一種校對(duì)活性酶抑制劑及其降低抑制作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種聚合酶抑制劑，特別涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中抑制具有校對(duì)活 性酶的某些含特定序列的寡核苷酸及其降低抑制作用的方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)自從被發(fā)明之后，迅速成為 分子生物學(xué)的日常使用技術(shù)。最開(kāi)始使用的耐熱Taq DNA聚合酶(Taq)并不具備3 '-5 '外切 核酸酶活性，即校對(duì)活性，擴(kuò)增的產(chǎn)物保真度較低。隨后科研人員找到了幾種具有校對(duì)活性 的DNA聚合酶，比如保真度最高的Pfu DNA聚合酶(Pfu)。單獨(dú)使用Taq不能擴(kuò)增長(zhǎng)片段的 DNA，而單獨(dú)使用Pfu雖然能夠減少突變率，但其只能擴(kuò)增比Taq更短的DNA片段。由于Pfu的 持續(xù)合成能力(？1'0〇68 8；^；^7)較低，8卩一個(gè)酶結(jié)合到模板上之后一次合成的堿基數(shù)比較 少，科研人員認(rèn)為提高酶的持續(xù)合成能力能夠改善擴(kuò)增長(zhǎng)片段的能力。1994, Barnes提出 Taq或Klentaq在復(fù)制DNA過(guò)程中容易摻入錯(cuò)誤的堿基而使DNA鏈合成終止，當(dāng)加入少量的 Pfu時(shí)，Pfu的校對(duì)活性能去除不配對(duì)的堿基，使DNA鏈合成能夠繼續(xù)進(jìn)行，這樣的混合酶能 夠擴(kuò)增任一單獨(dú)酶都無(wú)法擴(kuò)增的長(zhǎng)片段DNA Barnes的結(jié)果表明對(duì)沒(méi)有校對(duì)活性的酶來(lái)說(shuō)， 持續(xù)合成能力并不是合成長(zhǎng)片段的主要影響因素，因?yàn)镵lentaq的持續(xù)合成能力比Taq酶更 低，但Klentaq的混合酶比Taq的混合酶能擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段;加入有校對(duì)活性的酶才是最關(guān) 鍵的影響因素，當(dāng)Klentaq與Pfu exo_(-種缺乏校對(duì)活性的Pfu突變體)混合時(shí)，則不能擴(kuò) 增長(zhǎng)片段。近幾年的研究表明，提高酶的持續(xù)合成能力，尤其是對(duì)具有校對(duì)活性的DNA聚合 酶，也具有至關(guān)重要的作用，比如Pfu融合了Sso7d這個(gè)雙鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后，酶的持續(xù) 合成能力大大提高，可用于擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA。然而，我們?cè)谟眠@種基因工程改造過(guò)的具有校 對(duì)活性的DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí)，仍然時(shí)不時(shí)地遇到擴(kuò)增失敗的問(wèn)題，我們發(fā)現(xiàn)，其中的部分原 因是這類(lèi)具有校對(duì)活性的酶能夠被某些含特定序列的寡核苷酸抑制。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是尋找抑制校對(duì)活性的耐熱DNA聚合酶抑制序列，并尋找消除其抑制 作用的方法，提供一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中抑制校對(duì)活性酶活性的抑制劑及降低抑制的方 法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種校對(duì)活性酶抑制劑，所述抑制劑為含有連續(xù)或不完全連續(xù)的η個(gè)G 的寡核苷酸，η為大于4的正整數(shù)，優(yōu)選所述η為5~8的正整數(shù);所述不完全連續(xù)為η個(gè)G中間 含有1個(gè)Α、Τ或C。
[0006] 進(jìn)一步，所述校對(duì)活性酶抑制劑為含有下列序列之一 ：（1)GGGGGHGG，H為Α、Τ或C; (2)GGGGG;(3)GGGGGG;(4)GGGGSG，S為G或C;(5)GGGGHGG，H為Α、Τ或C;(6)GGGGGHG，H為Α、Τ或 C;(7)GGGGGH，HSA、TSC。
[0007] 本發(fā)明還提供一種降低所述校對(duì)活性酶抑制劑在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)校對(duì)活性 酶抑制的方法，所述方法是將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中含有所述抑制劑的寡核苷酸序列濃度 降低至不大于0 . ΙμΜ，優(yōu)選0.02~0 . ΙμΜ。
[0008] 本發(fā)明還提供一種降低所述校對(duì)活性酶抑制劑在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)校對(duì)活性 酶抑制的方法，所述方法是向含有所述抑制劑的寡核苷酸中添加與抑制劑序列互補(bǔ)的寡核 苷酸。
