專利名稱：糖鏈天冬酰胺衍生物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物素化糖鏈天冬酰胺、異硫氰酸熒光素(FITC)化糖鏈天冬酰胺、它們的制造方法及其用途。
背景技術(shù)：
近年來，作為繼核酸(DNA)、蛋白質(zhì)之后的第三個(gè)鏈狀生命分子，糖鏈分子引人注目。人體是由約60兆個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的一大細(xì)胞社會(huì)，所有的細(xì)胞表面都被糖鏈分子覆蓋。例如，ABO式血型就是由細(xì)胞表面糖鏈的不同決定的。
糖鏈具有參與細(xì)胞間識(shí)別和相互作用的功能，成為構(gòu)成細(xì)胞社會(huì)的要素。細(xì)胞社會(huì)的紊亂與癌、慢性疾病、感染病、老化等有關(guān)。
例如，已知細(xì)胞如果癌化，就會(huì)引起糖鏈的結(jié)構(gòu)變化。另外也知道霍亂弧菌或流感病毒等通過識(shí)別、結(jié)合某一特定糖鏈，侵入、感染細(xì)胞。
糖鏈由于單糖的序列、結(jié)合樣式以及部位、鏈長度以及分支樣式、整體的高次結(jié)構(gòu)等的多樣性，所以與核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相比，是非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。因此，來自其結(jié)構(gòu)的生物學(xué)信息與核酸和蛋白質(zhì)相比，多種多樣?，F(xiàn)狀是雖然人們認(rèn)識(shí)到糖鏈研究的重要性，但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多樣性，與核酸和蛋白質(zhì)相比，研究進(jìn)展緩慢。
象上述那樣，通過闡明某一特定的糖鏈與蛋白質(zhì)是否具有識(shí)別、結(jié)合能力，預(yù)期會(huì)帶動(dòng)依據(jù)新的原理的醫(yī)藥品和食品的開發(fā)等，對(duì)疾病的予防、治療有貢獻(xiàn)等廣泛的應(yīng)用。
因此，利用生物素·抗生物素蛋白的結(jié)合特異性，僅通過使生物素化的許多糖鏈在被抗生物素蛋白化的微型板上反應(yīng)就可以簡(jiǎn)單地制造糖鏈微芯片(マイクロチツプ)。通過該微芯片可以闡明具有與特定糖鏈結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。
另外，以對(duì)某一特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化為目的，可以通過將特定的生物素化的糖鏈結(jié)合、固定于抗生物素蛋白化的親和柱，使含有與生物素化的糖鏈具有特異結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的混合物通過上述柱子，可以只分離目的蛋白質(zhì)。
此外，F(xiàn)ITC化的糖鏈天冬酰胺通過毛細(xì)管電泳法等即使是微量也可以進(jìn)行分離。另外也可以從FITC化糖鏈天冬酰胺將FITC除去，分離糖鏈天冬酰胺本身。
本發(fā)明的課題在于提供對(duì)天冬酰胺的氨基氮進(jìn)行了生物素化或FITC化的糖鏈天冬酰胺、它的制造方法及其用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到以下發(fā)明。
1.下述式(1)所示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺衍生物。
[式中、R1和R2是氫原子、式(2)～(6)表示的基團(tuán)，可以相同，也可以不同。Q表示生物素基或FITC基。]
2.糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，在天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺的非還原末端側(cè)的N-乙酰葡糖胺上至少含有一個(gè)以上的巖藻糖。
3.生物素化糖鏈天冬酰胺的制造方法，其特征在于對(duì)式(9)所示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺進(jìn)行生物素化。
[式中，R1和R2如上所述。]4.FITC化糖鏈天冬酰胺的制造方法，其特征在于對(duì)式(9)所示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)化。
5.使上述上述生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的微型板(マイクロプレ-ト)。
6.使上述生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的親和柱。
本發(fā)明人在先前申請(qǐng)的特原2001-185685號(hào)(以下稱為在先申請(qǐng))中開發(fā)了與以往相比可以非常容易而且大量地獲得各種分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺、糖鏈的制造方法，以及結(jié)合了任意缺失糖殘基的糖鏈的新的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺、糖鏈。
該先前申請(qǐng)的方法，涉及例如(1)包括以下工序的來自糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法(a)將脂溶性保護(hù)基導(dǎo)入到在含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中所含有的該糖鏈天冬酰胺中，獲得糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序，以及(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將得到的混合物供給色譜，對(duì)各糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行分離的工序。
(2)上述(1)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其還包括(b’)用糖水解酶對(duì)工序(b)中分離的糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行水解的工序。
(3)上述(1)或(2)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在該化合物中缺失1個(gè)以上糖殘基的化合物的混合物。
(4)上述(1)～(3)任一項(xiàng)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性保護(hù)基是芴甲氧羰(Fmoc)基。
(5)上述(1)～(3)任一項(xiàng)所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，工序(a)是向含有在非還原末端帶有唾液酸殘基的1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中所含的該糖鏈天冬酰胺導(dǎo)入Fmoc基，并且向唾液酸殘基導(dǎo)入芐基從而得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序。
(6)包括以下工序的糖鏈天冬酰胺的制造方法(a)將脂溶性保護(hù)基導(dǎo)入到含有1種或2種以上的糖鏈天冬酰胺的混合物所含的該糖鏈天冬酰胺中，獲得糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序，(b)將該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物或該糖鏈天冬酰胺衍生物混合物含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解后得到的混合物供給色譜，對(duì)各糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行分離的工序，以及(c)除去工序(b)中分離的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護(hù)基，得到糖鏈天冬酰胺的工序。
(7)上述(6)所述的糖鏈天冬酰胺的制造方法，其還包括(b’)用糖水解酶對(duì)在工序(b)中分離的糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行水解的工序，和/或(c’)用糖水解酶對(duì)在工序(c)中得到的糖鏈天冬酰胺進(jìn)行水解的工序。
(8)上述(6)或(7)所述的糖鏈天冬酰胺的制造方法，其中，含有1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在該化合物中缺失1個(gè)以上糖殘基的化合物的混合物。
(9)上述(6)～(8)任一項(xiàng)所述的糖鏈天冬酰胺的制造方法，其中，脂溶性保護(hù)基是Fmoc基。
(10)上述(6)～(8)任一項(xiàng)所述的糖鏈天冬酰胺的制造方法，其中，工序(a)是向含有在非還原末端帶有唾液酸殘基的1種或2種以上糖鏈天冬酰胺的混合物中所含的該糖鏈天冬酰胺中導(dǎo)入Fmoc基，并且向唾液酸殘基導(dǎo)入芐基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序。
有關(guān)這些糖鏈天冬酰胺衍生物以及糖鏈天冬酰胺的制造的詳細(xì)描述由于在上述先前申請(qǐng)中已敘述，所以引用該申請(qǐng)。如果講到若干先前申請(qǐng)的內(nèi)容，先前申請(qǐng)的糖鏈天冬酰胺衍生物制造方法的一大特征是例如向從來自天然糖蛋白質(zhì)的糖鏈天冬酰胺、優(yōu)選是天冬酰胺結(jié)合型糖鏈得到的糖鏈天冬酰胺的混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺中導(dǎo)入(結(jié)合)脂溶性保護(hù)基，得到糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物，然后將該混合物分離為各糖鏈天冬酰胺衍生物。在本說明書中，所謂“糖鏈天冬酰胺”指的是結(jié)合了天冬酰胺狀態(tài)的糖鏈。而所謂“天冬酰胺結(jié)合型糖鏈”指的是存在于還原末端的N-乙酰葡糖胺通過N-糖苷鍵與蛋白質(zhì)多肽中天冬酰胺(Asn)的酸氨基連接的糖鏈組，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作為母核的糖鏈組。所謂“糖鏈天冬酰胺衍生物”指的是在天冬酰胺殘基上結(jié)合了脂溶性保護(hù)基狀態(tài)的糖鏈天冬酰胺。此外，在化合物的結(jié)構(gòu)式中，「AcHN」表示乙酰胺基。
如上所述，來自天然糖蛋白質(zhì)的糖鏈?zhǔn)请S機(jī)缺失了非還原末端的糖殘基的糖鏈混合物。本發(fā)明人意外地還發(fā)現(xiàn)了通過向來自天然糖蛋白質(zhì)的糖鏈、具體來說是糖鏈天冬酰胺混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺導(dǎo)入脂溶性保護(hù)基，利用眾所周知的色譜法，可以容易地將導(dǎo)入了該保護(hù)基的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物分離為各個(gè)糖鏈天冬酰胺衍生物。通過這樣操作可以分別大量制備具有各種結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，以往分離困難的類似結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物之間的分離變?yōu)榭赡?，可以容易而且大量地分別制備這些化合物。另外，以得到的糖鏈天冬酰胺衍生物作為起始原料，例如通過使糖水解酶依次作用而除去糖殘基，也可以進(jìn)一步合成各種各樣的糖鏈天冬酰胺衍生物。
因此，通過向糖鏈天冬酰胺中導(dǎo)入脂溶性保護(hù)基進(jìn)行衍生化，各個(gè)糖鏈天冬酰胺衍生物的分離成為可能，認(rèn)為這是由于通過導(dǎo)入脂溶性保護(hù)基，糖鏈天冬酰胺衍生物整體的脂溶性提高，例如，與適合使用的反相系柱的相互作用顯著提高，其結(jié)果可更敏銳地反映糖鏈結(jié)構(gòu)的差別，能夠分離各個(gè)糖鏈天冬酰胺衍生物的緣故。
另外按照先前申請(qǐng)，通過除去得到的糖鏈天冬酰胺衍生物的保護(hù)基，可以人工地、容易而且大量地獲得各種糖鏈天冬酰胺。
上述先前申請(qǐng)中得到的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺以及糖鏈無論哪一個(gè)都是α2，6結(jié)合體。
此外，上述先前申請(qǐng)中得到的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺以及糖鏈無論哪一個(gè)都是沒有結(jié)合巖藻糖的糖鏈天冬酰胺衍生物。
以下就α2，3結(jié)合體和α2，6結(jié)合體的差異進(jìn)行說明。
所謂α2，3結(jié)合體和α2，6結(jié)合體，是表示唾液酸與半乳糖之間的結(jié)合形式。前者指的是唾液酸的2位碳與半乳糖的3位碳進(jìn)行α結(jié)合，后者指的是唾液酸的2位碳與半乳糖的6位碳進(jìn)行α結(jié)合。兩者的區(qū)別是與半乳糖結(jié)合的碳不同。
在本發(fā)明的方法中，首先，通過用唾液酸轉(zhuǎn)移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物轉(zhuǎn)移到作為起始化合物的用脂溶性保護(hù)基保護(hù)的糖鏈天冬酰胺(9糖-Asn-Fmoc)上，將得到的用脂溶性保護(hù)基保護(hù)的糖鏈天冬酰胺供給色譜進(jìn)行分離，可以得到用脂溶性保護(hù)基保護(hù)的雙唾液酸基糖鏈天冬酰胺衍生物以及2種單唾液酸基糖鏈天冬酰胺衍生物。
然后，通過對(duì)得到的雙唾液酸基糖鏈天冬酰胺衍生物和2種單唾液酸基糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行糖水解，可以得到含有唾液酸或唾液酸衍生物的9～7糖鏈天冬酰胺衍生物。
另外，以上述得到的11～7糖鏈天冬酰胺衍生物或雙唾液酸糖鏈天冬酰胺(α2，6-11糖-Asn-Fmoc)作為起始原料，通過進(jìn)行糖水解可得到10～6糖鏈天冬酰胺衍生物，通過用糖轉(zhuǎn)移酶向10～6糖鏈天冬酰胺衍生物轉(zhuǎn)移巖藻糖，可以得到含有巖藻糖的13～7糖鏈天冬酰胺衍生物。
作為該保護(hù)基沒有特別限定，可以使用例如Fmoc基、叔丁氧羰(Boc)基、芐基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙?；忍妓狨ハ祷蝓０废档谋Ｗo(hù)基等。從將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物直接用于所期望的糖肽的合成的觀點(diǎn)出發(fā)，作為該保護(hù)基，優(yōu)選Fmoc基或Boc基等，更優(yōu)選Fmoc基。Fmoc基當(dāng)糖鏈中存在在唾液酸等比較酸性的條件下不穩(wěn)定的糖時(shí)特別有效。另外保護(hù)基的導(dǎo)入可以按照眾所周知的方法(例如參照Protecting groups in Organic Chemistry，John Wiley &Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)進(jìn)行。
例如，使用Fmoc基時(shí)，通過向糖鏈天冬酰胺中加適量丙酮后，再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺碳酸酯和碳酸氫鈉進(jìn)行溶解，于25℃下進(jìn)行Fmoc基向天冬酰胺殘基的結(jié)合反應(yīng)，可以向該糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基導(dǎo)入Fmoc基。
通過以上操作可以獲得導(dǎo)入了脂溶性保護(hù)基的糖鏈天冬酰胺衍生物。
作為唾液酸，可以使用一般市售的唾液酸或化學(xué)合成的唾液酸。
作為唾液酸的衍生物，可以使用一般市售的唾液酸的衍生物或化學(xué)合成的唾液酸衍生物。具體來說，可以列舉與唾液酸的7位、8位或9位的碳結(jié)合的羥基用氫原子或鹵素原子取代后的化合物。作為鹵素原子，可以列舉氟、氯、溴等，優(yōu)選氟。
作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶，一般可以使用市售的、來自天然的、通過基因重組生產(chǎn)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，可以根據(jù)要轉(zhuǎn)移的唾液酸或唾液酸衍生物的種類適當(dāng)選擇。具體來說，，可以列舉作為α2，3轉(zhuǎn)移酶來自RatRecombinant的酶、作為α2，6轉(zhuǎn)移酶來自Rat Liver的酶。另外使用唾液酸酶，通過pH調(diào)整等使平衡錯(cuò)開，也可以使唾液酸或唾液酸的衍生物轉(zhuǎn)移。
