專利名稱：：糖鏈衍生物的制造方法、結(jié)構(gòu)解析方法、以及糖鏈衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來自糖鏈的混合物的糖鏈衍生物的制造方法、以及糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法。進(jìn)一步，涉及根據(jù)本發(fā)明的糖鏈衍生物的制造方法制造的新的糖鏈衍生物。
背景技術(shù)：
：糖蛋白質(zhì)中的糖鏈認(rèn)為具有保持蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)、獲得防止被蛋白酶的分解的抵抗性等作用。最近，逐漸地闡明了糖蛋白質(zhì)中的糖鏈參與受精和分化、信號(hào)傳導(dǎo)、癌化、蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)輸送和生理活性的調(diào)節(jié)等的生命現(xiàn)象。另外，還闡明了細(xì)胞表面的粘接分子和糖蛋白質(zhì)性激素等的糖鏈與其功能的關(guān)系，總結(jié)了糖質(zhì)科學(xué)公會(huì)(consortium)構(gòu)想?，F(xiàn)在，糖鏈功能研究的中心研究以影響其的生合成糖轉(zhuǎn)移酶(糖鏈基因)為中心，如果考慮糖轉(zhuǎn)移酶還根據(jù)基因組情報(bào)被保存，利用與其他蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)作業(yè)，參與生命功能，還需要利用捕捉細(xì)胞、組織中表達(dá)的糖鏈的整體圖像進(jìn)行解析的結(jié)構(gòu)糖組學(xué)(glyconomics)手法，進(jìn)行糖鏈的功能解析。糖鏈科學(xué)中的結(jié)構(gòu)糖組學(xué)的作用是綜合地解析在多數(shù)生命現(xiàn)象中擔(dān)負(fù)重要作用的糖鏈識(shí)別機(jī)理，對(duì)功能糖組學(xué)是不可缺少的要素。作為結(jié)構(gòu)糖組學(xué)所要求的技術(shù)的要素，有高綜合性、高生產(chǎn)量、高感度以及高精度。現(xiàn)在，作為糖蛋白質(zhì)糖鏈的結(jié)構(gòu)解析法，對(duì)從蛋白質(zhì)切出的糖鏈進(jìn)行焚光標(biāo)記后，利用高效液相色鐠(HPLC)或者質(zhì)譜分析法(MS)的解析的方法成為利用質(zhì)譜分析的快速技術(shù)進(jìn)步的有力的手段(非專利文獻(xiàn)1~4)，唾液酸糖鏈的分離中，逐漸地專門地利用陰離子交換色譜色譜(非專利文獻(xiàn)5)。非專利文獻(xiàn)1BiomedChromatogr.16:103-115(2002)非專利文獻(xiàn)2AnalBiochem.206:278-287(1992)非專利文獻(xiàn)3BiochemSocTrans.21:121-125(1993)非專利文獻(xiàn)4ChemRev.102:321-369(2002)非專利文獻(xiàn)5BiochimBiophysActa.705:167-173(1982)但是，對(duì)細(xì)胞或組織中的糖鏈綜合解析的場合，由于存在唾液酸和巖藻糖等的非還原末端修飾的多樣性和糖鏈的分枝這樣的問題，不能充分地分離混合存在的糖鏈，不能得到滿意的結(jié)果。特別地，如果使用離子交換色鐠等，由于沒有特異的分離能力，不僅不能獲得充分的分離，而且分離操作后必須要進(jìn)行脫鹽處理，可以說并不是實(shí)用的方法。因此，對(duì)這些的糖鏈不均一性情報(bào)有擔(dān)心，同時(shí)迫切希望對(duì)細(xì)胞、組織可以詳細(xì)進(jìn)行特征糖鏈結(jié)構(gòu)解析的實(shí)用的手法。本發(fā)明的課題在于，提供從像細(xì)胞或者組織中的糖鏈那樣混合存在的各種的糖鏈的狀態(tài)分離、獲取各糖鏈的手段。另外，本發(fā)明課題在于，提供對(duì)于分離的各糖鏈化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的手段。進(jìn)一步，本發(fā)明的課題在于提供新的糖鏈衍生物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及以下的發(fā)明。1.糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于，包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺(serotonin)親合柱色鐠法進(jìn)行處理的工序。2.上述1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具備(c)采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。3.上述記栽的糖鏈衍生物的制造方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。4.糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色鐠法進(jìn)行處理的工序、以及(e)用質(zhì)鐠分析法進(jìn)行處理的工序。5.上述記栽的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其特征在于，在(b)工序之后，具備(c)通過采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。6.上述記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，在(c)工序之前具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。