一種制備脂肪二酸衍生物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種制備脂肪二酸衍生物的方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪二酸衍生物在第三代胰島素藥物尤其是長效胰島素類似物的研究中發(fā)揮著 重要作用，甘精胰島素作為長效胰島素類似物的重鎊藥物在2014年全球銷售額達(dá)到72. 79 億美元。然而，甘精胰島素難以達(dá)到平穩(wěn)地控制血糖和穩(wěn)定的藥物動(dòng)力學(xué)曲線，直接導(dǎo)致低 血糖發(fā)生率尤其是夜間低血糖發(fā)生率偏高，危及生命。
[0003] 近年來作為甘精胰島素替代藥物的長效胰島素類似物的研究逐漸成為糖尿病 治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其中公開號為CN1829738、名稱為"新型胰島素衍生物"的中國發(fā)明 專利公開了脂肪二酸側(cè)鏈通過谷氨酸修飾的長效胰島素類似物一一德谷胰島素；公開 號為CN102065884、名稱為"聚乙二醇化的賴脯胰島素化合物"的中國發(fā)明專利公開了 分子量約20kDa的聚乙二醇綴合的胰島素類似物；公開號WO2011/122921的PCT申 請公開了與免疫球蛋白Fc片段通過PEG偶聯(lián)的胰島素綴合物。Thibaudeau和Bridon 公開了血清白蛋白偶聯(lián)的胰島素綴合物（Thibaudeau和Bridon等人，Bioconjugate chemistry，2005, 16, 1000-1008)，在文章中作者聲稱該綴合物可以成為潛在的長效胰島素 類似物候選藥。
[0004] 在諸多長效胰島素類似物研究中，德谷胰島素半衰期最長，體內(nèi)作用時(shí)間超過42 小時(shí)，同時(shí)低血糖風(fēng)險(xiǎn)尤其是夜間低血糖風(fēng)險(xiǎn)低，最有希望成為繼甘精胰島素之后的又一 重鎊藥物。德谷胰島素（Degludec，商品名為Tresiba)的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示，其分子結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)在于長鏈脂肪二酸通過一個(gè)谷氨酸分子連接在胰島素B29位賴氨酸殘基上。
[0005]
[0006] 長鏈脂肪二酸衍生物的制備及修飾反應(yīng)成為了胰島素類似物制備工藝中的重要 環(huán)節(jié)。在諾和諾德公司專利號CN1829738公開的十六烷二酸一叔丁酯制備工藝中采用了 N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛作為叔丁酯化試劑，成本高，不適合工業(yè)放大；十六烷二 酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯制備工藝中采用了 2-琥珀酰亞胺基-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼 酸酯（TSTU)，成本高，不適合工業(yè)化放大生產(chǎn)；同時(shí)該專利公開了十六烷二酸單甲酯衍生 物，由于該工藝制備的胰島素類似物需要在0.2MNaOH溶液中脫甲酯，容易引起胰島素肽 鏈的分解，雜質(zhì)較多，同樣難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化放大生產(chǎn)。Grinstaff和Zhang公開了 4-二甲氨 基吡啶（DMAP)催化二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)縮合十二烷二酸和叔丁醇，制備十二烷二酸一 叔丁酯的工藝（Grinstaff和Zhang等人，Bioconjugatechemistry, 2011，22 (4)，690-9)， 而用該工藝制備十六烷二酸一叔丁酯生成的副產(chǎn)物十六烷二酸N-?；灞壤?，難以和 產(chǎn)物分離，同樣不適合工藝放大生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種制備脂肪二酸衍生 物的方法。該方法操作簡便、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)含量低、中間體純化容易，收率高。所制備的脂 肪二酸衍生物可以通過蛋白修飾通用技術(shù)用于長效胰島素藥物如德谷胰島素的研發(fā)
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述制備脂肪二酸衍生物的方法的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種制備脂肪二酸衍生物的方法，包括如 下步驟：
[0010] (1)將如式A所示的長鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)，得到如式B所示的帶有兩個(gè)氯 基團(tuán)的酰氯；接著將酰氯與叔丁醇反應(yīng)，得到如式C所示的帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯；接著用羥 基取代氯基團(tuán)，得到如式D所示的長鏈脂肪二酸一叔丁酯；其中，下述反應(yīng)方程式中的m為 6~32的整數(shù)，優(yōu)選為6~9 ;
[0011]
[0012] (2)將長鏈脂肪二酸一叔丁酯和N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，得到如式E所示的長鏈 脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯；
[0013]
[0014] (3)將長鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯與L-谷氨酸-1-叔丁酯反應(yīng)，得到如 式F所示的叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu;
[0016] (4)將叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，得到如式 G所示的叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu;
[0018] (5)將叔丁基長鏈脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除，得到如式H所 示的長鏈脂肪二酸衍生物。
[0019]
[0020] 步驟（1)中所述的二氯亞砜的用量為過量，即二氯亞砜和長鏈脂肪二酸的摩爾比 大于2;優(yōu)選為6~23. 6:1。
[0021] 步驟（1)中所述的叔丁醇的用量按叔丁醇與長鏈脂肪二酸摩爾比為0. 6~1. 5 : 1 ;優(yōu)選為1~1. 2 :1計(jì)算；更優(yōu)選為按I. 1 :1計(jì)算。