上述糖鏈天冬酰胺衍生物的采用色譜的分離可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^單獨(dú)或多個(gè)組合使用眾所周知的色譜進(jìn)行。
例如，將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物用凝膠過濾柱色譜純化后，再用HPLC純化。作為可以在HPLC中使用的柱子，反相系的柱合適，例如，可以使用ODS、Phenyl系、腈系、陰離子交換系柱，具體來說，可以利用例如Pharmacia公司生產(chǎn)的モノQ柱、Iatron公司生產(chǎn)的Iatro-beads column等。分離條件等可以參照眾所周知的條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。通過以上操作可以由糖鏈天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各糖鏈天冬酰胺衍生物。
然后通過對(duì)上面分離得到的糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行水解，可以高效地獲得含有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。例如在分離糖鏈天冬酰胺衍生物階段，對(duì)混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物的種類進(jìn)行限制，對(duì)糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行粗略解離，然后進(jìn)行水解，例如通過使用糖水解酶進(jìn)行水解，可以高效地獲得含有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。水解可以如上述那樣進(jìn)行。從更高效地獲得含有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選糖殘基的切斷方式使用明確的糖水解酶進(jìn)行水解。
例如，半乳糖殘基的去除可以通過將水解的化合物溶于緩沖液(例如磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、グツド緩沖液等)，根據(jù)眾所周知的條件，使用半乳糖水解酶進(jìn)行半乳糖殘基的切除反應(yīng)可以完成。被水解的化合物無論是分別分離的化合物，還是混合物都可以。在該反應(yīng)中使用的半乳糖水解酶優(yōu)選利用市售的眾所周知的外切(エキソ)型的酶。此外，只要是具有同樣活性的酶，無論是新分離的酶，還是基因工學(xué)上創(chuàng)造的酶都可以。然后與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基被切斷的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供給色譜，可以獲得各糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選使用HPLC(ODS柱、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進(jìn)行。
N-乙酰葡糖胺殘基的去除通過將水解的化合物溶于緩沖液(例如磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、グツド緩沖液等)，根據(jù)眾所周知的條件，使用N-乙酰葡糖胺水解酶進(jìn)行N-乙酰葡糖胺殘基的切除反應(yīng)可以完成。也可以使用N-乙酰氨基己糖苷酶水解酶。被水解的化合物無論是分別分離的化合物，還是混合物都可以。在該反應(yīng)中使用的各個(gè)酶優(yōu)選利用市售的外切型的酶。此外，只要是具有同樣活性的酶，無論是新分離的酶，還是基因工學(xué)上創(chuàng)造的酶都可以。然后與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基被切斷的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供給色譜，可以獲得各糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選使用HPLC(ODS柱、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35，或50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進(jìn)行。
甘露糖殘基的去除通過將水解的化合物溶于緩沖液(例如磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、グツド緩沖液等)，根據(jù)眾所周知的條件，使用甘露糖水解酶進(jìn)行甘露糖殘基的切除反應(yīng)可以完成。被水解的化合物無論是分別分離的化合物，還是混合物都可以。在該反應(yīng)中使用的甘露糖水解酶優(yōu)選利用市售的外切型的酶。此外，只要是具有同樣活性的酶，無論是新分離的酶，還是基因工學(xué)上創(chuàng)造的酶都可以。然后與上述同樣，將反應(yīng)后得到的反應(yīng)液(糖殘基被切斷的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物)供給色譜，可以獲得各糖鏈天冬酰胺衍生物。例如，分離優(yōu)選使用HPLC(ODS柱、洗脫溶劑可將10～200mM左右的醋酸銨等的緩沖溶液與乙腈、或乙醇、或甲醇、或丁醇、或丙醇等具有脂溶性的水溶性有機(jī)溶劑適當(dāng)混合后使用，作為洗脫溶劑，優(yōu)選為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18)進(jìn)行。
得到如上述那樣操作得到的各糖鏈天冬酰胺衍生物后，通過使巖藻糖轉(zhuǎn)移，可以制造天冬酰胺的氨基氮被本發(fā)明的脂溶性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的糖鏈天冬酰胺的非還原末端側(cè)的N-乙酰葡糖胺上至少含有一個(gè)以上巖藻糖的新的糖鏈天冬酰胺衍生物。
作為巖藻糖，可以使用一般市售的巖藻糖或化學(xué)合成的巖藻糖。
作為巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，可以使用一般市售的、來自天然的、或通過基因重組生產(chǎn)的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，可以根據(jù)被轉(zhuǎn)移的巖藻糖的種類適當(dāng)選擇。具體來說，可以列舉作為使巖藻糖轉(zhuǎn)移到糖鏈天冬酰胺的非還原末端側(cè)的N-乙酰葡糖胺上的酶的Fucosyltransferase V(Human、Recombinant、來自血漿、來自血清、來自乳汁、來自肝臟)等。另外，使用巖藻糖水解酶，通過調(diào)整pH等錯(cuò)開平衡，也可以轉(zhuǎn)移巖藻糖。
上述糖鏈天冬酰胺衍生物的采用色譜的分離可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^單獨(dú)或多個(gè)組合使用眾所周知的色譜進(jìn)行。
例如，將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物用凝膠過濾柱色譜純化后，再用HPLC純化。作為可以在HPLC中使用的柱子，反相系的柱合適，例如，可以使用ODS、Phenyl系、腈系、陰離子交換系柱，具體來說，可以利用例如Pharmacia公司生產(chǎn)的モノQ柱、Iatron公司生產(chǎn)的Iatro-beads column等。分離條件等可以參照眾所周知的條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。通過以上操作可以由糖鏈天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各糖鏈天冬酰胺衍生物。
通過上述操作得到各糖鏈天冬酰胺衍生物后，再通過使用各種糖水解酶等對(duì)該衍生物進(jìn)行水解，除去糖鏈的非還原末端的糖殘基，作為各個(gè)單一化合物可以得到糖鏈的末端的分支結(jié)構(gòu)不均一的各種各樣的糖鏈天冬酰胺衍生物。此外，通過使用各種糖水解酶，改變水解的順序或其種類，可以制造更多種類的糖鏈天冬酰胺衍生物。
根據(jù)以往的方法，要獲得分析級(jí)的具有極限的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物需要更龐大的時(shí)間和花費(fèi)，但通過本發(fā)明不需要特別的裝置和試劑，只是使用慣用的凝膠過濾柱、HPLC柱、至少3種糖水解酶(例如，半乳糖水解酶、甘露糖水解酶、N-乙酰葡糖胺水解酶)等，用2周時(shí)間左右就可以制造1克左右含有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。
在本發(fā)明中使用上述先前申請(qǐng)得到的各種糖鏈天冬酰胺、上述先前申請(qǐng)沒有敘述的α2，3結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺、以及(α2，3)(α2，6)結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺、以及這些的巖藻糖結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺，可以得到目的生物素化或FITC化的糖鏈天冬酰胺衍生物。
本發(fā)明涉及對(duì)糖鏈天冬酰胺的氨基氮進(jìn)行生物素化或FITC化的糖鏈天冬酰胺。
作為本發(fā)明的生物素化糖鏈天冬酰胺，例如，可列舉下式表示的化合物。
[式中、R1和R2是氫原子、或式(2)～(6)表示的基團(tuán)，可以相同，也可以不同。]作為本發(fā)明的FITC化糖鏈天冬酰胺，例如可以列舉下式表示的化合物。
〔式中、R1和R2與上述相同?！沉硗?，本發(fā)明涉及對(duì)糖鏈天冬酰胺的氨基氮進(jìn)行生物素化或FITC化的生物素化或FITC化糖鏈天冬酰胺的制造方法。
作為本發(fā)明的生物素化或FITC化糖鏈天冬酰胺的制造方法，例如，可以通過對(duì)上述表示的各種分離的糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺的氨基氮進(jìn)行生物素化或FITC化而獲得。
作為本發(fā)明中使用的糖鏈天冬酰胺，例如，可列舉式(7)表示的化合物。
(式中、R1和R2與上述同樣。)作為具體的糖鏈天冬酰胺，可列舉先前申請(qǐng)所述的化合物。即，可以同樣使用先前申請(qǐng)的第3～4圖所示的α2，6化合物，標(biāo)識(shí)的這些化合物表示在本發(fā)明的表1～3中。
另外，作為用于合成上述糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺衍生物，也可列舉先前申請(qǐng)所述的α2，6化合物。即，可以同樣使用先前申請(qǐng)的第1～2圖所示的化合物，標(biāo)識(shí)的這些化合物表示在本發(fā)明的表4～6中。
另外除了上述先前申請(qǐng)所述的糖鏈天冬酰胺以外，也可以使用α2，3結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺、以及(α2，3)(α2，6)結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺、還有這些的巖藻糖結(jié)合體的糖鏈天冬酰胺。
作為本發(fā)明的生物素化，可以根據(jù)眾所周知的方法進(jìn)行。例如、將糖鏈天冬酰胺溶于水，加碳酸氫鈉，然后加入溶有D-(+)-生物素基琥珀酰亞胺的二甲基甲酰胺，于室溫下反應(yīng)20分，用凝膠過濾柱等進(jìn)行純化，可以得到生物素化糖鏈天冬酰胺。
本發(fā)明的使生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的微型板通過使生物素化的糖鏈天冬酰胺與市售的抗生物素蛋白化的微型板(例如、Pierce公司制)反應(yīng)可以制造。
而本發(fā)明的使生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的親和柱通過使生物素化的糖鏈天冬酰胺與市售的抗生物素蛋白化的親和柱反應(yīng)可以制造。
作為本發(fā)明的FITC化，可以按照眾所周知的方法進(jìn)行。例如，將糖鏈天冬酰胺溶于水，加丙酮、碳酸氫鈉，然后再加異硫氰酸熒光素，于室溫下反應(yīng)2小時(shí)，用凝膠過濾柱等進(jìn)行純化，可以得到FITC化糖鏈天冬酰胺。
本發(fā)明中得到的FITC化糖鏈天冬酰胺對(duì)于例如活體組織中的糖類的受體的研究、植物凝集素的糖結(jié)合特異性的研究是有用的。
具體實(shí)施例方式
以下舉出實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。1H-NMR的數(shù)據(jù)對(duì)于實(shí)施例1～7以及參考例45，是以30℃下HOD作為4.8ppm，對(duì)于參考例1～44是在30℃下作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，以丙酮的甲基信號(hào)作為2.225ppm、HOD作為4.718ppm進(jìn)行測(cè)定得到的值。此外，有關(guān)除去Fmoc基的化合物，是在測(cè)定溶劑中使50mM的碳酸氫銨共存測(cè)定的。
參考例1 雙唾液酸基糖鏈天冬酰胺(化合物24)的合成使來自卵的粗純化的SGP(唾液酸糖肽，sialylglycopeptide)2.6g溶解于100ml的Tris-HCl·氯化鈣緩沖液(TRIZMA BASE0.05mol/l、氯化鈣0.01mol/l、pH＝7.5)。然后向該溶液中加入疊氮化鈉58mg(772μmol)和526mg肌動(dòng)蛋白酶(アクチナ-ゼ)-E(科研制藥公司生產(chǎn))，于37℃下靜置。65小時(shí)后，再加入263mg肌動(dòng)蛋白酶-E，再于37℃下靜置24小時(shí)。將該溶液冷凍干燥后，將殘留物通過凝膠過濾柱色譜(Sephadex G-25、2.5φ×1m、洗脫溶劑為水，流速為1.0ml/min·)純化2次，得到1.3g(555μmol)化合物24。
得到的化合物24的物理的數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，dd，Asn-βCH)，3.00(1H，dd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)
參考例2 化合物1、2、6和10的合成使參考例1得到的化合物24(609mg，261μmol)溶解于20.7ml的水中，再加入0.1當(dāng)量鹽酸13.8ml。將該溶液于70℃下加熱35分鐘后，迅速進(jìn)行冰冷，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，調(diào)到pH7。對(duì)該溶液進(jìn)行冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(Sephadex G-25、2.5φ×1m、洗脫溶劑為水、流速為1.0ml/min·)進(jìn)行純化，得到化合物24、化合物25和29、化合物33的混合物534mg。這4種成分不分別進(jìn)行分離直接進(jìn)行下面的工序。
得到的糖鏈混合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)5.13(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H1)，5.01(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.47(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)使得到的糖鏈的混合物429mg溶解于16.3ml丙酮和11.2ml水中。向該混合液中加入9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(155.7mg，461.7μmol)和碳酸氫鈉(80.4mg，957μmol)，于室溫下攪拌2小時(shí)。將該溶液供給蒸發(fā)器除去丙酮，將剩余溶液用凝膠過濾柱色譜(SephadexG-25、2.5φ×1m、洗脫溶劑為水、流速為1.0ml/min)進(jìn)行純化，得到化合物1、化合物2和6、化合物10的混合物309mg。將該混合物使用HPLC(ODS柱、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35、2.0φ×25cm、流速3ml/min)進(jìn)行純化，51分鐘后化合物1洗脫下來，67分鐘后化合物2和6的混合物被洗脫下來，93分鐘后化合物10被洗脫下來。對(duì)各個(gè)級(jí)分分別收集，并進(jìn)行冷凍干燥后，通過用凝膠過濾柱色譜(Sephadex G-25、2.5φ×30cm、洗脫溶劑為水、流速為1.0ml/min)進(jìn)行脫鹽，可以得到目的化合物2和6的混合物150mg。
