一種仔豬腹瀉病毒變異株部分s基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法由以下步驟組成：(a)以F1與R1為引物，F(xiàn)1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID NO.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列；(b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上，得重組表達(dá)載體pET32a-bs1；(c)將重組表達(dá)載體pET32a-bs1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株，250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD600＝0.6～0.7，加入1mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建，完成。
【專利說明】—種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹瀉是由病毒引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。豬流行性腹灣病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)，只有一個血清型，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，能感染各種年齡的豬都發(fā)病。
[0003]PEDV臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，并伴有嘔吐；所有日齡豬均可發(fā)生，其中出生10日齡以內(nèi)哺乳仔豬，常常在維持腹瀉2-4天后，脫水大量死亡(50% -100% )。一些地方的養(yǎng)豬場幾乎整窩發(fā)病，呈水樣腹瀉，發(fā)病率高，病死率高，不死的仔豬成為弱仔和僵豬。日齡較大的哺乳仔豬的發(fā)病率和病死率相對較低一些。PEDV以感染乳豬、造成嚴(yán)重?fù)p失為特征；自2000年左右韓國大流行以來，周邊地區(qū)均有暴發(fā)，我國一直處于地方性流行狀態(tài)；PEDV在局部地區(qū)首先暴發(fā)后，未能及時有效控制，逐漸蔓延后，出現(xiàn)大流行。
[0004]自PEDV發(fā)現(xiàn)以來，各國學(xué)者使用多種方法嘗試使病毒適應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。1988年瑞典Hoffman等首次在Vero傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入胰酶，通過細(xì)胞上連續(xù)盲傳成功獲得病毒的細(xì)胞培養(yǎng)。隨后日本和韓國也相繼有培養(yǎng)成功的報道。但不同來源的Vero細(xì)胞、不同毒株和培養(yǎng)條件都是影響病毒分離的重要因素。PEDV的體外細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)難度大，繁殖條件復(fù)雜，病毒在細(xì)胞中繁殖滴度低，細(xì)胞病變不明顯，一直是PEDV體外增殖過程的一個重要技術(shù)瓶頸。要分離到一株該病毒需要時間較長，工作量大，相關(guān)疫苗的發(fā)展也受到影響與限制。
[0005]目前，雖然商品化PEDV疫苗已普遍使用，有多個廠家的滅活苗和弱毒苗供選擇，但免疫效果一直不理想，該病在我國仍有流行，并引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過對病毒的分析，豬流行性腹瀉病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與其他冠狀病毒相似，糖基化纖突(spike)蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白。2010PED野毒在纖突蛋白基因區(qū)域出現(xiàn)插入性突變，該區(qū)域?yàn)椴《镜目乖瓫Q定區(qū)域。經(jīng)典毒株CV777制備的疫苗以及變異前毒株(與經(jīng)典毒株處于同一進(jìn)化分支的)制備的疫苗，在病毒S蛋白發(fā)生變異后，疫苗治療效果大打折扣，治療效果不明顯。為了對已變異的仔豬腹瀉病毒PEDV進(jìn)行有效的治療，研制一種新的有效的PEDV疫苗十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的:(I)提供一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因；(2)提供一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法；(3) —種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:(1) 一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因，所述S基因由序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列組成。(2) —種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:該構(gòu)建方法由以下步驟組成:
(a)以Fl 與 Rl 為引物，F(xiàn)l:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ；R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ；利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列；所述PCR反應(yīng)體系為:2XEx Taq PCR premix10 μ l，cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，雙蒸水7 μ I ;反應(yīng)參數(shù)分為3步，第I步為95°C 5min，第 2 步為 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min，35 個循環(huán)，第 3 步為 72°C延伸 1min ；
(b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上，得重組表達(dá)載體 pET32a-bsl ；
(c)將重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株，250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7，加入lmmol/L IPTG，37°C誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建，完成。
[0008](3) 一種仔豬腹灣病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法,該表達(dá)方法有如下步驟組成:(I)挑取權(quán)利要求2中所述的大腸桿菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入含有抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培養(yǎng)物中加入濃度為lmmol/L的IPTG，37°C，誘導(dǎo)表達(dá)6h后，8000rpm，20min離心處理收集含有重組仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的大腸桿菌菌體沉淀。
[0009]所述的質(zhì)粒載體是含有SEQ ID N0.1基因，通過插入pET32a載體構(gòu)建成的。所述的重組工程菌是由上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞株得到的。該重組工程菌的原核宿主細(xì)胞株是大腸桿菌。所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育上述大腸桿菌。
[0010]本發(fā)明構(gòu)建了仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體。通過應(yīng)用PCR技術(shù)合成了仔豬腹瀉變異株部分S基因序列，將該基因序列克隆至pET32a中，得到重組表達(dá)載體pET32a-bsl，再通過CaCl2轉(zhuǎn)化大腸桿菌，根據(jù)生長情況快速篩選出表達(dá)量較高的陽性克隆轉(zhuǎn)化子bsI，該表達(dá)蛋白目前可以通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0011]有益效果:S蛋白是在PEDV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本發(fā)明成功構(gòu)建了一株重組原核表達(dá)蛋白，能夠穩(wěn)定表達(dá)PEDV部分S基因蛋白。通過western-blotting試驗(yàn)證明重組蛋白具有反應(yīng)原性；仔豬免疫試驗(yàn)證實(shí)，免疫激發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生了針對仔豬流行性腹瀉病毒變異株部分S蛋白的特異性的抗體，抗體中和效價達(dá)到>1:32，所構(gòu)建重組蛋白具有免疫原性。本發(fā)明所構(gòu)建部分S基因包含纖突蛋白基因區(qū)域出現(xiàn)的插入性突變部分，為PEDV新型變異株基因工程疫苗的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0013]圖1為本發(fā)明的構(gòu)建流程圖；