7，上述4記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，質(zhì)鐠分析法是利用MALDI-T0FMS的質(zhì)鐠分析法。8.后述的式(1)~(6)表示的糖鏈衍生物[式中W表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、p-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3。在此，Asn表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保護(hù)基。Ac表示乙酰基。]。9.由式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標(biāo)記物。本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基成為糖鏈衍生物后，釆用把對(duì)唾液酸有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱色鐠法進(jìn)行處理，由此可以進(jìn)行無唾液酸糖鏈和唾液酸糖鏈的分離，還可以利用唾液酸殘基的數(shù)目對(duì)唾液酸糖鏈中的單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖鏈等進(jìn)行分離。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，把利用該親合柱色鐠法分離的級(jí)分，分別供給使用氨基柱或者酰氨基柱的色譜，將分枝結(jié)構(gòu)不同的糖鏈衍生物可以進(jìn)行詳細(xì)分離，可以大量地制造單一結(jié)構(gòu)的糖鏈。另外還發(fā)現(xiàn)，使分離的各糖鏈衍生物與適當(dāng)?shù)奶撬饷缸饔?，供給采用氨基柱或者酰氨基柱的色鐠進(jìn)行分離，對(duì)得到的糖鏈衍生物用質(zhì)譜分析法進(jìn)行處理，由此可以高精度且綜合地解析糖鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的制造方法中使用的糖鏈混合物的糖鏈沒有特別的限制，包括天冬酰胺鍵合型糖鏈(N-葡糖戒鍵合型糖鏈)、mucin型糖鏈(0-葡糖戒鍵合型糖鏈)、游離型糖鏈、進(jìn)一步還包括像糖鏈鍵合天冬酰胺那樣的結(jié)合了氨基酸的糖鏈。這些糖鏈也可以是利用化學(xué)的手法調(diào)制的糖鏈，例如，從天然的物，優(yōu)選使用這些糖鏈的混合物。此外，優(yōu)選使用含有在糖鏈殘基上具有唾液酸殘基的糖鏈的糖鏈混合物。作為天然糖鏈的混合物，可舉出天然原料、例如乳汁、牛由來胎球蛋白、卵或者生體的組織或細(xì)胞由來的糖鏈混合物。特別地，使用癌組織或者癌細(xì)胞由來的糖鏈混合物可以期待特別濃厚興趣的結(jié)果。作為本發(fā)明中可以使用的天然糖鏈的混合物，可優(yōu)選以下所示的糖鏈混合物，特別優(yōu)選含有唾液酸糖鏈的糖鏈混合物?？梢允褂孟率霁@得的混合物，即，從該天然原料中利用公知的方法獲得糖蛋白質(zhì)以及/或者糖肽的混合物，使當(dāng)該混合物與蛋白質(zhì)分解酶等作用，切斷肽部分，利用釆用凝膠過濾柱或者離子交換柱等的色譜法進(jìn)行精制獲得的糖鏈鍵合天冬酰胺的混合物。另外，可以使用下述獲得的混合物，即，釆用例如生體的組織或者細(xì)胞、特別是培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)液中的組織或者細(xì)胞勻化，然后將離心分離獲得的細(xì)胞膜級(jí)分，用2-巰基乙醇處理后，使作用于N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖鏈的混合物。另外，可以使用將培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞勻化，采集離心分離的上清液獲得的游離糖鏈的混合物。在這些的糖鏈之中由于含有作為中性糖鏈的高甘露糖型糖鏈和多種唾液酸糖鏈，所以適用于各種糖鏈的制造。在獲得的糖鏈的混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基使其成為糖鏈衍生物的混合物。脂溶性基是與糖鏈的還原末端的開環(huán)醛、糖鏈鍵合天冬酰胺的天冬酰胺氨基或者羧基反應(yīng)形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3-或者4-羧基苯基氨基、p-乙氧基羰基苯基氨基、2-吡咬基氨基等作為通常熒光標(biāo)記使用的取代基、或者9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔-丁氧基羰基(B0C)基、芐基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等的作為氨基曱酸酯系或者酰胺系保護(hù)基使用的取代基。這些脂溶性基的導(dǎo)入可以利用公知的方法進(jìn)行導(dǎo)入，從操作的簡便、得到的糖鏈衍生物的穩(wěn)定性、激發(fā)光與水銀光源或者激光光源對(duì)應(yīng)等方面出發(fā)，可以優(yōu)選使用2-羧基苯基氨基、Fmoc基或者BOC基。例如，采用2-氨基苯甲酸，在氰基硼氫化鈉或者二甲基氨基化硼等的還原劑的存在下，使其與糖鏈反應(yīng)，由此可以成為氨基醛糖醇衍生物。另外，例如采用9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，在碳酸氫鈉存在下，使與糖鏈鍵合天冬酰胺反應(yīng)，可以在天冬酰胺的氨基導(dǎo)入氨基曱酸酯樣上鍵合的Fmoc基。