得到的化合物1的物理的數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcd for C103H154N8NaO66[M+Na+]2581.8838，found，2581.8821 上述糖鏈結(jié)構(gòu)中的符號(hào)表示如下。其中NeuAc唾液酸GalD-半乳糖GlcNAcN-乙酰葡糖胺ManD-甘露糖Asn天冬酰胺
此外，得到的化合物2和6的混合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(d，F(xiàn)moc)，7.79(d，F(xiàn)moc)，7.55(m，F(xiàn)moc)，5.14(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H)，5.00(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.46(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)此外得到的化合物10的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.12(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.93(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)；HRMS Calcd for C81H120N6NaO50[M+Na+]1999.6930，found，1999.6939參考例3 化合物3和7的合成將參考例2得到的化合物2和6的混合物(224mg、97μmol)和牛血清清蛋白24mg溶解于22ml的HEPES緩沖液(50mM，pH6.0)中，再加入來自Diplococcus pneumoniae的β-半乳糖苷酶(1.35U)。將該溶液于37℃下靜置15小時(shí)后，進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝85∶15，流速為3ml/min)純化，在129分鐘后洗脫下化合物3，在134分鐘后洗脫下化合物7。分別收集，進(jìn)行冷凍干燥。然后通過HPLC[ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑最初15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后按照水∶乙腈(容量比)＝10∶0到85∶15，31分鐘后至45分鐘后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20進(jìn)行梯度洗脫，流速為3ml/min]進(jìn)行脫鹽處理，得到81mg目的化合物3、75mg目的化合物7。
得到的化合物3的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C86H127N7NaO53[M+Na+]2128.7356，found，2128.7363此外，得到的化合物7的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.60(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7-H3ax)；HRMS Calcd for C86H125N7Na3O53[M+Na+]2172.6995，found，2172.7084參考例4 化合物4和8的合成將參考例3得到的化合物3和7的混合物(90mg、47.3μmol)不進(jìn)行分離，直接與牛血清清蛋白8mg溶解于8.1ml的HEPES緩沖液(50mM，pH6.0)中，再加入2.88U來自牛腎臟的β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自牛腎臟)。將該溶液于37℃下靜置18小時(shí)后，進(jìn)行冷凍干燥，將殘留物通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶甲醇＝65∶35，流速為3ml/min)純化，在117分鐘后洗脫下化合物4，在127分鐘后洗脫下化合物8。分別收集，進(jìn)行冷凍干燥。繼續(xù)使用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑最初15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分鐘后至45分鐘后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20進(jìn)行梯度洗脫，流速為3ml/min)進(jìn)行脫鹽處理，得到40mg目的化合物4，37mg目的化合物8。
得到的化合物4的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.22(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.94(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.55(1H，d，Gal6-H1)，4.33(1H，dd，Man3-H2)，4.20(1H，dd，Man4-H2)，4.15(1H，dd，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6539此外得到的化合物8的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)7.99(2H，d，F(xiàn)moc)，7.79(2H，d，F(xiàn)moc)，7.55(4H，m，F(xiàn)moc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6533參考例5 化合物5的合成將參考例4得到的化合物4(30mg、473μmol)和牛血清清蛋白3mg溶解于6ml的HEPES緩沖液(50mM，pH6.0)中，再加入10U的來自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。將該溶液于37℃下靜置21小時(shí)后，進(jìn)行冷凍干燥，接著用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑最初15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分鐘后至45分鐘后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20進(jìn)行梯度洗脫，流速為3ml/min)進(jìn)行純化，得到20mg的目的化合物5。
得到的化合物5的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.00(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.56(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.44(1H，d，Gal6-H1)，4.11(1H，dd，Man4’-H2)，4.07(1H，dd，Man3-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’ -H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M+Na+]1763.6034，found，1763.6074參考例6 化合物9的合成將參考例4得到的化合物8(40mg、630μmol)和牛血清清蛋白5g溶解于7.8ml的HEPES緩沖液(50mM，pH6.0)中，再加入38U的來自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。將該溶液于37℃下靜置63小時(shí)后，進(jìn)行冷凍干燥，接著用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑最初15分鐘為水，16分鐘后至30分鐘后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分鐘后至45分鐘后為85∶15到80∶20，進(jìn)行梯度洗脫，流速為3ml/min)進(jìn)行純化，得到30mg的目的化合物9。
得到的化合物9的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(D2O，30℃)8.01(2H，d，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，F(xiàn)moc)，7.56(4H，m，F(xiàn)moc)，5.23(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.32(1H，dd，Man3-H2)，4.28(1H，dd，Man4-H2)，2.81(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.59(1H，bdd，Asn-βCH)，2.13(12H，s×4，-Ac)，1.80(1H，dd，NeuAc7H3ax)；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M+Na+]1763.6034，found，1763.6041參考例7 Fmoc基的脫保護(hù)(化合物33的合成)使參考例2得到的化合物10(10.5mg，5.27μmol)溶解于50％嗎啉/N，N-二甲基甲酰胺溶液1.4ml中，于室溫、氬氣氛下反應(yīng)2小時(shí)。向該溶液加入3ml甲苯，于35℃下用蒸發(fā)器進(jìn)行蒸發(fā)。重復(fù)進(jìn)行三次該操作，除去反應(yīng)溶劑。將殘留物通過凝膠過濾柱色譜(SephadexG-25、2.5φ×30cm、洗脫溶劑為水、流速為1.0ml/min·)進(jìn)行純化，得到7mg目的化合物33(收率為76％)。另外，得到的化合物的結(jié)構(gòu)由從參考例2得到的化合物33與1H-NMR譜圖一致進(jìn)行確認(rèn)。
化合物33的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.8Hz，GlcNAc5，5’-H-1)，4.47(d，2H，J＝7.9Hz，Gal6，6’-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4’-H-2)，4.12(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.93(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.08(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)參考例8 化合物14的合成將化合物3(28mg、21.3μmol)和牛血清清蛋白1.0mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，454μL)中，再加入神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，198mU)。將該溶液于37℃下靜置20小時(shí)后，通過HPLC分析，確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)液通過HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物14(17mg、收率70％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’ -H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcd for C75H110N6NaO45[M+Na+]1837.6402，found 1837.6471參考例9 化合物19的合成將化合物7(20mg、9.4μmol)和牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，323μL)中，再加入神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，141mU)。將該溶液于37℃下靜置18小時(shí)后，通過HPLC分析，確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。然后通過HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物19(13mg、收率76％)。得到的化合物的結(jié)構(gòu)由1H-NMR與標(biāo)準(zhǔn)品一致進(jìn)行確認(rèn)。
參考例10 化合物15的合成將化合物4(45mg、24μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，820μL)中，再加入神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，134mU)。將該溶液于37℃下靜置14小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著將反應(yīng)液通過HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物15(28mg、收率74％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6’-H-1)，4.35(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.11(bs，1H，Man4’-H-2)，4.07(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcdfor C67H97N5NaO40[M+Na+ 1634.5608，found，1634.5564參考例11 化合物70的合成將得到的化合物15(11mg，6.8μmol)和牛血清清蛋白1.5mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，269μL)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)、來自Jack Beans，11μL，275mU)。將該溶液于37℃下靜置14小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)溶液通過HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物70(6.3mg，收率64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.32(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，4.06(bs，1H，J＝1.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝14.0Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.5Hz，14.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.4參考例12 化合物20的合成將化合物8(47mg、25μmol)和牛血清清蛋白1.9mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，840μL)中，再加神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，369mU)。