專利名稱：具有抗脂質(zhì)累積活性的川芎內(nèi)酯提取物制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從川芎中提取的有效組分及其制備方法，以及該組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝損傷是由多種病因引起且有多種因素參與的復(fù)雜過程。肝損傷引發(fā)的肝臟疾病已成為常見病、多發(fā)病，更為嚴(yán)重的是其引發(fā)的肝功能衰竭和肝性腦病等，發(fā)病率和死亡率高，極大地威脅著人類健康。很多因素可引起肝損傷。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD),又稱非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL),是一種無過量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。非酒 精性脂肪肝包含一系列的肝臟疾病，從單一的脂肪變性到不同程度的脂肪變性聯(lián)合壞死和纖維化。而肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常累積則是脂肪肝類疾病發(fā)生的最主要因素。油酸是人體內(nèi)最為豐富的脂肪酸之一，它參與形成肝臟中的三酸甘油酯并能促進(jìn)脂滴的形成，油酸誘導(dǎo)HepG2脂肪累積是一種常用的脂質(zhì)累積細(xì)胞模型，可用于評(píng)價(jià)藥物的抗脂質(zhì)累積作用。目前，非酒精性脂肪肝治療方法有很多，且均有一定療效，但也存在著明顯的不足。首先，西藥具有較大的毒副作用，且療效并不確切。而另一方面，實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，中藥在改善肝功能、抗氧化、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能以及抗肝纖維化等方面顯示出良好的療效，安全、可靠、有效，進(jìn)一步顯示出中醫(yī)辨證論治的合理性，突顯了中藥在治療稱非酒精性脂肪肝方面的良好前景。川彎為傘形科植物川彎chuanxiong Hort.的干燥根莖,其性味辛，溫。歸肝、膽、心包經(jīng)。活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病癥；祛風(fēng)止痛，效用甚佳，可治頭風(fēng)頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川芎提取物對(duì)離體豚鼠心臟有劑量依賴性抑制作用，對(duì)離休大鼠或豚鼠心臟均具有顯著的增加冠脈流量作用，其主要活性成分川芎嗪能擴(kuò)張大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收縮反應(yīng)和右心室肥大。此外，川芎還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，對(duì)動(dòng)物大腦的活動(dòng)具有抑制作用，而對(duì)延腦呼吸中樞、血管運(yùn)動(dòng)中樞及脊髓反射中樞具有興奮作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，對(duì)于川芎內(nèi)酯類組分是否具有抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)累積的活性尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種川芎有效組分，該有效組分主要含有藁本內(nèi)酯，含量為30 90%。本發(fā)明的另一目的是提供該川芎有效組分的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)將川芎藥材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時(shí)，加熱回流提取0. 8^1. 2小時(shí)，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到有效組分。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該川芎有效組分在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第一方面提供了一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其中含有8(Γ97%(例如85%_95%)的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，力口入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時(shí)，加熱回流提取O. 8^1. 2小時(shí)，提取f 3次，合并 濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。根據(jù)本發(fā)明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時(shí)，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。本發(fā)明第二方面提供了制備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時(shí)，加熱回流提取O. 8^1. 2小時(shí)，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時(shí)，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其所得)11芎提取物中含有8(Γ97% (例如85%_95%)的藁本內(nèi)酯。本發(fā)明第三方面提供了本發(fā)明第一方面的川芎提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第四方面提供了一種藥物組合物，其中包括本發(fā)明第一方面的川芎提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的川芎有效組分可以作為活性部位，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。在本發(fā)明中，術(shù)語“川芎有效組分”亦可稱為“川芎組分”、“川芎提取物”、“川芎內(nèi)酯”等，這些術(shù)語可以互換使用。本發(fā)明的有益效果為
I.本發(fā)明的提取分離工藝簡單，能快速準(zhǔn)確地得到有效組分。 2.本發(fā)明提供的川芎有效組分化學(xué)成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機(jī)制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明首次在油酸誘導(dǎo)HepG2脂肪累積模型上，評(píng)價(jià)了川芎內(nèi)酯類提取物對(duì)抗脂質(zhì)累積降脂作用，得到較好的藥理活性。


圖I為本發(fā)明川芎提取物的GC-MS分析圖，模坐標(biāo)表示分鐘。圖2.不同濃度川芎提取物對(duì)500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一川芎有效組分的制備
將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時(shí)，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08。將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚(60-90)和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后得到淡黃色液體
11.3g，為本發(fā)明川芎提取物，其在本發(fā)明中亦可稱為川芎內(nèi)酯，并且用于下文生物學(xué)試驗(yàn)例。實(shí)施例二川芎有效組分的分析
