專利名稱：冷誘導(dǎo)的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遺傳工程的載體和用所述載體表達(dá)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
利用遺傳工程來(lái)生產(chǎn)有用蛋白的技術(shù)如今已被廣泛應(yīng)用。其中，以大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主的表達(dá)系統(tǒng)是最常用的表達(dá)系統(tǒng)。利用重組體已經(jīng)生產(chǎn)了許多種蛋白。所謂的表達(dá)載體通常是為利用重組體生產(chǎn)有用蛋白而構(gòu)建和使用的。在表達(dá)載體中，目的基因被置于由RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子控制之下。用于以大腸桿菌為宿主的表達(dá)載體的示例性啟動(dòng)子是lac、trp、tac、gal和ara啟動(dòng)子。利用除直接由大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子之外的啟動(dòng)子的表達(dá)載體包括pET-系統(tǒng)(Novagen)。該pET-系統(tǒng)利用由來(lái)自感染大腸桿菌的T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子(參見(jiàn)J.Mol.Biol.，189113-130(1986)；Gene，56125-135(1987))。對(duì)于pET-系統(tǒng)而言，T7 RNA聚合酶在大腸桿菌中表達(dá)，在表達(dá)載體中位于T7啟動(dòng)子下游的目的基因由T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，且目的蛋白是利用宿主的翻譯系統(tǒng)合成的。
然而，如果目的蛋白是利用包括pET-系統(tǒng)在內(nèi)的諸多大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)之一進(jìn)行高水平表達(dá)的，那么該目的蛋白在許多情況下可能會(huì)形成稱作包函體的不溶性復(fù)合物。結(jié)果，大大減少了活性形式目的蛋白的量。對(duì)若干種多肽已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了通過(guò)包函體的溶解和重折疊來(lái)獲得活性多肽。回收率在許多情況中常常是低的。此外，對(duì)于各種目的蛋白還需要研究適宜的重折疊條件。因此，現(xiàn)已需要一種直接在大腸桿菌中表達(dá)活性蛋白的系統(tǒng)。
有人認(rèn)為，包函體是作為下述的結(jié)果形成的。翻譯得到的多肽鏈中間體在折疊成其正確構(gòu)象前由于分子間相互作用而與另一多肽鏈相互纏繞，從而形成一個(gè)巨大的不溶性復(fù)合物。在這種情況下，已知在低于常規(guī)37℃的溫度下(20至30℃)培養(yǎng)重組大腸桿菌細(xì)胞可以提高活性形式蛋白的表達(dá)水平。猜測(cè)這是由于核糖體的緩慢翻譯為中間體折疊成其正確結(jié)構(gòu)提供了充足的時(shí)間，而且低溫條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的緩慢作用提高了所表達(dá)的活性蛋白的穩(wěn)定性。因此，人們已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注對(duì)于生產(chǎn)會(huì)形成包函體的蛋白來(lái)說(shuō)有用的在低溫條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌細(xì)胞的方法。
如果在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度從37℃下調(diào)至10～20℃，則大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)暫時(shí)停滯，期間誘導(dǎo)出一組稱作冷休克蛋白的蛋白表達(dá)。根據(jù)誘導(dǎo)水平將這些蛋白分作兩組組I(10倍或更多)和組II(低于10倍)。組I中的蛋白包括CspA、CspB、CspG和CsdA(參見(jiàn)J.Bacteriol.，1784919-4925(1996)；J.Bacteriol.，1782994-2997(1996))。由于將溫度從37℃調(diào)至10℃后1.5小時(shí)CspA(WO90/09447)的表達(dá)水平達(dá)到總細(xì)胞蛋白的13％(參見(jiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87283-287(1990))，所以已經(jīng)嘗試?yán)胏spA基因的啟動(dòng)子來(lái)在低溫下生產(chǎn)重組蛋白。
對(duì)于利用cspA基因在低溫條件下表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，除上述由該基因啟動(dòng)子在低溫下的高度有效的轉(zhuǎn)錄起始之外，還顯示出以下效果。