將該溶液于37℃下靜置37小時(shí)后，通過HPLC分析，確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將該反應(yīng)液冷凍干燥，然后通過HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物20(26mg、收率65％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(bd，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.5Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，3H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man4’-H-2)，4.19(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcd for C67H97N5NaO40[M+Na+]1634.5608，found，1634.5644參考例13 化合物71的合成將化合物20(12mg，7.4μmol)和牛血清清蛋白1.0mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，330μL)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)、來自Jack Beans，12μL，297mU)。將該溶液于37℃下靜置46小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)溶液通過HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物71(6.6mg，收率61％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.90(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5-H-1)，4.31(b，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.8Hz，3.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.0Hz，15.5Hz，Asn-ββCH)，2.06，2.05，1.88(each s，each3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3參考例14 化合物16的合成將化合物5(32mg、18.4μmol)和牛血清清蛋白2.5mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，713μL)中，再加入神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，134mU)。將該溶液于37℃下靜置17小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著將反應(yīng)液通過HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物16(13mg、收率52％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.00(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.10(bd，1H，Man3-H-2)，4.07(bs，1H，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3參考例15 化合物17的合成使化合物16(9mg，6.2μmol)與牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，613μL)，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)、來自Jack Beans，186mU)。將該溶液于37℃靜置32小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物17(5.4mg，收率68％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.89(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.68(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.09，4.07(s，1H，Man4’-H-2，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.56(bdd，1H，J＝8.1Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd forC55H77N5NaO30[M+Na+]1310.5，found，1310.2參考例16 化合物18的合成使化合物17(3.4mg，2.6μmol)和牛血清清蛋白1.1mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，257μL)，加入N-乙?；?β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich 來自Jack Beans，144mU)。將該溶液于37℃下靜置24小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm。最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物18(2.1mg，收率75％)。得到的化合物的物理的數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.00(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(d，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man 3-H-1)，4.58(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.07(d，1H，J＝2.7Hz，Man4’-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.7Hz，Man3-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.2Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.07，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C47H65N4O25[M+Na+]1085.4，found，1085.3參考例17 化合物21的合成將化合物9(28mg、16μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，624μL)中，再加入神經(jīng)氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Viblio Cholerae，117mU)。將該溶液于37℃下靜置17小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。然后將反應(yīng)液通過HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流過，然后使25％乙腈流過進(jìn)行洗脫)脫鹽，得到目的化合物21(14.6mg、收率68％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，2H，J＝7.2Hz，GlcNAc2-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.22(bd，1H，J＝2.7Hz，Man3-H-2)，4.19(b，1H，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.8Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3參考例18 化合物22的合成使化合物21(10mg，6.9μmol)與牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，672μL)，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)、來自Jack Beans，205mU)。將該溶液于37℃靜置20小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物22(5.6mg，收率64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.87(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.67(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.48(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.41(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.26(t，1H，F(xiàn)moc)，4.22(d，1H，J＝2.2Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.54(bdd，1H，J＝9.5Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C55H78N5O30[M+H+]1288.5，found，1288.3參考例19 化合物23的合成使化合物22(3.6mg，2.8μmol)和牛血清清蛋白1.2mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，277μL)，加入N-乙?；?β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich來自Jack Beans，195mU)。將該溶液于37℃下靜置24小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物23(2.3mg，收率77％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，1H，J＝6.5Hz，GlcNAc-H-1)，4.33(t，1H，F(xiàn)moc)，4.22(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.07(bdd，1H，J＝2.1Hz，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C47H65N4O25[M+H+]1085.4，found，1085.3參考例20 化合物11的合成使化合物10(123mg，62μmol)與牛血清清蛋白1.1mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，2.5mL)，加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)、來自Jack Beans，24μL，612mU)。將該溶液于37℃靜置61小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液進(jìn)行冷凍干燥，接著用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為3.5mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm。最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物11(71mg，收率70％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(1H，d，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.34(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，4.10(s，1H，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.51(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；HRMS Calcd for C69H100N6NaO40[M+Na+]1675.5873，found，1675.5841參考例21 化合物12的合成使化合物11(50mg，30μmol)和牛血清清蛋白2.0mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，920μL)，加入N-乙?；?β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich，來自Jack Beans，2.1U)。將該溶液于37℃下靜置48小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化，進(jìn)行冷凍干燥。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)對(duì)該殘留物進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物12(25mg，收率66％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(bd，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.58～4.52(b，1H，GlcNAc2-H-1)，4.33(t，1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(dd，1H，J＝1.6Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.53(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.88(each s，each 3H，Ac)，參考例22 化合物13的合成使化合物12(10mg，11μmol)和牛血清清蛋白0.9mg溶解于HEPES緩沖液(50mM，pH5.0，440μL)，加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司制造，來自Jack Beans，30μL，3.2U)。將該溶液于37℃下靜置21小時(shí)后，通過HPLC分析確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束。接著用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20、流速為4mL/min)進(jìn)行純化。再通過ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流過50mLH2O，然后流過25％乙腈，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到目的化合物13(3mg，收率43％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.57(1H，GlcNAc2-H-1)，4.06(d，1H，J＝3.2Hz，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.3Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)，(糖鏈天冬酰胺衍生物的Fmoc基的脫保護(hù))在所有的糖鏈天冬酰胺衍生物中，都按照以下順序進(jìn)行Fmoc基的脫保護(hù)。首先，對(duì)于每1μmol糖鏈天冬酰胺Fmoc體加入240μl的N，N-二甲基甲酰胺、160μl的嗎啉，于室溫下在氬氣氛下使其反應(yīng)。通過TLC(洗脫溶劑使用1M醋酸銨∶異丙醇＝8∶5)確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，于冰水中冷卻。然后加入相當(dāng)于反應(yīng)溶液10倍量的二乙醚，攪拌15分鐘后，對(duì)析出的沉淀物進(jìn)行過濾。使得到的殘?jiān)芙庥谒?，?5℃下進(jìn)行蒸發(fā)。反復(fù)進(jìn)行3次再加3ml甲苯、蒸發(fā)的操作。將殘留物通過反相柱色譜(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、洗脫溶劑為水)進(jìn)行純化。
參考例23 化合物33的合成使化合物10(10.5mg，5.3μmol)按照上述操作反應(yīng)7小時(shí)，得到目的化合物33(7mg，收率76％)。得到的化合物由于1H-NMR與標(biāo)準(zhǔn)品一致而確認(rèn)。