根據(jù)以上的操作，可以得到導(dǎo)入了脂溶性基的糖鏈衍生物的混合物。把獲得的糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進(jìn)行分離。本發(fā)明中的5-羥色胺親合柱色譜法可以采用把與唾液酸具有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱。作為5-羥色胺親合柱，可以將5-羥色胺固定在填充劑上制成，也可以采用市售的柱。作為市售的柱，可舉出LA-5-羥色胺柱(林式會(huì)社J-才4》纟/UX制)等。色鐠的分離條件可以適當(dāng)設(shè)定，如果舉出其一例，釆用熒光檢測器，設(shè)定激發(fā)波長350nm、熒光波長425nm，流速0.5ml/min、流動(dòng)相使用超純水和醋酸銨水溶液，進(jìn)行直線梯度洗脫，可以達(dá)到分離。通過5-羥色胺親合柱色鐠法，將糖鏈衍生物的混合物，根據(jù)糖鏈衍生物的唾液酸殘基的數(shù)目可以進(jìn)行分離，沒有唾液酸殘基的無唾液酸糖鏈衍生物最早洗脫，接著按單唾液酸糖鏈衍生物、二唾液酸糖鏈衍生物這樣地與唾液酸殘基的數(shù)目增加成比例地進(jìn)行分離洗脫。把利用以上的5-羥色胺親合柱分離的糖鏈衍生物，用采用聚合物基質(zhì)的氨基柱或者二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱的正相HPLC進(jìn)行處理，由此可以很好地進(jìn)行糖鏈衍生物間的分離。所謂正相色鐠法，是將氨基、氨基丙基、丙烯酰胺基等極性固定相作為填充劑使用的色鐠法，其特征在于，根據(jù)相對(duì)于試料成分的固定相-流動(dòng)相的試料成分的分配度的差別達(dá)到分離?；旧鲜腔谔擎湹挠H水性而分離的模式，還可以優(yōu)選用在結(jié)合了唾液酸的糖鏈的異構(gòu)體的分離中。另外，還可以利用在采用稀酸或者唾液酸苷酶處理的無唾液酸型的糖鏈的分離中。作為使用的聚合物基質(zhì)的氨基柱，是將把氨基結(jié)合在聚乙烯醇系基材凝膠等的聚合物上的固定相作為填充劑使用的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的氨基柱，可舉出AsahiShodexNH2P-504E(昭和電工林式會(huì)社制)。作為二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱，是將把丙烯酰胺等的酰胺基與把二氧化硅作為固定相的填充劑進(jìn)行化學(xué)鍵合而導(dǎo)入的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的酰氨基柱，可舉出TSK-GELAmide-80(TOSOHCorp制)。色譜的分離條件進(jìn)行適宜地設(shè)定，如果舉出其一例，通過釆用熒光檢測器，激發(fā)波長350nm、熒光波長425nm,流速lml/min，流動(dòng)相采用含有醋酸的乙腈和醋酸以及含有三乙胺的水溶液，進(jìn)行線性梯度洗脫可以進(jìn)行分離。以上那樣分離獲得的糖鏈衍生物通過采用糖水解酶、利用質(zhì)鐠分析法進(jìn)行分析，可以將其糖鏈結(jié)構(gòu)解析。作為糖水解酶，可以采用^>知的酶，例如可舉出唾液酸酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺糖普酶(acetylglucosamidase)、巖藻糖苷酶等。作為質(zhì)譜分析方法，利用采用現(xiàn)有公知的質(zhì)譜分析法的質(zhì)鐠分析裝置進(jìn)行，近年特別優(yōu)選采用用于糖鏈分析的MALDI-TOFMS進(jìn)行測定。為了解析糖鏈結(jié)構(gòu)，與特定的糖水解酶作用后，通過釆用聚合物基質(zhì)的氨基柱或者二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱的正相HPLC處理，將得到的級(jí)分質(zhì)鐠分析，考慮到消失的質(zhì)量分和水解酶的特性，可以通過進(jìn)一步反復(fù)該操作進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)解析。獲得的糖鏈衍生物通過將其脂溶性基除去，可以人工容易地且大量地獲得各種的糖鏈。脂溶性基的除去可以使用現(xiàn)有公知的方法。例如，2-羧基苯基氨基的除去通過在醋酸中與過氧化氫在室溫進(jìn)行反應(yīng)而達(dá)到，可以容易地作為游離型糖鏈回收。另夕卜，F(xiàn)moc基的除去通過在N，N-二曱基甲酰胺中、糖鏈衍生物中加入嗎啉進(jìn)行反應(yīng)來達(dá)到，為了除去B0C基，通過與弱酸反應(yīng)來達(dá)到。糖鏈?zhǔn)翘擎滄I合天冬酰胺的場合，通過與無水肼反應(yīng)后乙?；姆椒ǎ趬A性水溶液中加熱回流后乙?；姆椒ǖ?，可以除去天冬酰胺殘基。該糖鏈類，在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中非常有用，可舉出例如癌的疫苗合成，將得到的糖鏈類組合利用化學(xué)反應(yīng)或糖轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)等鍵合新的糖殘基而衍生物化，可以開發(fā)新的疫苗。本發(fā)明人等通過本發(fā)明的結(jié)構(gòu)解析方法以及制造方法，成功地分離出在各種癌細(xì)胞中迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)的下述式(1)~(6)表示的糖鏈。