本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化，涉及一種原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法。

背景技術(shù)：

1、泛素化是通過e1、e2和e3三種酶級聯(lián)反應(yīng)將小分子蛋白質(zhì)泛素共價連接到底物蛋白上的過程。該過程涉及e1酶激活泛素、e2酶轉(zhuǎn)移泛素、以及e3酶識別底物并將泛素附著在底物上。泛素化不僅可以單一附著，還可以通過泛素的七個賴氨酸殘基（k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63）或n端甲硫氨酸（m1）形成不同類型的多聚泛素鏈，調(diào)控蛋白質(zhì)的降解、活性和細(xì)胞內(nèi)定位等多種功能。cullin1-ring?e3連接酶復(fù)合物（crl）是e3泛素連接酶家族中最龐大和多樣化的一類，由骨架蛋白cullin1、ring蛋白（如rbx1）、銜接蛋白和底物識別蛋白組成。cullin1蛋白作為骨架，通過與ring蛋白和底物識別模塊的相互作用，確保泛素從e2酶順利轉(zhuǎn)移至底物蛋白。crl1在細(xì)胞周期調(diào)控、dna修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其失調(diào)與多種疾病特別是癌癥密切相關(guān)。在cullin1催化的泛素化過程中，k48連接的多聚泛素鏈?zhǔn)且粋€經(jīng)典例子。首先，e2酶ube2d將第一個泛素分子連接到底物蛋白上，隨后在e2酶cdc34的作用下，泛素鏈通過k48連接位點(diǎn)進(jìn)行延伸。k48鏈的形成是蛋白質(zhì)降解信號，被蛋白酶體識別并降解，從而調(diào)控細(xì)胞周期和基因表達(dá)。cullin1作為crl復(fù)合物的核心成分，其催化機(jī)制對于理解泛素化過程的生化機(jī)制至關(guān)重要。crl的研究不僅揭示了泛素化的分子機(jī)制，還為疾病治療提供了潛在的藥物靶點(diǎn)。

2、然而，高效表達(dá)和純化cullin1-rbx1一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的瓶頸問題。傳統(tǒng)上，研究人員主要采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來實現(xiàn)cullin1-rbx1的表達(dá)。然而，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也存在顯著的局限性。首先，其表達(dá)周期較長，從病毒轉(zhuǎn)化到蛋白質(zhì)收獲通常需要一個月的時間，這大大降低了實驗的效率。其次，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒生產(chǎn)的成本較高，增加了實驗的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，操作復(fù)雜性較高，需要嚴(yán)格的實驗條件和專業(yè)的技術(shù)人員，這在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一種在體外高效便捷地制備cullin1-rbx1?e3酶復(fù)合物的方法，將優(yōu)化改造的cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，得到e3連接酶復(fù)合物。

2、為了實現(xiàn)上述目的?，本發(fā)明提供原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，先分別對cullin1基因和rbx1基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，將cullin1和rbx1共表達(dá)，得到cullin1-rbx1融合蛋白，再將cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，得到cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物；具體步驟如下：

3、（1）通過原核表達(dá)手段獲取cullin1-rbx1融合蛋白：

4、1）構(gòu)建重組載體msyb-cullin1-rbx1-his：為了構(gòu)建同時表達(dá)cullin1和rbx1的載體，首先對全長人類cullin1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，在其n端添加了msyb增溶標(biāo)簽和hrv3c酶切位點(diǎn)，然后，將優(yōu)化后的cullin1克隆到pet29a載體的第一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)（rbs）后面；接著，對全長人類rbx1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，在其n端添加了6x?his標(biāo)簽和hrv?3c酶切位點(diǎn)，并將其克隆到pet29a載體的第二個核糖體結(jié)合位點(diǎn)（rbs）后面，得到重組載體msyb-cullin1-rbx1-his；

5、2）融合蛋白cullin1-rbx1的表達(dá)：通過熱激法把得到的重組載體msyb-cullin1-rbx1-his轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21（de3）中，在含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb平板上培養(yǎng)過夜，過夜培養(yǎng)后長出的菌落視為陽性菌落；

