黑曲霉來源α-葡萄糖苷酶固體制劑的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物酶制劑領(lǐng)域，特別涉及到一種黑曲霉來源α -葡萄糖苷酶固體 制劑的制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] α -葡萄糖苷酶（a-glucosidase，EC 3. 2. 1. 20)是一種廣泛存在于動、植物及 微生物體內(nèi)的外切型糖苷酶。它能識別并水解糖類、糖脂、糖肽等糖類衍生物或糖類類似 物的非還原性端的α-(1，4)糖苷鍵，釋放出D-葡萄糖；除了水解活力外，某些α-葡萄 糖苷酶還在不同程度上具備催化轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的能力，能將游離的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到其它的 糖類物質(zhì)、糖類衍生物或糖類類似物受體底物上，形成新的糖類、糖脂或糖肽等，因而此類 〇-葡萄糖苷酶又被稱作葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（1：四1188111(3〇81(^86,0-8111(3〇8711：四118€6四86， EC 2.4. 1.24)。由黑曲霉等絲狀真菌產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶能夠通過其自身的轉(zhuǎn)苷活力催 化發(fā)酵性的糊精及低聚麥芽糖轉(zhuǎn)化成非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖，是目前低聚異麥芽糖工業(yè) 生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶。
[0003] 低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharides, ΙΜ0)，是由一系列聚合度為2-10的 葡聚糖組成的混合物，它們的分子中均至少帶有1個α - (1，6)糖苷鍵。頂0的理化性質(zhì)相當(dāng) 穩(wěn)定、加工性質(zhì)佳、保健功能確切且在同類低聚糖產(chǎn)品中性價比高，目前是產(chǎn)量最大、應(yīng)用 最廣、價格最有競爭力的低聚糖產(chǎn)品，其具有低熱量、抗齲齒、促進(jìn)機(jī)體腸道雙歧桿菌增殖 等特殊生理功能，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健品、飼料等行業(yè)。近年來頂0在日本的 年需求量穩(wěn)定保持在15, 000噸以上；在我國，頂0的產(chǎn)銷量均保持穩(wěn)定增長，已突破50, 000 噸/年，并被列為我國"0LIG0項目"的重點(diǎn)推廣品種之一。
[0004] 目前，頂0產(chǎn)業(yè)在國內(nèi)已初具規(guī)模，涌現(xiàn)了如山東保齡寶等較大的生產(chǎn)企業(yè)，以及 數(shù)量眾多的產(chǎn)品開發(fā)和銷售企業(yè)，國內(nèi)頂0的生產(chǎn)和消費(fèi)也進(jìn)入迅速增長中。但是，國內(nèi) IMO的生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化法工藝，生產(chǎn)中液化和糖化工序所使用的為國產(chǎn)淀粉酶制劑， 但轉(zhuǎn)苷反應(yīng)所用的關(guān)鍵酶α-葡萄糖苷酶因為國內(nèi)的產(chǎn)品技術(shù)尚不成熟，需要以大量從日 本進(jìn)口（產(chǎn)品名為Transglucosidase)。Transglucosidase的轉(zhuǎn)苷能力強(qiáng)且性能穩(wěn)定，更利 于頂0產(chǎn)品質(zhì)量的控制以及工藝優(yōu)化，但其價格昂貴且供應(yīng)量有限，使得國內(nèi)頂0的生產(chǎn)成 本居高不下，相當(dāng)程度上阻礙了頂〇的推廣。因此，開發(fā)可替代日本產(chǎn)品的轉(zhuǎn)苷酶制劑的是 我國IMO產(chǎn)業(yè)面臨的緊迫問題。國內(nèi)學(xué)者為此做了很多工作，如選育產(chǎn)生轉(zhuǎn)苷酶的菌株、確 定并優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶的條件；具有轉(zhuǎn)葡萄糖基活力相關(guān)酶基因資源的開發(fā)利用；研宄酶的 純化、純酶的性質(zhì)及工業(yè)酶制劑的制備技術(shù)；開發(fā)酶或產(chǎn)酶微生物細(xì)胞的固定化及重復(fù)使 用等應(yīng)用技術(shù)。但在大量的研宄工作中，僅有少數(shù)技術(shù)適用于IMO的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] α-葡萄糖苷酶工業(yè)化生產(chǎn)的研宄進(jìn)展之所以如此緩慢，很大程度上是因為 葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的缺乏以及酶制劑制備技術(shù)的滯后。一方面，國內(nèi)外研宄人員選育 獲得的α-葡萄糖苷酶菌株其酶活力均較低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；另一方面，通過基因工 程手段使α -葡萄糖苷酶在大腸桿菌中高效表達(dá)，一般為胞內(nèi)酶，其提取工藝復(fù)雜，酶活回 收率低，也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黑曲霉來源α -葡萄 糖苷酶固體制劑的制備方法及其應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 本發(fā)明的黑曲霉來源α-葡萄糖苷酶固體制劑，有效成分為α-葡萄糖苷酶，其來源于 黑曲霉（As/76?r^77A/5· 菌株，其合成的α-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶。該黑曲霉的保 藏編號CCTCC Ν0:Μ2014421，保藏日期為2014年9月23日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)。