參考例24 化合物26的合成使化合物3(8.0mg，3.8μmol)按照上述操作反應(yīng)21小時(shí)，得到目的化合物26(6.3mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.56(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc5-H-1)，4.52(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.12(bs，1H，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.07，2.06，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C71H118N7O51[M+H+]1884.7，found，1884.5參考例25 化合物27的合成使化合物4(11.0mg，5.8μmol)按照上述操作反應(yīng)23小時(shí)，得到目的化合物27(8.5mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.08(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.45(d，1H，J＝7.6Hz，Gal6’-H-1)，4.26(bd，1H，Man3-H-2)，4.12(bd，1H，Man4’-H-2)，4.08(bdd，1H，J＝1.6Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.2Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.09，2.07，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)，；MS(Fab)，Calcd for C63H104N6NaO46[M+Na+]1703.6，found，1703.1參考例26 化合物28的合成使化合物5(7.0mg，4.0μmol)按照上述操作反應(yīng)21小時(shí)，得到目的化合物28(5.3mg，收率87％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.94(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.10，4.07(each1H，Man4’，3-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.6Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.06，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(2H，dd，J＝12.2Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)，Calcd for C57H94N6NaO41[M+Na+]1541.5，found，1541.3參考例27 化合物30的合成使化合物7(13.9mg，6.6μmol)按照上述操作反應(yīng)7小時(shí)，得到目的化合物30(8.0mg，收率64％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.60(each d，each 1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.2Hz，Man4’-H-2)，4.10(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.07，2.06，2.05，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd，1H，J＝12.4Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C71H117N7NaO51[M+Na+]1906.7，found，1906.1參考例28 化合物31的合成使化合物8(8.0mg，4.2μmol)按照上述操作反應(yīng)12小時(shí)，得到目的化合物31(6.0mg，收率86％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.43(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，Man4’-H-2)，2.91(bd，1H，J＝17.0Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06，2.06，2.02，2.00(each s，each 3H，Ac)，1.70(dd，1H，J＝12.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcd forC63H104N6NaO46[M+Na+]1703.6，found，1703.0參考例29 化合物32的合成使化合物9(7.7mg，4.4μmol)按照上述操作反應(yīng)23小時(shí)，得到目的化合物32(5.2mg，收率78％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.14(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4,60(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.23(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，2.9Hz，Man4-H-2)，2.92(dd，1H，J＝4.1Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.5Hz，12.7Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.03，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C57H94N6NaO41[M+Na+]1541.5，found，1541.2參考例30 化合物37的合成使化合物14(9.1mg，5.0μmol)按照上述操作反應(yīng)13小時(shí)，得到目的化合物37(6.5mg，收率77％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57，4.55(each d，each 1H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.3Hz，Gal6’-H-1)，4.23(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.87(dd，1H，J＝4.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝7.2Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C60H100N6NaO43[M+Na+]1615.6，found，1615.0參考例31 化合物42的合成使化合物19(9.8mg，5.4μmol)按照上述操作反應(yīng)13小時(shí)，得到目的化合物42(8.0mg，收率88％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.57，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.28(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4’-H-2)，4.10(s，1H，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.0Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.5Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C60H101N6O43[M+H+]1593.6，found，1593.8參考例32 化合物38的合成使化合物15(5.1mg，3.2μmol)按照上述操作反應(yīng)11小時(shí)，得到目的化合物38(4.0mg，收率91％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.24(d，1H，J＝2.3Hz，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bd，each 1H，Man4’，4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝7.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcdfor C52H88N5O38[M+H+]1390.5，found，1390.1參考例33 化合物72的合成使化合物70(4.0mg，2.8μmol)按照上述操作反應(yīng)13小時(shí)，得到目的化合物72(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.09(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bs，each 1H，Man4，4’-H-2)，2.87(dd，1H，J＝17.2Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝6.5Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3參考例34 化合物43的合成使化合物20(5.4mg，3.3μmol)按照上述操作反應(yīng)11小時(shí)，得到目的化合物43(4.1mg，收率87％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，Gal6-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C52H88N5O38[M+H+]1390.5，found，1390.2參考例35 化合物73的合成使化合物71(4.0mg，2.8μmol)按照上述操作反應(yīng)13小時(shí)，得到目的化合物73(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.54(each d，each 1H，J＝7.9Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，3.96(1H，dd，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3參考例36 化合物39的合成使化合物16(2.2mg，1.5μmol)按照上述操作反應(yīng)7小時(shí)，得到目的化合物39(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.58(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.09，4.08(each s，each 1H，Man3，4’-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.8Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.08，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H77N5NaO33[M+Na+]1250.4，found，1250.3參考例37 化合物40的合成使化合物17(1.5mg，1.2μmol)按照上述操作反應(yīng)14小時(shí)，得到目的化合物40(1.1mg，收率89％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.10，4.07(each s，each 1H，Man4’，3-H-2)，2.89(dd，1H，J＝3.7Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.79(dd，1H，J＝7.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C40H67N5NaO28[M+Na+]1088.4，found，1088.2參考例38 化合物41的合成使化合物18(1.3mg，1.2μmol)按照上述操作反應(yīng)14小時(shí)，得到目的化合物41(0.8mg，收率80％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.08(d，1H，J＝2.9Hz，Man3-H-2)，2.92(dd，1H，J＝3.9Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Ash-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C32H55N4O27[M+H+]863.3，found 863.2參考例39 化合物44的合成使化合物21(2.3mg，1.6μmol)按照上述操作反應(yīng)7小時(shí)，得到目的化合物44(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal-H-1)，4.22，4.18(each bs，each 1H，Man3，4-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.05，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcdfor C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3參考例40 化合物45的合成使化合物22(1.6mg，1.3μmol)按照上述操作反應(yīng)14小時(shí)，得到目的化合物45(1.1mg，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.5Hz，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.4Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.89(dd，1H，J＝4.3Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.78(dd，1H，J＝7.5Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C40H67N5NaO28[M+Na+]1088.4，found，1088.3參考例41 化合物46的合成將化合物23(1.6mg，1.5μmol)按照上述操作反應(yīng)14小時(shí)，得到目的化合物46(1.1mg，6.4μmol，收率85％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.3Hz，GlcNAc2-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.4Hz，Man3-H-2)，4.07(dd，1H，J＝1.6Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C32H55N4O23[M+H+]863.3，found 863.3參考例42 化合物34的合成使化合物11(12.4mg，7.5μmol)按照上述操作反應(yīng)11小時(shí)，得到目的化合物34(9.2mg，收率86％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝10.0Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝6.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc5，5’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.80(dd，1H，J＝3.8Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.63(dd，1H，J＝8.2Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd forC54H90N6NaO38[M+Na+]1453.5，found，1453.2參考例43 化合物35的合成使化合物12(12.0mg，8.4μmol)按照上述操作反應(yīng)11小時(shí)，得到目的化合物35(7.0mg，收率81％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(30℃)δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(bs，1H，Man4’-H-2)，3.97(bs，1H，Man4-H-2)，2.79(dd，1H，J＝5.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.61(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C38H65N4O28[M+H+]1025.4，found，1025.2參考例44 化合物36的合成使化合物13(8.4μmol)按照上述操作反應(yīng)11小時(shí)，得到目的化合物36。