圖2重組蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)產(chǎn)物電泳圖。其中，條帶1:pET_32a空載體誘導(dǎo)；條帶2:重組表達(dá)載體pET-32a_bsl未誘導(dǎo)；條帶3:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)4h ;條帶4:重組表達(dá)載體pET-32a bsl誘導(dǎo)5h ;條帶5:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)6h ;條帶6:重組表達(dá)載體pET_32a bsl誘導(dǎo)7h ；M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker

【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1.仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因序列的獲得，根據(jù)仔豬腹瀉病毒變異株的基因序列，設(shè)計以下引物:F1:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’ ；R1:5， -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3，；
利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼腹瀉病毒變異株部分S基因序列，PCR反應(yīng)體系為(20 μ I):2XEx Taq PCR premix 10μ l,cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，雙蒸水7 μ I。反應(yīng)參數(shù)分為3步，第 I 步為 950C 5min,第 2 步為 95V 30s, 57°C 30s, 72°C 2min, 35 個循環(huán)，第 3 步為 72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物連接pMD19_T克隆載體，篩選陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，所得序列例如SEQ ID N0.1所示。
[0015]實(shí)施例2.重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
用EcoR I和Sal I分別雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶，得到原核表達(dá)載體pET32a-bsl，用CaCl2法熱激90秒將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL 21(DE3)。利用Amp抗性篩選單菌落。所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR，酶切鑒定證明克隆正確后送北京博邁德生物工程有限公司測序。具體構(gòu)建流程見圖1.實(shí)施例3.重組大腸桿菌表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和篩選
將鑒定正確的重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株，加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h，加入磷酸緩沖液重懸細(xì)胞。
[0016]實(shí)施例4.變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)
在1ml含100 μ g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，按1:1000接種BL21_pET32a_bsl菌液，370C，250rpm震蕩培養(yǎng)過夜；次日按1:50接種培養(yǎng)過夜的菌液至含100 μ g/ml的新LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6?0.7 ;每管分別加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)；分別在誘導(dǎo)4h，5h，6h，7h后收集菌液，4°C，8000rpm離心收集菌體；加入1ml 0.0lM的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS,pH 7.4)重懸菌體。4°C,8000rpm離心20min，棄上清。重復(fù)洗滌菌體一次。加入5ml上述緩沖液重懸菌體。SDS-PAGE電泳檢測，如圖2所示。在69kDa位置附近出現(xiàn)一條高表達(dá)量的特異性條帶，分子量大小約69kDa，與理論值相符。
[0017]本發(fā)明的重組載體pET32a_bsl可以表達(dá)獲得重組蛋白，小量制備蛋白免疫仔豬，免后2周檢測抗體，可產(chǎn)生特異性抗體。本發(fā)明的成果將為PEDV基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因，其特征在于:所述S基因由序列表中SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列組成。
2.—種仔豬腹灣病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于:該構(gòu)建方法由以下步驟組成: (a)以Fl 與 Rl 為引物，F(xiàn)l:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ；R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ；利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.1所示的編碼仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的基因序列；所述PCR反應(yīng)體系為:2XEx Taq PCR premix10 μ l，cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，雙蒸水7 μ I ;反應(yīng)參數(shù)分為3步，第I步為95°C 5min，第 2 步為 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min，35 個循環(huán)，第 3 步為 72°C延伸 1min ； (b)將上述編碼的仔豬腹瀉變異株部分S基因序列連接至pET32a載體上，得重組表達(dá)載體 pET32a-bsl ； (c)將重組表達(dá)載體pET32a-bsl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株，250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7，加入lmmol/L IPTG，37°C誘導(dǎo)6h表達(dá)目的蛋白即仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建，完成。
3.一種仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于:該表達(dá)方法有如下步驟組成:(I)挑取權(quán)利要求2中所述的大腸桿菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入含有抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培養(yǎng)物中加入濃度為lmmol/L的IPTG，370C，誘導(dǎo)表達(dá)6h后，SOOOrpm, 20min離心處理收集含有重組仔豬腹瀉病毒變異株部分S基因的大腸桿菌菌體沉淀。
【文檔編號】C12N15/70GK104357461SQ201410710763
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】程蘭玲 申請人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司