[0022] 步驟（1)中所述的用羥基取代氯基團(tuán)是通過將所述的帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯與溶 劑A水溶液中的水反應(yīng)；溶劑A為N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、乙腈、丙酮和四氫呋喃中一種 或至少兩種，優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺。
[0023] 所述的溶劑A水溶液中溶劑A與水的體積比為I: 1~5,優(yōu)選為1 :2~3,更優(yōu)選 為 1 :2〇
[0024] 步驟（2)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的用量按其與所述的長鏈脂肪二酸一叔丁 酯摩爾比為1~1. 2 :1計(jì)算，優(yōu)選為按1. 05 :1計(jì)算。
[0025] 步驟（3)中所述的L-谷氨酸-1-叔丁酯的用量按其與所述的長鏈脂肪二酸琥珀 酰亞胺基叔丁基酯摩爾比為1~1. 5 :1計(jì)算，優(yōu)選為按1~1. 2 :1計(jì)算，更優(yōu)選為按I. 1 : 1計(jì)算。
[0026] 步驟（4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的用量按其與所述的叔丁基長鏈脂肪二酰 基-L-Glu-OtBu摩爾比為1~1. 2 :1計(jì)算，優(yōu)選為按I. 1 :1計(jì)算。
[0027] 步驟（5)中所述的將叔丁基長鏈脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除 是通過將所述的叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu與三氟乙酸反應(yīng)。
[0028] 所述的三氟乙酸的用量按其與所述的叔丁基長鏈脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu 體積質(zhì)量比為3~IOmL :Ig計(jì)算；優(yōu)選為按3~5mL :Ig計(jì)算；更優(yōu)選為按5mL :Ig計(jì) 算。
[0029] 為了降低整個(gè)反應(yīng)過程的雜質(zhì)，增加產(chǎn)物的得率和提高產(chǎn)物的純度，在每得到一 個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將未參與反應(yīng)的物質(zhì)去除。
[0030] 從而，所述的制備脂肪二酸衍生物的方法，優(yōu)選包括如下步驟：
[0031] 1)將長鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)制備得到酰氯，二氯亞砜的用量為過量，減壓 蒸餾除去未參與反應(yīng)的二氯亞砜，加入二氯甲烷溶解酰氯；將有機(jī)堿滴加入酰氯和叔丁醇 的混合物，反應(yīng)生成帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯，減壓蒸餾除去溶劑后，加入預(yù)冷至〇~4°C的溶 劑A水溶液，過濾收集沉淀；將沉淀中的溶劑去除，再往沉淀中加入溶劑B提取，蒸干溶劑后 重結(jié)晶，得到長鏈脂肪二酸一叔丁酯；
[0032]2)將長鏈脂肪二酸一叔丁酯溶解于溶劑C中，降溫至-20°C~-KTC，加入N-羥基 琥珀酰亞胺（HOSu)和二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)，-20°C~-10°C下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，恢復(fù)至 15~30°C繼續(xù)反應(yīng)3~16小時(shí)，過濾除去沉淀，減壓蒸餾除去溶劑，重結(jié)晶，用溶劑D洗濾 餅，得到長鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯；
[0033] 3)將長鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯與L-谷氨酸-1-叔丁酯溶解在N，N-二 甲基甲酰胺中，在有機(jī)堿存在的條件下過夜攪拌，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙 酯，并依次用鹽酸溶液、水和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥過濾，將濾液減壓蒸餾， 得到的油狀殘余物，為叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu;
[0034] 4)將叔丁基長鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu溶解于溶劑E中，降溫 至-20 °C~-10 °C，加入N-羥基琥珀酰亞胺（HOSu)和環(huán)己基碳二亞胺（DCC)， 于-20°C~-KTC下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，恢復(fù)至15~30°C反應(yīng)3~16小時(shí)，過濾除去沉淀，減 壓蒸餾除去溶劑，向殘留油狀物中直接加入溶劑F析出固體，過濾收集沉淀，得到叔丁基長 鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu;
[0035] 5)將叔丁基長鏈脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu溶解于三氟乙酸中，15~30°C攪 拌反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入溶劑G直接析出固體，抽濾收集固體，得到長鏈脂肪二酸衍生物。
[0036] 上述反應(yīng)中所用的溶劑A-G是用于溶解或提純用的，其用量和使用次數(shù)是不限 的。但從成本和達(dá)到的效果考慮，在下面分別限定了溶劑A-G的用量。
[0037] 步驟1)中所述的將長鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)制備得到酰氯的條件為80°C加 熱回流3小時(shí)或在DMF催化下于15~30°C反應(yīng)過夜。
[0038] 所述的在DMF催化下于15~30°C反應(yīng)過夜的操作優(yōu)選如下：將長鏈脂肪二酸重 懸于二氯甲烷中，接著加入DMF和二氯亞砜，于15~30°C反應(yīng)過夜。
[0039] 步驟1)中所述的有機(jī)堿為一乙胺、二乙胺、三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶和哌啶中 的一種或至少兩種；優(yōu)選為吡啶。
[0040] 步驟1)中所述的有機(jī)堿的摩爾用量相當(dāng)于所述的長鏈脂肪二酸摩爾量的0. 6~ 1. 5倍；優(yōu)選為L0~L2倍；更優(yōu)選為L04~L05倍。
[0041] 步驟1)中所述的有機(jī)堿的加入時(shí)間控制在2小時(shí)以內(nèi)，否則反應(yīng)過程中會出現(xiàn)較 多雜質(zhì)，給后續(xù)純化帶來困難。
[0042]步驟1)中所述將有機(jī)堿滴加入酰氯和叔丁醇的混合物的操作條件如下：反應(yīng)溫 度為20~30°C，優(yōu)選20~25°C;反應(yīng)時(shí)間為2~16小時(shí)，優(yōu)選2