參考例45 化合物76、77的合成及分離使化合物2和化合物6的混合物(5.0mg，2.2μmol)溶解于220μL的水中，加入100μL的22mM碳酸銫水溶液，調(diào)到pH7.0。將該溶液進(jìn)行冷凍干燥。向干燥后的固體物加入430μL的N，N-二甲基甲酰胺，再加入6.6μmo1的芐基溴/N，N-二甲基甲酰胺溶液20μL。將該溶液于氬氣氛下攪拌。48小時(shí)后，通過TLC(洗脫溶劑使用1M醋酸銨∶異丙醇＝1∶2)確認(rèn)原料消失后，加入4.4mL的二乙醚，使化合物沉淀。對(duì)沉淀的糖鏈進(jìn)行過濾，使殘留的糖鏈溶解于水，進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥后的殘留物通過分級(jí)HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝78∶22、流速4.0mL/min)純化時(shí)，在88分鐘后洗脫下化合物77，在91分鐘后洗脫下化合物76。分別收集，再經(jīng)ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初使50mL的H2O流過，然后使25％乙腈流過，進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽，得到化合物2的芐基體1.6mg、化合物6的芐基體1.8mg。
使化合物2的芐基體(10糖、13.6mg、5.8mmol)在冰冷條件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)1.4ml。一邊通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，一邊攪拌約8小時(shí)。在反應(yīng)進(jìn)行到終點(diǎn)時(shí)，用40mMHCl將反應(yīng)液調(diào)到pH＝7.0。將中和后的溶液用膜濾器過濾后，濃縮，然后通過HPLC(YMC-PackODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸銨緩沖液＝20/80，流速7.0mL/min.，波長274nm)進(jìn)行分級(jí)純化。分級(jí)的溶液濃縮后，再通過ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、NACALAI TESQUE公司生產(chǎn))進(jìn)行脫鹽處理，濃縮、冷凍干燥，得到化合物2的單一產(chǎn)品(6.2mg，47.4％)。
向得到的化合物2(4.0mg，1.76mmol)中加入DMSO282ml，使其溶解。然后向該反應(yīng)液加入嗎啉282ml，于室溫下進(jìn)行攪拌。一邊通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，一邊進(jìn)行約1小時(shí)反應(yīng)。確認(rèn)原料消失后、向反應(yīng)液中加丙酮/二異丙基醚(IPE)＝1/1的溶液5ml。將該漿料用膜濾器進(jìn)行過濾后，用純化水洗脫殘?jiān)⑺畬訚饪s后，用凝膠柱色譜(Sephadex G-25，H2O)進(jìn)行純化。收集含有目的物的級(jí)分，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到目的單唾液酸糖鏈天冬酰胺(化合物76)(3.3mg，收率91.5％)。
化合物76的NMR數(shù)據(jù)如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ5.22(s，1H，Man4-H1)，5.15(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)，4.65-4.75(m，3H)，4.54(dd，2H，Ja＝10.8，Jb＝7.6)，4.33(s，1H)，4.27(bd，1H，J＝2.4，Man4-H2)，4.19(bd，1H，J＝2.4)，2.95(dd，1H，Ja＝16.8，Jb＝4.4，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，Ja＝16.8，Jb＝7.2，Asn-βCH)2.74(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝4.4，NeuAc7-H3eq)，2.16，2.15，2.13，2.11，2.09(eachs，15H，Acx5)，1.83(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
使化合物6的芐基體(10糖、5.0mg、2.1mmol)在冰冷條件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)2.0ml。一邊通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，一邊攪拌約5小時(shí)。在反應(yīng)進(jìn)行到終點(diǎn)時(shí)，用40mM HCl將反應(yīng)液調(diào)到pH＝7.0。將中和后的溶液用膜濾器過濾后，濃縮，然后通過HPLC(YMC-PackODS-AM SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸銨緩沖液＝20/80，流速7.0mL/min.，波長274nm)進(jìn)行分級(jí)純化。分級(jí)的溶液濃縮后，再通過ODS柱(Cosmoseal 75C18-OPN、NACALAI TESQUE公司生產(chǎn))進(jìn)行脫鹽處理，濃縮、冷凍干燥，得到化合物6的單一產(chǎn)品(2.5mg，52.0％)。
向得到的化合物6(1.5mg，0.67mmol)中加DMSO105ml，使其溶解。然后向該反應(yīng)液加嗎啉105ml，于室溫下進(jìn)行攪拌。一邊通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，一邊進(jìn)行約1小時(shí)反應(yīng)。確認(rèn)原料消失后，向反應(yīng)液中加丙酮/二異丙基醚(IPE)＝1/1的溶液5ml。將該漿料用膜濾器進(jìn)行過濾后，用純化水洗脫殘?jiān)⑺畬訚饪s后，用凝膠柱色譜(SephadexG-25，H2O)進(jìn)行純化。收集含有目的物的級(jí)分，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物單唾液酸糖鏈天冬酰胺(化合物77)(1.4mg，收率99％)?；衔?7的NMR數(shù)據(jù)如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ5.20(s，1H，Man4-H1)，5.15(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)，4.63-4.73(m，3H)，4.53(dd，2H，Ja＝7.6，Jb＝7.2)，4.33(s，1H)，4.27(bd，1H，J＝2.4，Man4-H2)，4.19(d，1H，J＝2.0)，2.83(dd，1H，Ja＝16.0，Jb＝4.0，Asn-βCH)，2.75(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝4.8，NeuAc7-H3eq)2.62(dd，1H，Ja＝16.0 Jb＝8.0，Asn-βCH)，2.16，2.14，2.13，2.11，2.09(eachs，15H，Acx5)，1.79(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝11.6，NeuAc7-H3ax).
實(shí)施例1將參考例1得到的化合物24(6mg，2.58mmol)溶于水(300mL)，加入碳酸氫鈉(2.1mg，24.9mmol)。然后加入溶有D-(+)-生物素基琥珀酰亞胺(4.2mg，12.3mmol)的二甲基甲酰胺(300mL)，在室溫下反應(yīng)20分鐘。用TLC(異丙醇∶1M 醋酸銨水溶液＝3∶2)確認(rèn)原料消失后，用蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮。將殘?jiān)?jīng)凝膠過濾柱(f20mm×300mm，Sephadex G-25，水)純化，得到目的化合物(6.2mg，94％)。得到的化合物的物理數(shù)據(jù)如下。
1H-NMR(400mHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)d5.22(s，1H，Man4-H1)，5.14(d，1H，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.59(dd，1H)，4.86(s，1H，Man3-H1)，4.74-4.66(m，3H，，GlcNAc2，5，5’-H1)，4.53(d，2H，Gal6，6’-H1)，4.34(s，1H，Man3-H2)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.19(bs，1H，Man4’-H2)，3.09(dd，2H，NeuAc7，7’-H3eq)，2.94-2.86(m，2H，biotin)，2.78-2.71(m，2H，biotin)，2.37(t，1H，biotin)，2.17，2.16，2.13，2.11(each s，Ac)，1.80(dd，2H，NeuAc7，7’-H3ax)，1.80-1.67(m，biotin)，1.52-1.47(m，biotin)，1.32(dd，biotin)
實(shí)施例2除了使用參考例45得到的化合物76以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例3除了使用參考例45得到的化合物77以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例4除了使用參考例7得到的化合物33以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例5除了使用參考例24得到的化合物26以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例6除了使用參考例25得到的化合物27以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例7除了使用參考例26得到的化合物28以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例8除了使用參考例27得到的化合物30以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例9除了使用參考例28得到的化合物31以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例10除了使用參考例29得到的化合物32以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例11除了使用參考例30得到的化合物37以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。

實(shí)施例12除了使用參考例31得到的化合物42以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例13除了使用參考例32得到的化合物38以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例14除了使用參考例33得到的化合物72以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例15
除了使用參考例34得到的化合物43以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例16除了使用參考例35得到的化合物73以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例17除了使用參考例36得到的化合物39以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例18除了使用參考例37得到的化合物40以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例19除了使用參考例38得到的化合物41以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例20除了使用參考例39得到的化合物44以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例21除了使用參考例40得到的化合物45以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例22除了使用參考例41得到的化合物46以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例23除了使用參考例42得到的化合物34以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例24除了使用參考例43得到的化合物35以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例25除了使用參考例44得到的化合物36以外，其它與實(shí)施例1同樣，進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例26 天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的雙唾液酸基α2，3糖鏈天冬酰胺(C1-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的2種單唾液酸基α2，3糖鏈天冬酰胺(C1-2和C1-3)的合成使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移到參考例2得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的去唾液酸基糖鏈天冬酰胺上。
作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用來自市售的Rat Recombinant的α2，3轉(zhuǎn)移酶。
將參考例2得到的去唾液酸基9糖(20mg，10.1μmol)溶解于50mM二甲胂酸緩沖液(pH＝6.0，5ml)后，加入牛血清清蛋白(BSA，5mg)。然后向其加入CMP-唾液酸(26mg，40.4μmol)、堿性磷酸酶(5μl，125unit)，并進(jìn)行均一化。最后加入α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(CALBIOCHEM公司生產(chǎn)，100μl)，于37℃下靜置48小時(shí)。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，在原料減少到目的量時(shí)刻，使反應(yīng)終止，反應(yīng)液用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液濃縮，將溶液量減少后，通過HPLC分級(jí)柱(YMC-PackR&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm，AN/25mM醋酸銨緩沖液＝18/82，7.5mL/min.，波長274nm)進(jìn)行純化，25分鐘后，二唾液酸基11糖化合物(C1-1)被洗脫，30分鐘后、34分鐘后各單唾液酸基10糖化合物(C1-2)以及(C1-3)分別被洗脫下來。分別收集后，進(jìn)行脫鹽處理，然后進(jìn)行冷凍干燥，可以得到各化合物1、2、3分別為0.7mg(2.7％)、1.9mg(8.3％)、3.5mg(15.3％)。各化合物的NMR數(shù)據(jù)如下。
化合物(C1-1)1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，F(xiàn)moc)，7.69(d，2H，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m，4H)，4.34(1H，F(xiàn)moc)，4.24(bs，1H，Man3-H2)，4.18(bs，1H，Man4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，3H，Asn-βCH，NeuAc7，7’-H3eq)，2.40-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02(eachs，Ac)，1.77(dd，2H，NeuAc7，7’-H3ax).