[0008] 本發(fā)明利用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的黑曲霉Ml菌株，其所產(chǎn) α -葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，液體培養(yǎng)后經(jīng)離心或膜分離技術(shù)收集含α -葡萄糖苷酶的菌絲 體，將菌絲體保持完整或經(jīng)研磨后制成細(xì)胞碎片或粉末，經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后，即制得 α -葡萄糖苷酶固體制劑。該酶制劑可用于轉(zhuǎn)化淀粉糖化液或麥芽糖漿生產(chǎn)低聚異麥芽糖。 本發(fā)明不僅實現(xiàn)了 α -葡萄糖苷酶的國產(chǎn)化，大大改善國內(nèi)低聚異麥芽糖生產(chǎn)工業(yè)受制于 國外企業(yè)的局面，而且可大幅度降低低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的酶制劑成本。
[0009] 黑曲霉來源α -葡萄糖苷酶固體制劑的制備方法包括以下步驟： (1)液體培養(yǎng)黑曲霉（As/76?r^27A/5· 菌株，收集含α -葡萄糖苷酶的菌絲體； 方法為：以黑曲霉為發(fā)酵菌種，在30~35°C條件下在培養(yǎng)24h~ 48h后，發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離技術(shù)收集含α -葡萄糖苷酶的菌絲體；所述膜分離技術(shù)為真 空抽濾、板框過濾或超濾中的任意一種。
[0010] (2)將上述菌絲體保持完整或經(jīng)研磨后制成細(xì)胞碎片或粉末。
[0011] (3)將步驟（2)中的完整菌絲體、細(xì)胞碎片或粉末經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥。
[0012] (4)計量，分裝，即得α-葡萄糖苷酶固體制劑。
[0013] 本發(fā)明黑曲霉來源的α -葡萄糖苷酶固體制劑，主要應(yīng)用在在轉(zhuǎn)化淀粉糖化液或 麥芽糖漿生產(chǎn)低聚異麥芽糖方面。所述的淀粉糖化液是利用薯類淀粉或谷類淀粉，例如木 薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉或大米淀粉經(jīng)過α -淀粉酶或真菌淀 粉酶液化，然后用β -糖化酶或真菌淀粉酶糖化制??；所述的麥芽糖漿是固形物質(zhì)量百分 含量5~50%的市售麥芽糖漿。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 1.自主知識產(chǎn)權(quán)菌株黑曲霉/7ig6?r)Ml，與現(xiàn)有報道的α-葡萄糖苷酶 菌株相比，其合成的α-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，菌體細(xì)胞可作為其天然的固定載體，可以菌 絲體、細(xì)胞碎片或粉末形式制成α -葡萄糖苷酶固體制劑，十分有利于規(guī)?；苽洹?br>[0015] 2.該α-葡萄糖苷酶固體制劑，生產(chǎn)工藝簡便、清潔，生產(chǎn)成本低；該酶制劑可用 于轉(zhuǎn)化淀粉糖化液或麥芽糖漿生產(chǎn)低聚異麥芽糖，與采用進(jìn)口酶制劑相比，可大幅度降低 生產(chǎn)成本。
[0016]
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于 實施例表示的范圍。
[0018] 實施例1:黑曲霉來源α -葡萄糖苷酶固體制劑的制備方法及其應(yīng)用1 (1)將產(chǎn)α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（AsperpVAAs /7ig6?r)Ml作為菌種，32°C條件下 培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾收集菌絲體。
[0019] (2)將菌絲體研磨后過10目篩，制成細(xì)胞碎片，經(jīng)冷凍干燥后，計量、分裝，即制得 α_葡萄糖苷酶固體制劑。
[0020] (3)將固形物質(zhì)量百分含量30%的麥芽糖漿，調(diào)節(jié)ΡΗ4. 5,添加上述制得的α -葡 萄糖苷酶固體制劑10% (m/v)，55°C條件下轉(zhuǎn)苷反應(yīng)7h，即制得低聚異麥芽糖漿，經(jīng)高效液 相色譜儀測定，有效三糖（IG+P+IG3)含量為62. 52%。麥芽糖漿為市售產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇 慶煥發(fā)生物科技有限公司。
[0021] 實施例2:黑曲霉來源α -葡萄糖苷酶固體制劑的制備方法及其應(yīng)用2 (1)將產(chǎn)α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（AsperpVAAs /7ig6?r)Ml作為菌種，35°C條件下 培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌絲體。
[0022] (2)將菌絲體保持完整，經(jīng)冷凍干燥后，計量、分裝，即制得α -葡萄糖苷酶固體制 劑。
[0023] (3)將固形物質(zhì)量百分含量40%的麥芽糖漿，調(diào)節(jié)ρΗ4. 5,添加上述制得的α-葡 萄糖苷酶固體制劑15% (m/v)，55°C條件下轉(zhuǎn)苷反應(yīng)6h，即制得低聚異麥芽糖衆(zhòng)，經(jīng)高效液 相色譜儀測定，有效三糖（IG+P+IG3)含量為69. 26%。麥芽糖漿為市售產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇 慶煥發(fā)生物科技有限公司。
[0024] 實施例3:黑曲霉來源α -葡萄糖苷酶固體制劑的制備方法及其應(yīng)用3 (1)將產(chǎn)α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉/7ig6?r)Ml作為菌種，30°C條件下 培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液經(jīng)超濾收集菌絲體。
[0025] (2)將菌絲體研磨后過200目篩，制成細(xì)胞粉末，經(jīng)噴霧干燥后，計