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>這些新的糖鏈認(rèn)為是在癌細(xì)胞中特異表達(dá)的物質(zhì)，將這些糖鏈作為癌標(biāo)記物可以利用。例如，制作與這些癌細(xì)胞中的特異的糖鏈特異識(shí)別的多克隆抗體或者單克隆抗體，利用免疫學(xué)的手法進(jìn)行檢測該糖鏈而達(dá)到。多克隆抗體可以將該糖鏈或者該糖鏈的半抗原與蛋白質(zhì)等的高分子化合物(載體)鍵合的鍵合體作為抗原，對(duì)小鼠、倉鼠、豚鼠、雞、大鼠、兔子、狗、山羊、綿羊、牛等的哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫致敏，從該哺乳動(dòng)物采集血液，可以調(diào)制含有多克隆抗體的抗血清。單克隆抗體例如通過調(diào)制從由抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞林的細(xì)胞融合獲得的雜交瘤得到。培養(yǎng)這樣得到的雜交瘤，精制產(chǎn)生的單克隆抗體即可。附圖的簡單說明圖l表示實(shí)施例l獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譖圖。圖2表示實(shí)施例2獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譜圖。圖3表示實(shí)施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖4表示實(shí)施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖5表示實(shí)施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖6表示實(shí)施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色語圖。圖7表示實(shí)施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖8表示實(shí)施例4獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譜圖。圖9表示實(shí)施例5獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色謙圖。圖IO表示實(shí)施例6獲得的糖鏈衍生物的親合柱色鐠圖。圖ll表示實(shí)施例7獲得的糖鏈衍生物的親合柱色諳圖。圖12表示實(shí)施例7獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。具體實(shí)施例方式以下表示參考例以及實(shí)施例，本發(fā)明并不受到下述實(shí)施例的限定。實(shí)施例1利用5-羥色胺親合色謙分離來自人血清[1-酸性糖蛋白質(zhì)(AGP)]的糖鏈將來自人血清的AGP(*夕*7TV"卜'y'7f-々^y制)lmg溶解在20mM磷酸緩沖溶液(pH7.5)50^1中，加入N-glycanaseF(2單位，4^1)，在37。C反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)后在IOOX:煮沸3分鐘，回收離心分離后的上清。在回收的上清中加入分別使2-氨基苯甲酸(2-AA)和氰基硼氫化鈉為3%地溶解在2%硼酸、4%醋酸鈉混液(500|n1)中的溶液10Oji1，在80X:反應(yīng)1小時(shí)。把反應(yīng)混合物用50%甲醇水溶液平衡化的SephadexLH-20柱(0.7cmi.d.，30cm)進(jìn)行分級(jí)，采用分光光度計(jì)(日立制、F-4010型)，利用激發(fā)波長335nm、熒光波長410nm測定各級(jí)分，把最初洗脫出的熒旋光性級(jí)分回收，作為糖鏈衍生物的混合物。把得到的混合物供給5-羥色胺親合柱色i普柱，得到分離的糖鏈衍生物。采用親合柱色語法的分離結(jié)果如圖1所示。5-羥色胺親合柱色鐠法的條件柱LA-Serotonin柱(4.6xl50mm，JapanOilmills制)泵JASCOPU-980型流速0-5ml/min檢測器JASCOFP-920型熒光檢測器激發(fā)波長350nm熒光波長425nm流動(dòng)相溶液A釆用超純水、溶液B釆用40mM醋酸銨水溶液。梯度條件試料注入后，2分鐘為溶液B5%，37分鐘后醋酸銨濃度30mM,進(jìn)行線性梯度洗脫，其后10分鐘醋酸銨濃度40mM的進(jìn)行。予以說明，5-羥色胺親合色鐠的分離條件在以下的實(shí)施例也相同。實(shí)施例2(人癌細(xì)胞由來糖鏈利用5-羥色胺親合色諉的分離)細(xì)胞培養(yǎng)采用人腎上腺癌細(xì)胞ACHN、人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞MKN45以及人組織血細(xì)胞性淋巴瘤U937。通過ACHN以及A549預(yù)先在50^C加熱30分鐘，將非滅活的含有牛血清[NEWBORNCALFSERUM(NCS)、，>夕*7卜''J、7f夕弋戸7制]10%的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium、夕/r7》卜*卩，7f'〉'弋Z》制)，U937以及MKN45采用含有10o/oNCS的RPMI-1640(,〉夕*^7^卜*!i'7f';弋^7制)，在5%(:02存在下，在37C在組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。