化合物(C1-2)1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，F(xiàn)moc)，7.69(d，2H，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.47-4.60(m)，4.43(d，1H)，4.32(1H，F(xiàn)moc)，4.22(bs，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.06-4.13(m，2H)，2.72(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.50-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(each s，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax).
化合物(C1-3)1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，F(xiàn)moc)，7.69(d，2H，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.45(d，1H)，4.33(1H，F(xiàn)moc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.09(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02，2.00(each s，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax) 將得到的(C-1)～(C-3)各化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。

實(shí)施例27將實(shí)施例26得到的化合物(C1-2)(2mg、0.88μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于100μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)，來自Jack Beans，5μl，100mU)。將該溶液于37℃下靜置15小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，使用ODS-柱色譜(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C2)0.5μg。NMR數(shù)據(jù)如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.90(d，2H，F(xiàn)moc)，7.69(d，2H，F(xiàn)moc)，7.49(dd，2H，F(xiàn)moc)，7.42(dd，2H，F(xiàn)moc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.98(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.33(1H，F(xiàn)moc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(each s，Ac)，1.78(dd，1H，NeuAc7-H3ax) 將得到的(C2)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例28將實(shí)施例27得到的化合物(C2)(1.8mg、0.86μmol)和牛血清清蛋白1mg一起溶解于90μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入4μl(250mU)N-乙酰基-β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Jack Beans)。將該溶液于37℃下靜置24小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，通過ODS-柱色譜(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C3)0.9μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.80(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.87(s，1H)，4.60-4.78(m，5H)，4.40-4.50(bm，2H)，4.34(s，1H)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.20(dd，1H，Ja＝3.0，Jb＝9.9)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝11.9，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C3)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例29將實(shí)施例28得到的化合物(C3)(0.8mg、0.42μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Jack Beans)30μl(2.9U)。將該溶液于37℃下靜置63小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，使用ODS-柱色譜(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C4)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.79(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.59(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，4.60-4.75(m，)，4.40-4.50(m，2H)，4.32(bd，1H，J＝2.3)，4.28(bs，1H)，4.22(bdd，1H，Ja＝9.7，Jb＝2.8，Man4-H2)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.14，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C4)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例30將實(shí)施例26得到的化合物(C1-3)(1mg、0.44μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)，來自Jack Beans，5μl，100mU)。將該溶液于37℃下靜置15小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，通過ODS-柱色譜(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C5)0.3μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.81(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.53(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.55-4.70(m)，4.44(1H，F(xiàn)moc)，4.30-4.38(bm，2H)，4.28(bd，1H，Man4-H2)，4.17-4.25(m，2H)，2.78-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(eachs，12H，Acx4)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C5)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例31將實(shí)施例30得到的化合物(C5)(1.0mg、0.48μmol)和牛血清清蛋白1mg一起溶解于50μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入4μl(250mU)N-乙?；?β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Jack Beans)。將該溶液于37℃下靜置22小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝82∶18，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，通過ODS-柱色譜(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C6)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.80(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，5.19(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)4.58-4.75(m，5H)，4.38-4.48(m，2H，F(xiàn)moc)，4.40(bd，J＝2.4，1H)，4.18-4.25(m，2H)，4.15(m，1H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，9H，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C6)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例32將實(shí)施例31得到的化合物(C6)(1.0mg、0.53μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES緩沖液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司生產(chǎn)，來自Jack Beans)10μL(0.9U)。將該溶液于37℃下靜置20小時(shí)后，用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液通過HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脫溶劑為50mM醋酸銨水溶液∶乙腈＝80∶20，流速為7.5ml/min)純化后，對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。將殘留物溶解于200μl水中，通過ODS-柱色譜(コスモシ-ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)進(jìn)行脫鹽處理，得到目的化合物(C7)0.5μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.01(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.81(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，5.09(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.55-4.70(m，5H)，4.44(t，1H，J＝6.0，F(xiàn)moc)，4.30-4.38(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，4.17(s，1H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.3，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C7)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例33天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的雙唾液酸基(α2，6)(α2，3)糖鏈天冬酰胺的合成使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移到參考例45得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的單唾液酸基糖鏈天冬酰胺(化合物2)上。
作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用市售的來自Rat Recombinant的α2，3轉(zhuǎn)移酶。
將參考例45得到的化合物2(1.7mg，0.75μmol)溶解于50mM二甲胂酸緩沖液(pH＝5.0，85μl)后，加入牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后向其加入CMP-唾液酸(4.8mg，7.5μmol)、堿性磷酸酶(1μl，75unit)，并進(jìn)行均一化。最后加入α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(CALBIOCHEM公司生產(chǎn)，75μl，34mU)，于37℃下靜置3.5小時(shí)。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，在原料消失的時(shí)刻，使反應(yīng)終止，反應(yīng)液用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液濃縮，將溶液量減少后，通過HPLC分級(jí)柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸銨緩沖液＝18/82，7.5mL/min.，波長274nm)進(jìn)行純化。25分鐘后化合物(C7A)被洗脫下來。分別收集后，進(jìn)行脫鹽處理，然后進(jìn)行冷凍干燥，可以得到化合物(C7A)1.3mg(67.8％)?；衔锏腘MR數(shù)據(jù)如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.79(d，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，F(xiàn)moc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.86(s，1H)，4.58-4.72(m，5H)，4.54(d，1H，J＝8.0)，4.38-4.48(m，2H)4.34(bs，1H)，4.28(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(m，dd，3H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(each s，Ac x5)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax)，1.81(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C7A)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。

實(shí)施例34天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的雙唾液酸基(α2，3)(α2，6)糖鏈天冬酰胺的合成使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移到參考例45得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保護(hù)的單唾液酸基糖鏈天冬酰胺(化合物6)上。
作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶使用市售的來自Rat Recombinant的α2，3轉(zhuǎn)移酶。
將參考例45得到的化合物6(1.2mg，0.53μmol)溶解于50mM二甲胂酸緩沖液(pH＝5.0，60μl)后，加牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后加入CMP-唾液酸(3.4mg，5.3μmol)、堿性磷酸酶(1μl，75unit)，并進(jìn)行均一化。最后加入α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(CALBIOCHEM公司生產(chǎn)，52.9μl，24mU)，于37℃下靜置3小時(shí)。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，在原料全部消耗的時(shí)刻，使反應(yīng)終止，反應(yīng)液用膜濾器進(jìn)行過濾。將濾液濃縮，將溶液量減少后，通過HPLC分級(jí)柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸銨緩沖液＝18/82，7.5mL/min.，波長274nm)進(jìn)行純化，23分鐘后化合物(C7B)被洗脫下來。分別收集后，進(jìn)行脫鹽處理，然后進(jìn)行冷凍干燥，可以得到各化合物(C7B)1.1mg(81.2％)。各化合物的NMR數(shù)據(jù)如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ8.00(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.79(d，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.59(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，7.51(dd，2H，J＝7.6，F(xiàn)moc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.08(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.60-4.72(m，5H)，4.52(d，1H，J＝7.6)，4.35-4.45(m，2H)，4.33(bs，1H)，4.27(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(bs，dd，3H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.15，2.12，2.10(each s，Ac x5)，1.97(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax)，1.80(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax).