[0009] 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，當(dāng)PCR中有引物Stat3R或GfapR 時(shí)(所有引物信息見(jiàn)表格1)，我們的擴(kuò)增總是失敗。我們推測(cè)這兩條引物具有抑制PCR的作 用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩條引物確實(shí)能夠抑制如Phusion DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成 Phusion)、Q5DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成Q5)、Cobuddy DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成Cobuddy)、 PrimeSTAR DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成PS)、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成PSGXL)以 及FastPfu Fly DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成PfuFly)等具有校對(duì)活性的DNA聚合酶的活性，但不 會(huì)抑制LA Taq(以下縮寫(xiě)成LATaq)和Taq DNA聚合酶（以下縮寫(xiě)成Taq)的活性。
[0010] 我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富含鳥(niǎo)嘌呤(G)堿基的寡核苷酸能夠?qū)哂行?duì)活性的 DNA聚合酶起抑制作用。當(dāng)寡核苷酸中含有多個(gè)G序列時(shí)（比如GGGGHGG、GGGGG及GGGGSG等。 其中Η為A、T或C，S為G或C)，Phusion DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶、Cobuddy DNA聚合酶、 PrimeSTAR DNA聚合酶以及PrimeSTAR GXL DNA聚合酶等酶的擴(kuò)增會(huì)受到嚴(yán)重的抑制。
[0011] 我們發(fā)現(xiàn)，富含G堿基的寡核苷酸對(duì)酶的抑制作用具有劑量效應(yīng)。通過(guò)下列方法可 以降低富含G堿基的寡核苷酸的抑制作用:①降低引物的使用濃度;②加入與富含G堿基序 列互補(bǔ)的寡核苷酸。
[0012] 表格1:寡核苷酸序列信息
[0013]
[0014]
[0015] 1:+表示抑制作用強(qiáng)，+/-表示有抑制作用，-表示無(wú)抑制作用
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0017] 本發(fā)明提供一種校對(duì)活性酶抑制劑，富含G堿基的寡核苷酸能夠抑制具有校對(duì)活 性的DNA聚合酶的活性，使PCR擴(kuò)增失敗;通過(guò)將降低含有所述抑制劑的寡核苷酸濃度(降低 至不大于Ο.ΙμΜ)，或者將富含C堿基的寡核苷酸與富含G堿基的寡核苷酸互補(bǔ)配對(duì)后能夠降 低其抑制作用。 (四）【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為引物Stat3R和GfapR能夠抑制具有校對(duì)活性的DNA聚合酶的PCR擴(kuò)增的電泳 圖;A.用引物01 ig2F和01 ig2R擴(kuò)增時(shí)，加入第三條引物01 ig2.6F不影響擴(kuò)增效率，加入引物 Stat3R或GfapR則抑制PSG)(L和PS酶的擴(kuò)增，但不抑制LATaq和Taq酶的擴(kuò)增；B.用引物 pBSIIF和pBSIIR擴(kuò)增pBlueScript II KS(-)質(zhì)粒時(shí)，引物Stat3R和GfapR能夠抑制 卩11118丨〇11、05、(：〇1311(1(17、？5、？56乂1^和?如?17酶的?0財(cái)廣增，但不影響1^^39酶的擴(kuò)增 ;虛線(xiàn)框表 示目的基因條帶。
[0019] 圖2為富含G序列的寡核苷酸能夠抑制具有校對(duì)活性的DNA聚合酶的活性的電泳 圖；A. CGCAGATC并不具有抑制酶活性的作用;B、C.逐步縮短引物Stat3R和Gf apR尋找具有抑 制活性的序列;D.富含G堿基具有抑制PCR擴(kuò)增的作用。
[0020] 圖3為降低富含G堿基的寡核苷酸對(duì)PCR的抑制作用電泳圖；A.引物Stat3R和GfapR 對(duì)PSGXL酶的抑制作用具有劑量效應(yīng)，濃度降低抑制作用減弱;B.擴(kuò)增Stat3基因的編碼區(qū) 時(shí)，降低引物Stat3R引物濃度，能夠提高其的擴(kuò)增效率;C. GGGGGG寡核苷酸能夠抑制PSGXL 酶的PCR擴(kuò)增，目的基因在GGGGGG濃度等于0.27μΜ時(shí)，才開(kāi)始能擴(kuò)增出微弱的條帶。當(dāng)加入 能夠與GGGGGG互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸CCCCCC時(shí)，即使GGGGGG的濃度達(dá)到0.8μΜ，仍然能擴(kuò)增出 微弱的條帶。 (五)【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0022] 實(shí)施例1:引物Stat3R或GfapR能夠抑制具有校對(duì)活性的DNA聚合酶的活性
[0023] 我們用引物01ig2F和01ig2R擴(kuò)增小鼠基因組DNA，在PCR反應(yīng)體系中加入0.4μΜ第 三條引物（分別為01ig2.6F、Stat3R和GfapR，引物信息見(jiàn)表1)。每25yL的PCR反應(yīng)體系包括 不同公司來(lái)源的DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶（縮寫(xiě)成Phusion，來(lái)源于New England Biolabs公司）、Q5DNA聚合酶（縮寫(xiě)成Q5,來(lái)源于New England Biolabs公司）、Cobuddy DNA 聚合酶(縮寫(xiě)成Cobuddy，來(lái)源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、PrimeSTAR D