除去了U937的細(xì)胞在80%鋪滿狀態(tài)下，將培養(yǎng)中的細(xì)胞用等張化磷酸緩沖液(PBS)洗滌后，加入胰蛋白酶溶液，在37"C處理5分鐘后，回收剝離的細(xì)胞，用PBS洗滌后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞膜級(jí)分的調(diào)制為了調(diào)制細(xì)胞膜級(jí)分，采用80%鋪滿狀態(tài)的細(xì)胞，利用刮削器(scraper),從培養(yǎng)器回收?；厥盏募?xì)胞用PBS洗滌后，在含有1%的蛋白酶抑制劑的10mMNa2HP04(pH7.5)中使用玻璃勻漿機(jī)勻漿后，使?jié)舛葹?x1()8cell/5ml，加入含有0.5M的蔗糖的20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)10ml,在4t:、3000rpm15分鐘離心分離后回收上清，然后，在4t:、19000rpm離心分離，將得到的沉淀作為細(xì)胞膜級(jí)分。從細(xì)胞膜級(jí)分游離糖鏈在細(xì)胞膜級(jí)分(1x107cell)中加入1%SDS溶液4(^1，加入2-巰基乙醇，使其為1%后，在ioox:的沸騰水浴上加熱5分鐘，由此進(jìn)行可溶化。將含有膜級(jí)分的溶液冷卻到室溫，加入NP-40，使其為1%，加入磷酸緩沖液(pH7.5)，使終濃度為20mM。進(jìn)一步，加入N-glycanaseF4^1(2單元、Rochediagnostics制)，在37^C下培養(yǎng)一晚，在IOOX:的沸騰水浴上煮沸5分鐘，加入95%乙醇，使其終濃度為75%，然后在41C、15000rpm下離心分離，將上清減壓千固，作為細(xì)胞膜由來的糖鏈。在調(diào)制完的各細(xì)胞膜由來的糖鏈中與上述實(shí)施例1相同地導(dǎo)入2-AA后，用5-羥色胺親合柱色鐠法處理，得到各糖鏈衍生物級(jí)分。釆用柱色鐠的分離結(jié)果表示在圖2中。實(shí)施例3(采用正相型酰氨基柱分離癌細(xì)胞由來的糖鏈以及結(jié)構(gòu)解析)把實(shí)施例2得到的各級(jí)分的癌細(xì)胞由來的糖鏈衍生物(相當(dāng)lx107cell)溶解在20mM醋酸緩沖液(pH5.0)20^1中，加入唾液酸酶4^1(2mU,7A《；/y《4才制)，在37C反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后在IOOX:煮沸3分鐘，回收離心分離后的上清。將得到的上清供給釆用酰氨基柱的正相HPLC，分取出糖鏈衍生物。用HPLC分離結(jié)果表示在圖3~7中。HPLC條件柱TSK-GELAmide-80(TOSOHCORPORATION,Japan;4.6x250mm)柱溫度40匸泵JASC0PU-980型流速lml/min檢測器JASCOFP-920型熒光檢測器激發(fā)波長350nm熒光波長425nm流動(dòng)相溶液A采用含有0.2%醋酸的乙腈溶液，溶液B采用含有0.1%醋酸以及0.1%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入后2分鐘間溶液B為30%，60分后溶液B為65%，進(jìn)行線性梯度洗脫。利用糖水解酶和質(zhì)諉分析法的結(jié)構(gòu)解析將U937由來的峰31的糖鏈衍生物溶解在20mM檸檬酸緩沖液(pH3.5)20jil中，加入P-半乳糖普酶25mU、生化學(xué)工業(yè)社制)，在37。C反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后在IOOTC沸煮3分鐘，回收離心分離后的上清。將得到的上清供給采用酰氨基柱的正相HPLC，將得到的級(jí)分的一部分利用MALDI-TOFMS分析。結(jié)果，得到分子量2718的糖鏈衍生物("將該糖鏈衍生物(a)溶解在20mM檸檬酸緩沖液(pH5.0)20|iil中，加入p-N-乙酰己糖胺酶(acetylhexaminidase)lpl(10mU,生化學(xué)工業(yè)社制)，在37C反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后在IOOX:沸煮3分鐘，回收離心分離后的上清，將得到的上清與上述相同地分析，結(jié)果，得到分子量1906的糖鏈衍生物(b)。進(jìn)一步，將糖鏈衍生物(b)用P-半乳糖苷酶處理，結(jié)果，得到分子量1582的糖鏈衍生物(c)。根據(jù)以上的結(jié)果，判斷出峰31為下述式表示的糖鏈衍生物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>相同地，峰35的糖鏈衍生物也用P-半乳糖苷酶、P-N-乙酰己糖胺酶、然后用P-半乳糖普酶，判斷出是下述式表示的糖鏈衍生物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>對(duì)于其它的峰的衍生物，也適當(dāng)采用水解酶，進(jìn)行MALDI-TOFMS分析等，將相當(dāng)于圖3~7所示的峰的糖鏈結(jié)構(gòu)表示在表1~5中。予以說明，表1~14中的分子量表示在糖鏈還原末端結(jié)合2-氨基苯曱酸的狀態(tài)下的分子量(MW)，記號(hào)表示以下的物質(zhì)。Gal:D-半乳糖、GlcNAc:N-乙酰己糖胺、Man:D-甘露醇、Fuc:巖藻糖、2-AA:2-氨基苯甲酸、NeuAc:唾液酸。這里，在糖鏈還原末端結(jié)合了2-氨基苯甲酸的糖鏈，例如，下式表示的糖鏈部分結(jié)構(gòu)表示成-4GlcMcPl-4GlcNAc-2-AA。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>MALDI-TOFMS分析裝置釆用VoyagerDE-PR0(PEBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)，通過線性/陰離子模式，在加速電壓20kV、柵極電壓96.3%、停滯時(shí)間(Delaytime)1000nsec、透鏡偏移量(LensOffset)1.25、激光強(qiáng)度(氮激光)2700下測定?