將得到的(C7B)的化合物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。
實(shí)施例35～52使參考例2、8～10、12、14、17、45、實(shí)施例26～32中制造的各Fmoc-糖鏈天冬酰胺2nmol溶解于約10ml的Tris-HCl緩沖液。向該溶液中加入GDP-巖藻糖200nmol、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶V(Human，Recombinant)0.5mU，于37℃下靜置約2小時(shí)，使其反應(yīng)。將反應(yīng)液用超純水20ml稀釋后，通過毛細(xì)管電泳(fused silica capillary，50mm i.d.，60cm，buffer；100mM Tris-borate，pH＝8.3，100mM Heptanesulfonate，外加電壓27kV，溫度25℃，214mm)進(jìn)行分離，得到含有巖藻糖的糖鏈天冬酰胺衍生物。將得到的上述糖鏈天冬酰胺衍生物與參考例7同樣進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例1同樣進(jìn)行生物素化。得到的生物素化糖鏈天冬酰胺如下所示。
實(shí)施例35

實(shí)施例36 實(shí)施例37
實(shí)施例38 實(shí)施例39 實(shí)施例40 實(shí)施例41 實(shí)施例42 實(shí)施例43
實(shí)施例44 實(shí)施例45
實(shí)施例46 實(shí)施例47 實(shí)施例48 實(shí)施例49
實(shí)施例50 實(shí)施例51 實(shí)施例52 實(shí)施例53使雙唾液酸糖鏈天冬酰胺(化合物24)(11糖、1.4mg、0.60mmol)溶解于70ml純水中。然后向該溶液中加丙酮70ml、NaHCO3(0.76mg，9mmol)，于室溫下攪拌后，加入異硫氰酸熒光素(FITC，0.95mg，2.4mmol，Aldrich公司生產(chǎn))，攪拌約2小時(shí)。2小時(shí)后，用TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，在減壓下經(jīng)蒸餾除去丙酮，將剩余水溶液加到凝膠柱色譜(Sephadex G-25、H2O)進(jìn)行純化，收集含有目的物的級(jí)分。將收集的級(jí)分濃縮后，經(jīng)HPLC(YMC-Pack ODS＝AM，SH-343-5AM，20×250mm，AN/25mM AcONH4緩沖液＝10/90，7.5ml/min.，波長；274nm)分級(jí)后，通過用凝膠柱色譜(Sephadex G-25、H2O)進(jìn)行脫鹽處理。收集含有目的物的級(jí)分，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物FITC化的雙唾液酸糖鏈衍生物(1.2mg，收率73.5％)。

1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.86(d，1H，J＝2.0，F(xiàn)ITC)，7.75(dd，1H，Ja＝8.0，Jb＝2.0，F(xiàn)ITC)，7.46(d，1H，J＝8.0，F(xiàn)ITC)，7.41(d，1H，J＝9.6，F(xiàn)ITC)，6.71-6.83(bm，4H，F(xiàn)ITC)，5.22(s，1H，Man4-H1)，5.10-5.20(bm，2H，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.70-4.80(m，3H)，4.53(d，2H，J＝8.0)，4.33(s，1H，Man3-H-2)，4.27(bs，1H，Man4-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，2.90-3.00(m，1H，Asn-βCH)，2.85-2.95(m，1H，Asn-βCH)，2.75(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝2.8，NeuAc7-H3ex)，2.15，2.14，2.12，2.09(eachs，18H，Acx6)，1.80(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
實(shí)施例54使用化合物76代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例55使用化合物77代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例56使用化合物33代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
得到的FITC化糖鏈天冬酰胺的NMR數(shù)據(jù)如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ7.88(d，1H，J＝2.0，F(xiàn)ITC)，7.76(dd，1H，Ja＝8.0，Jb＝2.0，F(xiàn)ITC)，7.46(d，1H，J＝8.0，F(xiàn)ITC)，7.45(d，1H，J＝8.8，F(xiàn)ITC)，6.85-6.93(m，4H，F(xiàn)ITC)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.05-5.20(bd，2H，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.67(d，3H，J＝7.6)，4.55(d，2H)，4.34(s，1H，Man3-H-2)，4.28(bs，1H，Man4-H-2)，4.20(s，1H，Man4-H-2)，3.00-3.10(bm，1H，Asn-βCH)，2.90-3.00(m，1H，Asn-βCH)，2.75(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝2.8，NeuAc7-H3ex)，2.14，2.13，2.12，2.08(eachs，12H，Acx4).
實(shí)施例57使用化合物26代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例58使用化合物27代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例59使用化合物28代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例60使用化合物30代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。

實(shí)施例61使用化合物31代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例62使用化合物32代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例63使用化合物37代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例64使用化合物42代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例65使用化合物38代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例66使用化合物72代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例67使用化合物43代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例68使用化合物73代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例69使用化合物39代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例70使用化合物40代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例71使用化合物41代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。

實(shí)施例72使用化合物44代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例73使用化合物45代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例74使用化合物46代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例75使用化合物34代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例76使用化合物35代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例77使用化合物36代替化合物24，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc→Asn-FITC
實(shí)施例78與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例26得到的(C-1)～(C-3)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例79與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例27得到的(C2)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例80與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例28得到的(C3)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。

實(shí)施例81與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例29得到的(C4)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例82與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例30得到的(C5)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例83與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例31得到的(C6)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例84與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例32得到的(C7)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。

實(shí)施例85與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例33得到的(C7A)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例86與參考例7同樣地對(duì)實(shí)施例34得到的(C7B)的各化合物進(jìn)行處理，對(duì)Fmoc基進(jìn)行脫保護(hù)，得到糖鏈天冬酰胺。除了使用得到的糖鏈天冬酰胺以外，其它與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例87～104使用實(shí)施例35～52得到的含有巖藻糖的糖鏈天冬酰胺衍生物，與實(shí)施例53同樣地進(jìn)行FITC化。
實(shí)施例87
實(shí)施例88 實(shí)施例89
實(shí)施例90 實(shí)施例91 實(shí)施例92 實(shí)施例93 實(shí)施例94
實(shí)施例95 實(shí)施例96 實(shí)施例97
實(shí)施例98
實(shí)施例99 實(shí)施例100 實(shí)施例101 實(shí)施例102 實(shí)施例103 實(shí)施例104
實(shí)施例105(微型板的制造)對(duì)于96孔BD生物包被鏈霉抗生物素蛋白(バイオコ-トストレプトアビジン)(BDBioscience公司生產(chǎn)生物分析用、結(jié)合能5ng/1孔)，將實(shí)施例1的生物素化糖鏈天冬酰胺100μg(相當(dāng)生物素結(jié)合能的約10倍的量)溶于蒸餾水，調(diào)整到1000μl。將該調(diào)整溶液按照每孔10μl加到各個(gè)孔中，用蒸餾水洗3次，制造微型板。各生物素化糖鏈天冬酰胺的結(jié)合收率為95％以上。固定化率的確認(rèn)由洗出的非固定化糖鏈殘量算出。
實(shí)施例106(親和柱的制造)將抗生物素蛋白包被珠(アビジンコ-トビ-ズ)(HitachiSoftware Engineering公司生產(chǎn)、xMAP LumAvidin DevelopmentMicrospheres 1ml)10ml與實(shí)施例1的生物素化糖鏈天冬酰胺30mg于漿料狀態(tài)下攪拌，過濾珠，清洗。清洗使用珠體積的2倍量的蒸餾水，在濾紙上進(jìn)行3次清洗。固定化的確認(rèn)由洗凈回收的生物素化糖鏈天冬酰胺的殘余量確認(rèn)。然后將上述的生物素化糖鏈天冬酰胺固定珠10ml用30ml的蒸餾水直接以漿料狀態(tài)充填到玻璃制的空心的色譜柱(φ20mm、長300mm)中，制造親和柱。
表1
表2 Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc→Asn(36)
表3
表4
表5
Manβ1→4GlcNAcβ1→4G1cNAc→Asn-Fmoc(13) 表6

根據(jù)本發(fā)明可以獲得對(duì)天冬酰胺的氨基氮進(jìn)行了生物素化或FITC化的糖鏈天冬酰胺。
另外根據(jù)本發(fā)明，利用生物素·抗生物素蛋白的結(jié)合特異性，只使生物素化的許多糖鏈在被抗生物素蛋白化的微型板上反應(yīng)便可以簡(jiǎn)單地制造糖鏈微芯片。通過該微芯片可以闡明具有與特定糖鏈結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。
另外，以對(duì)某一特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化為目的，通過將特定的生物素化的糖鏈結(jié)合、固定于抗生物素蛋白化的親和柱，使含有與生物素化的糖鏈具有特異結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的混合物通過上述柱子，可以只分離目的蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明中得到的FITC化糖鏈天冬酰胺在例如活體組織中的糖類受體的研究、植物凝集素的糖結(jié)合特異性的研究上有用。
權(quán)利要求
1.下式(1)表示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺衍生物， 式中，R1和R2是氫原子、式(2)～(6)表示的基團(tuán)，可以相同，也可以不同，Q表示生物素基或FITC基。
2.式(1)中R1與R2的一方必須是式(2)或式(3)表示的基團(tuán)的含有11～7糖的(α2，3)或(α2，6)糖鏈天冬酰胺衍生物。
3.式(1)中R1是式(2)表示的基團(tuán)，R2是式(3)表示的基團(tuán)的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖鏈天冬酰胺衍生物。
4.式(1)的R1是式(3)表示的基團(tuán)，R2是式(2)表示的基團(tuán)的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖鏈天冬酰胺衍生物。
5.在天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺的非還原末端側(cè)的N-乙酰葡糖胺上至少含有一個(gè)以上巖藻糖的糖鏈天冬酰胺衍生物。
6.權(quán)利要求5所述的含有巖藻糖的糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺是式(1)表示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺衍生物。
7.權(quán)利要求5所述的含有巖藻塘的糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺是權(quán)利要求3的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖鏈天冬酰胺衍生物。
8.權(quán)利要求5所述的含有巖藻塘的糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺是權(quán)利要求4的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖鏈天冬酰胺衍生物。
9.權(quán)利要求5所述的含有巖藻塘的糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺是式(1)中R1和R2是氫原子、式(2)表示的基團(tuán)、或式(4)～(6)表示的基團(tuán)，R1和R2中的一方必須是式(2)或式(4)表示的基團(tuán)的含有11～6糖的α2，3糖鏈天冬酰胺衍生物。
10.權(quán)利要求5所述的含有巖藻塘的糖鏈天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖鏈天冬酰胺是式(1)中R1和R2是氫原子、式(3)表示的基團(tuán)、或式(4)～(6)表示的基團(tuán)，R1和R2中的一方必須是式(3)或式(4)表示的基團(tuán)的含有11～6糖的α2，6糖鏈天冬酰胺衍生物。
11.生物素化糖鏈天冬酰胺的制造方法，其特征在于對(duì)式(7)表示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺進(jìn)行生物素化， 式中，R1和R2與上述相同。
12.FITC化糖鏈天冬酰胺的制造方法，其特征在于對(duì)式(7)表示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)化。
13.使權(quán)利要求1～10所述的生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的微型板。
14.使權(quán)利要求1～10所述的生物素化糖鏈天冬酰胺結(jié)合的親和柱。
全文摘要
右式(1)表示的含有11～3糖的糖鏈天冬酰胺衍生物〔式中，R
文檔編號(hào)B01J20/281GK1723213SQ20038010531
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者梶原康宏, 掛樋一晃, 深江一博 申請(qǐng)人:大塚化學(xué)株式會(huì)社, 梶原康宏