，加入0.1M氯化鈉，pH5.5進(jìn)行洗脫。
[0060]步驟(b)中，收集上樣和平衡穿透，主要含有未參與修飾的游離的PEG-ALD。
[0061]步驟(C)中，收集沖洗液，主要含有未參與修飾的低分子量尿激酶。
[0062]步驟(d)中，收集洗脫液，主要含有PEG-ALD修飾后的低分子量尿激酶化合物。
[0063]實(shí)施例1:單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)對低分子量尿激酶(LMff-UK) N-末端修飾條件的選擇
反應(yīng)pH值的選擇:各稱取0.5mg LMff-UK干粉分別溶解于0.5ml pH值為5.0、5.5、6.0、
6.5、7.0的50mM PB緩沖溶液中，再各加入mPEG-ALD_20K固體12.12mg，使修飾摩爾比為1:20,溶解，混勻，于室溫反應(yīng)過夜后終止反應(yīng)，SDS-PAGE比較修飾率，確定最優(yōu)修飾pH值。
[0064]結(jié)果表明:在這些修飾條件下均能得到聚乙二醇修飾的LMW-UK，其中pH值為6.5時修飾率最高。
[0065]修飾劑分子量的選擇:取4份pH6.5溶解的lmg/ml的LMff-UK各0.5ml，再分別加入 mPEG-ALD-10K、mPEG-ALD_20K、mPEG-ALD_30K、mPEG-ALD_40K 固體 6.06mg、12.12mg、18.18mg、24.24mg，使修飾摩爾比均為1:20，溶解，混勻，于室溫反應(yīng)過夜后終止反應(yīng)，SDS-PAGE比較修飾率，確定修飾劑的最佳分子量。
[0066]結(jié)果表明:四種不同分子量的PEG-ALD均能修飾上LMff-UK，其中PEG-ALD-20K的修飾率最高。
[0067]反應(yīng)溫度的選擇:取三份pH6.5 PB溶解的lmg/ml的LMff-UK 0.5ml，再分別加入mPEG-ALD-20K固體12.12mg，溶解，混勻，然后分別置于4°C、25°C、37°C反應(yīng)過夜后終止反應(yīng)，SDS-PAGE比較修飾率，確定最佳修飾溫度。
[0068]結(jié)果表明:在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的LMW-UK，其中25°C的修飾率最尚O
[0069]LMff-UK同mPEG-ALD-20K反應(yīng)摩爾比的選擇:各取0.5ml溶解于pH6.5磷酸鹽緩沖液的 LMff-UK (lmg/ml) 5 份，分別加入 mPEG-ALD_20K 固體 1.82mg、3.03mg、6.06mg、12.12mg、30.30mg (相當(dāng)于 mPEG-ALD_20K 同 L