；旌纤腥芙獾臉悠?.5jiL和2，5-二羥基苯曱酸(DHB)的20mg/mL甲醇溶液0.5pL，干燥后，作為測定用試樣使用。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例4(細(xì)胞內(nèi)存在的游離糖鏈1)將人胃癌細(xì)胞MKN45用PBS洗滌后，使?jié)舛葹?x108cell/5ml，采用玻璃勻漿機(jī)在含有1%的蛋白酶抑制劑的10mMNa2HP04(pH7.5)中勻漿后，加入含有0.5M蔗糖的20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)10ml，在4X:、3000rpm下離心分離15分鐘后，收集上清，進(jìn)一步在4匸、19000rpm離心分離，將其上清減壓干固，得到游離型糖鏈混合物。在得到的游離型糖鏈混合物中，與實(shí)施例l記載的方法相同地導(dǎo)入2-AA,得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用5-羥色胺親合柱色謙法分級(jí)，得到游離型糖鏈衍生物。利用親合柱色鐠法的分離結(jié)果表示于圖8。將得到的各級(jí)分通過釆用氨基柱的正相HPLC分離，得到游離型糖鏈矛汴生物。HPLC條件柱AsahiShodexNH2P-504E(ShowaDenko，Tokyo,Japan;4.6x250mm)柱溫度50匸泵JASC0PU-980型流速1ml/min檢測器JASCOFP-920型焚光檢測器激發(fā)波長350nm熒光波長425nm流動(dòng)相溶液A釆用含有2%醋酸的乙腈溶液，溶液B采用含有5%醋酸以及3%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入后，2分鐘溶液B為30。/。，80分后溶液B為95%，進(jìn)行線性梯度洗脫，直到100分鐘，將溶液B保持為95。/0。將得到的游離型糖鏈衍生物適當(dāng)與糖水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖苷酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙酰己糖胺酶等)作用，通過釆用上述氨基柱的正相HPLC分離后，將得到的級(jí)分冷凍干燥后，通過MALDI-TOFMS分析，對(duì)游離型糖鏈衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。予以說明，用ot-甘露糖苷酶的處理通過下述進(jìn)行，即，把糖鏈衍生物溶解在20mM檸檬酸緩沖液(pH4.5)20^11,加入ot-甘露糖苷酶2^1(iomu，生化學(xué)工業(yè)社制)，在37x:反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)后在ioox:煮沸3分鐘，回收離心分離后的上清。用其它的糖水解酶的處理如前述實(shí)施例中的記載相同。得到的糖鏈衍生物表示于表6以及7中。表6以及7的游離型糖鏈?zhǔn)切碌幕衔?，例如No.1的分子量1321的糖鏈衍生物是下述式表示的。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例5(存在于細(xì)胞內(nèi)的游離糖鏈2)代替人胃癌細(xì)胞MKN45，采用人T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat27(導(dǎo)入糖鏈的細(xì)胞林)，除此以外，與實(shí)施例4相同地操作，得到游離型糖鏈混合物。在得到的游離型糖鏈混合物中與實(shí)施例1記載的方法相同地導(dǎo)入2-AA，得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用5-羥色胺親合柱色鐠法分級(jí)，得到游離型糖鏈衍生物。將得到的各級(jí)分通過使用酰氨基柱的正相HPLC分離，得到游離型糖鏈衍生物。HPLC條件柱TSK-GELAmide-80(TOSOHCORPORATION,Japan;4,6x250mm)柱溫度40^泵JASC0PU-980型流速lml/min檢測器JASC0FP-920型熒光檢測器激發(fā)波長350nm熒光波長425nm流動(dòng)相溶液A采用含有0.1%醋酸的乙腈溶液、溶液B釆用含有0.2%醋酸以及0.2%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入后2分鐘，溶液B為30%,60分后溶液B達(dá)到65%，進(jìn)行線性梯度洗脫。用HPLC分離結(jié)果表示在圖9中。將得到的游離型糖鏈衍生物，與實(shí)施例4相同地操作，對(duì)游離型糖鏈衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。得到的糖鏈衍生物表示于表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例6(人子宮頸部癌細(xì)胞的糖鏈)將人子宮頸部癌細(xì)胞HeLa預(yù)先在50匸加熱30分鐘，采用含有非滅活的NCS10。/。的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。在80°/。鋪滿狀態(tài)下，把培養(yǎng)中的細(xì)胞用PBS洗滌后，加入胰蛋白酶溶液，在37匸處理5分鐘后，回收剝離的細(xì)胞，用PBS洗滌后傳代培養(yǎng)，與實(shí)施例2記載的細(xì)胞膜級(jí)分的調(diào)制、從細(xì)胞膜級(jí)分游離糖鏈相同地進(jìn)行處理，得到細(xì)胞膜由來的糖鏈混合物，與上述實(shí)施例1相同地導(dǎo)入2-AA后，用5-羥色胺親合柱色i普法處理，得到各糖鏈衍生物級(jí)分。