6、取含有重組質(zhì)粒的陽性單菌落，接種到含有終濃度為50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200?rpm振蕩培養(yǎng)10?~?12h，按照體積比為1:50的比例將培養(yǎng)的菌液接種到新鮮的含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液濃度od600在0.8?~?1.2，然后加入誘導(dǎo)物iptg（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）至工作濃度0.2?mm，繼續(xù)以16℃、180rpm的條件培養(yǎng)10-26h后，離心20min，收集并重懸菌體；

7、將離心收集的菌體，用50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液（ph=7.5）重懸，加入pmsf（苯甲基磺酰氟）至工作濃度1mm，混勻，于冰上超聲破碎，超聲參數(shù)：功率100w，超聲3s，間隔6s，共40min；然后?4℃，12000rpm，離心30min，獲取含有蛋白的上清液；

8、3）融合蛋白cullin1-rbx1的純化：采用鎳柱純化，將獲取的上清液與鎳柱孵育后用20mm和300mm的咪唑洗雜和洗脫，收集洗脫液并用prescission蛋白酶裂解蛋白質(zhì)以去除his標(biāo)簽，將洗脫液在透析緩沖液（50?mm?mes，?50?mm?nacl，ph?6.5）中透析過夜；第二天再用0.22μm濾膜過濾上樣至用緩沖液（50mm?mes，ph?6.5）預(yù)平衡的source?s?10/300gl色譜柱中，線性梯度洗脫分離；得到純凈的cullin1-rbx1融合蛋白；利用此方法，每升菌可純化得到2毫克蛋白；

9、（2）cullin1-rbx1?e3連接酶的制備：

10、將蛋白成分接頭蛋白?skp1-skp2、cks1和cullin1-rbx1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：冰上孵育一小時，得到cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物。

11、所述反應(yīng)體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液(ph?7.5)，該體系中各物質(zhì)的含量為：?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。

12、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，在體外利用改造過的cullin1-rbx1e3融合蛋白高效便捷地制備出了cullin1-rbx1e3酶復(fù)合物；在cullin1的n端引入msyb標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣叩鞍踪|(zhì)的溶解性，解決原核表達(dá)系統(tǒng)中cullin1難以折疊的問題；此外，通過將cullin1和rbx1共表達(dá)，使得cullin1和rbx1形成穩(wěn)定的復(fù)合物，減少了各自單獨(dú)存在時的錯誤折疊和聚集；這些改進(jìn)使得能夠在更短的時間內(nèi)便捷而高效地表達(dá)和純化cullin1-rbx1融合蛋白，為后續(xù)的生化結(jié)構(gòu)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)；與昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)需要接近一個月的時間相比，通過本發(fā)明所述方法的優(yōu)勢在于能夠在一周內(nèi)每一升菌便捷地獲取2mg?cullin1-rbx1融合蛋白，完全滿足相應(yīng)生化特征，結(jié)構(gòu)機(jī)制和活性分子篩選的需求；本發(fā)明制備cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法簡單、高效，適于大規(guī)模推廣使用。

技術(shù)特征：

1.原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，具體步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液，該體系中各物質(zhì)的含量為：?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，lb平板和lb液體培養(yǎng)基中卡那霉素的終濃度均為50μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，步驟2）在振蕩培養(yǎng)的條件為：37℃、200?rpm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，所述msyb的氨基酸序列如下所示：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法，其特征在于，所述超聲破碎的參數(shù)為：功率100w，超聲3s，間隔6s，共40min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及原核表達(dá)高效獲取Cullin1?Rbx1?E3連接酶復(fù)合物的方法，將優(yōu)化改造的Cullin1?Rbx1融合蛋白與Skp1?Skp2、Cks1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，得到E3連接酶復(fù)合物；在Cullin1的N端引入MsyB標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣叩鞍踪|(zhì)的溶解性，解決原核表達(dá)系統(tǒng)中Cullin1難以折疊的問題；將Cullin1和Rbx1共表達(dá)，減少各自單獨(dú)存在時的錯誤折疊和聚集；這些改進(jìn)使得能夠在更短的時間內(nèi)便捷高效地表達(dá)和純化Cullin1?RBX1融合蛋白，為后續(xù)的生化結(jié)構(gòu)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)；本發(fā)明制備E3連接酶復(fù)合物的方法簡單、高效，適于大規(guī)模推廣使用。

技術(shù)研發(fā)人員：李景虹,趙芳譽(yù),李春瞳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：青島大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21