稱取如實(shí)施例I所示川芎提取物溶解，取適量轉(zhuǎn)移至棕色液相進(jìn)樣瓶，用于液相色譜分析。分析條件如下Agilent 1100型液相色譜儀,進(jìn)樣量10 μ I ;流速lml/min,柱溫30。。。色譜流動(dòng)相梯度為:(T40min :水(O. 1%甲酸)70% 20%，乙腈30% 80% ;40_50min 水(O. 1%甲酸)20% 5%，乙腈80% 95% ;50 55min :水(O. 1%甲酸)5%，乙腈95% ;檢測(cè)波長271nm。分析譜圖如附圖I所示。液相色譜分析顯示川芎提取物在26. 5min有I個(gè)明顯色譜峰，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后鑒定該峰代表的化合物為藁本內(nèi)酯。分析結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯提取物中主要成分為藁本內(nèi)酯，其含量約為90%。出人意料地發(fā)現(xiàn)，在實(shí)施例I中，如果用濃度低于70%的乙醇提取，或者用石油醚為洗脫劑，或者所用洗脫劑中乙酸乙酯份量大于5，即50份石油醚與5份以上的乙酸乙酯混合液為洗脫劑時(shí)，藁本內(nèi)酯獲得量比實(shí)施例I的獲得量低30%以上。用75%以上乙醇提取，或者用石油醚乙酸乙酯為50 :0. 5^3的比例的混合液作為洗脫液時(shí)，藁本內(nèi)酯獲得量是實(shí)施例I的獲得量的909^115%，并且提取物中藁本內(nèi)酯含量均在80 97%。實(shí)施例三川芎有效組分制劑
取實(shí)施例I所得的川芎有效組分O. 5g與10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例四川芎有效組分制劑
取實(shí)施例I所得的川芎有效組分O. 5g，磨成細(xì)粉，與約1/3的淀粉混勻，加淀粉漿混勻制成軟材，16目篩制粒，70°C干燥，干粒過14目篩整粒，加剩余淀粉(預(yù)先在100 - 105 V干燥)與吸附有液狀石蠟的滑石粉(將輕質(zhì)液狀石蠟噴于滑石粉中混勻)，再通過14目篩，壓片，即得。實(shí)施例五川芎有效組分(實(shí)施例I的川芎提取物)抗脂質(zhì)累積活性評(píng)價(jià) 溶待測(cè)組分于DMSO中，得50 mg -inL-l儲(chǔ)備液，與細(xì)胞孵育的終濃度為50 μ g -inL-l,
在油酸誘導(dǎo)的HepG2肝細(xì)胞模型評(píng)價(jià)其抑制脂質(zhì)累積活性。將生長良好的HepG2細(xì)胞以每孔20萬細(xì)胞的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液1ml。待細(xì)胞貼壁后(約24小時(shí))，分對(duì)照組和給藥組處理，平行三次實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組中加入O. 5mM油酸，給藥組中加入O. 5mM油酸及實(shí)施例I所得川芎提取物(濃度為25、50、100,200 ug/ml)，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)24h后，棄去每孔上清，酶法測(cè)定甘油三酯、總膽固醇含量。測(cè)定方法為24孔細(xì)胞培養(yǎng)板用預(yù)冷PBS500ul洗兩次，每孔加入200ul細(xì)胞裂解液裂解30min，取裂解總液于I. 5ml離心管中，離心(12000rpm，4°C，lOmin)，分別取上清液80ul加IOOul甘油三酯酶劑測(cè)每孔甘油三酯(TG)含量，80ul加IOOul膽固醇酶劑測(cè)每孔膽固醇(TC)含量，IOul用BCA法測(cè)蛋白含量，計(jì)算每孔單位蛋白的TG和TC含量(ug/mg蛋白)。結(jié)果表明，實(shí)施例I所得川芎提取物在50ug/ml，100ug/ml, 200ug/ml濃度下有明顯的抑制油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中甘油三酯累積的作用，并呈量效關(guān)系。結(jié)果見圖2，其中顯示了不同濃度川芎提取物對(duì)500uM油酸誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響。縱坐標(biāo)表示對(duì)照的％。
權(quán)利要求
1.一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內(nèi)酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的川芎提取物，其中含有8(Γ97%的藁本內(nèi)酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡并回流提取1_4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時(shí)，加熱回流提取O. 8^1. 2小時(shí)，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法制備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時(shí)，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。
6.制備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后，用709Γ99%乙醇(例如759Γ98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎后加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時(shí)，加熱回流提取O. 8^1. 2小時(shí)，提取f 3次，合并濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮后用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮后得到提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎后，加入4000ml95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時(shí)，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶劑至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮后即得。
9.權(quán)利要求1-6的川芎提取物在制備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應(yīng)用。
10.一種藥物組合物，其中包括權(quán)利要求1-6的川芎提取物以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗脂質(zhì)累積活性的川芎內(nèi)酯提取物制備方法及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種川芎提取物，其中含有30～90%的藁本內(nèi)酯。該提取物是通過以下方法制備得到的將川芎藥材粉碎后，用70%～99%乙醇(例如75%～98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合并的萃取液回收溶劑至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅膠拌樣后過正相硅膠柱，以體積比為50∶0.5～5(例如50∶0.5～3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
文檔編號(hào)A61K36/236GK102824382SQ20121030221
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者程翼宇, 張萌, 王怡, 王毅, 劉二偉 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)