采用柱色鐠的分離結(jié)果表示在圖10中。將得到的無唾液酸基糖鏈衍生物級(jí)分、單唾液酸糖鏈衍生物級(jí)分以及二唾液酸糖鏈衍生物級(jí)分用唾液酸酶處理后，用采用氨基柱的正相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。HPLC條件與實(shí)施例4相同。將得到的糖鏈衍生物適當(dāng)?shù)嘏c糖水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖苷酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙酰己糖胺酶等)作用，用釆用上述氨基柱的正相HPLC分離后，將得到的級(jí)分冷凍干燥后，用MALDI-TOFMS分析，解析糖鏈衍生物的結(jié)構(gòu)。得到的糖鏈衍生物表示在表9~12中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表10單唾液酸糖鏈衍生物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表12二唾液酸糖鏈衍生物-2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例7(癌細(xì)胞特異性抗原CD98的糖鏈)利用免疫沉降法調(diào)制CD98-HC把蛋白質(zhì)A-瓊脂糖50^1(少夕'T7Vk卜'??；少f'〉'*川》制)用PBS20(V1洗滌后，加入PBS50jli1以及10jng/l(Vl的抗CD98抗體，在室溫反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)后，用PBSlml除去非吸附成分，得到抗CD98抗體固定化瓊脂糖，抗CD98抗體固定化瓊脂糖中，加入通過l%NP-40(400jtl)溶化的HeLa細(xì)胞的膜級(jí)分(2x107cell),采用旋轉(zhuǎn)搖床，在4。C培養(yǎng)一晚。然后，用PBSlml洗滌，除去非吸附成分，離心分離后，在抗CD98抗體固定化瓊脂糖中加入解離溶液(250mMTris-HCl緩沖液pH6.8/4.6%SDS，20%丙三醇)和2-巰基乙醇的9:1混液20^1，煮沸5分鐘，在15000rpm下離心的上清作為CD98-HC，供給SDS-PAGE。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳裝置以及電源都使用BioRad制的。泳動(dòng)凝膠釆用7.5%凝膠。作為泳動(dòng)緩沖液，使用25mMTris，198mM甘氨酸，1%(w/v)SDS進(jìn)行。最初的1小時(shí)每1枚凝膠在5mA，然后在10mA下進(jìn)行泳動(dòng)，直到凝膠下邊部分?？捡R斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)染色SDS-Page結(jié)束后，用40%(v/v)甲醇，10%(v/v)醋酸/0.2%CoomassieBrilliantBlueR250中進(jìn)行蛋白質(zhì)的染色。1小時(shí)后，采用甲醇醋酸水(=4:1:5)脫色。蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)將SDS-PAGE后的凝膠用BIO-RAD制半干式印跡裝置(transblotSDcell)，將凝膠中的蛋白質(zhì)試樣轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜采用預(yù)先浸漬在曱醇中60秒，然后浸漬在48mMTris，39mM甘氨酸，20%曱醇(pH9.0)中1小時(shí)的膜，用100mA定電流失加1小時(shí)電壓，進(jìn)行轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后，將PVDF膜用含有5%脫脂乳以及0.05。/。Tween20的PBS掩蔽操作后，加入含有抗CD98抗體5jig的0.05%Tween20/PBS(5ml)，反應(yīng)一晚。反應(yīng)后，將PVDF膜用含有0.05%Tween20的PBS(20ml)洗滌4回后，加入含有HRP標(biāo)記的蛋白質(zhì)A5jnl的0.05%Tween20/PBS(5ml)，反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，將PVDF膜用含有0.05%Tween20的PBS(20ml)'冼滌4回，加入含有0.05%DAB(3,3'-Diaminobenzidrine,tetrahydrochloride)的lOOmMTris-HCl緩沖液pH7.5，0.0031%過氧化氫溶液20ml，使其發(fā)色。利用N-glycanaseF進(jìn)行凝膠內(nèi)消化利用CBB染色確認(rèn)條帶后，將脫色液置換為水，切出目的物的條帶，放入Eppendorf離心管中。然后，加入乙腈100^1，放置30分鐘，由此將凝膠脫水，除去乙腈后，加入含有2單位的N-glycanaseF的Tris-HCl緩沖液pH7.5100^1，在37'C培養(yǎng)一晚，切出糖鏈。然后，回收提取液，進(jìn)一步加入水20(^1,攪拌30分鐘，從凝膠得到糖鏈混合物。對(duì)以上那樣得到的糖鏈混合物，用和上述實(shí)施例1相同地導(dǎo)入2-AA后，利用5-羥色胺親合柱色鐠法處理，得到各糖鏈衍生物級(jí)分。采用柱色譜的分離結(jié)果表示在圖11中。將得到的單唾液酸糖鏈衍生物級(jí)分以及二唾液酸糖鏈衍生物級(jí)分用唾液酸酶處理后，用采用氨基柱的正相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。HPLC條件與實(shí)施例4相同。用HPLC的分離結(jié)果表示在圖12中。得到的糖鏈衍生物適當(dāng)?shù)嘏c糖鏈水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖普酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙酰己糖胺酶等)作用，用采用上述氨基柱的正相HPLC分離后，將得到的級(jí)分冷凍干燥后，用MALDI-TOFMS分析，由此解析糖鏈衍生物的結(jié)構(gòu)。得到的糖鏈衍生物表示在表1314中。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明的方法，可以詳細(xì)地對(duì)特別是細(xì)胞或者組織中的糖鏈混合物進(jìn)行分離，可以綜合地解析該糖鏈結(jié)構(gòu)，由此可以尋求現(xiàn)有未知的糖鏈以及其功能，在今后的糖鏈研究中可以期待大的貢獻(xiàn)。權(quán)利要求1.糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于，包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進(jìn)行處理的工序。2.權(quán)利要求1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具備(c)通過采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。3.權(quán)利要求2記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。4.權(quán)利要求1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，脂溶性基為2-羧基苯基氨基或者芴基曱氧基羰基。5.權(quán)利要求2記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，氨基柱是聚合物基質(zhì)的氨基柱。6.權(quán)利要求2記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，酰氨基柱是二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱。7.權(quán)利要求1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，糖鏈混合物是天然糖鏈的混合物。8.權(quán)利要求1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，糖鏈混合物是細(xì)胞由來的糖鏈的混合物。9.權(quán)利要求1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，糖鏈混合物是含有唾液酸糖鏈形成的糖鏈混合物。10.糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色鐠法進(jìn)行處理的工序、以及(e)用質(zhì)讒分析法進(jìn)行處理的工序。11.權(quán)利要求IO記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，在(b)工序之后，具備(C)利用釆用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。12.權(quán)利要求IO記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。13.權(quán)利要求IO記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，質(zhì)語分析法是利用MALDI-T0FMS的質(zhì)鐠分析法。14.式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物，(1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(6)式中r表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、"羧基苯基、對(duì)-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基，W表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3，在此，Asn表示天冬酰胺基，W表示氨基曱酸酯系或者酰胺系保護(hù)基，Ac表示乙?；?。15.由式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標(biāo)記物。全文摘要本發(fā)明涉及糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于，具備下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序，以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法處理的工序。文檔編號(hào)C08B37/00GK101223194SQ20068002617公開日2008年7月16日申請日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日發(fā)明者掛樋一晃,木下充弘,松野裕樹申請人:大塚化學(xué)株式會(huì)社