(1)如果從cspA基因轉(zhuǎn)錄且能夠被翻譯的mRNA不編碼功能性的CspA蛋白(尤其是，如果它只編碼CspA蛋白一部分N-末端序列)，則這樣的mRNA會(huì)長(zhǎng)時(shí)間抑制其它包括冷休克蛋白在內(nèi)的大腸桿菌蛋白的表達(dá)。在此期間，該mRNA被優(yōu)選翻譯(J.Bacteriol.，1784919-4925(1996)；WO98/27220)。這一現(xiàn)象稱作LACE(截短的cspA表達(dá)的低溫依賴性抗生素效應(yīng))效應(yīng)。
(2)一段稱作下游盒的由15個(gè)核苷酸組成的序列位于cspA基因起始密碼子下游12個(gè)核苷酸處。由于該序列使得低溫條件下的翻譯效率變高。
(3)由159個(gè)核苷酸組成的5′-非翻譯區(qū)位于cspA基因mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和起始密碼子之間。該區(qū)域?qū)spA在37℃的表達(dá)有負(fù)效應(yīng)，而對(duì)其在低溫條件下的表達(dá)有正效應(yīng)。
尤其，在上述(1)中描述的現(xiàn)象暗示了利用cspA基因僅特異表達(dá)一種目的蛋白的可行性。因此，預(yù)期該系統(tǒng)可用于生產(chǎn)高純度的重組蛋白或制備用于結(jié)構(gòu)分析的同位素標(biāo)記的蛋白。
已知培養(yǎng)含有表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞達(dá)到可以使細(xì)胞被誘導(dǎo)的水平比較困難，或者如果對(duì)基因啟動(dòng)子的表達(dá)控制是不完全的、而且基因產(chǎn)物對(duì)宿主有害，則甚至表達(dá)載體的構(gòu)建也不太可能(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5654169)。
為了解決上述問(wèn)題、進(jìn)一步提高基因表達(dá)效率、以及容易地獲得表達(dá)產(chǎn)物，已經(jīng)嘗試?yán)胏spA基因的5′-非翻譯區(qū)來(lái)修飾表達(dá)載體(WO99/27117)。本文公開(kāi)了通過(guò)導(dǎo)入操縱基因來(lái)嚴(yán)格控制表達(dá)或者通過(guò)向5′-非翻譯區(qū)中導(dǎo)入突變以提高基因表達(dá)水平的修飾。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，低溫條件下的蛋白表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種非常有效的系統(tǒng)，并且希望進(jìn)一步提高表達(dá)效率等。
本發(fā)明的主要目的是構(gòu)建一種在低溫條件下更加優(yōu)越的基因表達(dá)系統(tǒng)，例如，通過(guò)利用csp基因提高表達(dá)載體的基因表達(dá)效率。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明人已經(jīng)評(píng)估了向源自csp基因的5′-非翻譯區(qū)核苷酸序列中引入修飾的效果。結(jié)果是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)調(diào)整在mRNA 5′-非翻譯區(qū)對(duì)應(yīng)部分中形成的莖間的距離會(huì)提高下游序列所編碼蛋白的表達(dá)水平。而且，本發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)含有編碼這樣的修飾后5′-非翻譯區(qū)的DNA的表達(dá)載體。因而，本發(fā)明已經(jīng)完成。
本發(fā)明概述如下。本發(fā)明第一方面涉及具有編碼源自冷休克蛋白基因mRNA的5′-非翻譯區(qū)部分的載體，其中向5′-非翻譯區(qū)中導(dǎo)入了突變，由此改變了在所述區(qū)域中形成的莖結(jié)構(gòu)間的距離。
根據(jù)該第一方面，導(dǎo)入5′-非翻譯區(qū)中的突變其例子有核苷酸的插入或缺失。在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1中核苷酸593至核苷酸598的大腸桿菌cspA基因的一個(gè)區(qū)域中導(dǎo)入了突變的載體是一個(gè)特別優(yōu)選根據(jù)該第一方面的載體，編碼5′-非翻譯區(qū)的部分還可以帶有一個(gè)操縱基因。具有SEQ ID NO2、3或4的核苷酸序列的5′-非翻譯區(qū)是一個(gè)特別優(yōu)選的載體中的5′-非翻譯區(qū)例子。
第一方面的載體可以具有一個(gè)位于5′-非翻譯區(qū)編碼部分上游的啟動(dòng)子。而且，它可以具有一段與所使用宿主的核糖體RNA中的反義-下游盒(anti-downstream box)序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列位于5′-非翻譯區(qū)編碼部分的下游。
例如，第一方面的載體可以是質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的第二方面涉及表達(dá)目的蛋白的方法，該方法包括(1)用已經(jīng)整合有編碼目的蛋白的基因的第一方面載體轉(zhuǎn)化宿主以獲得轉(zhuǎn)化體；(2)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體；和(3)將培養(yǎng)溫度下調(diào)至低于常規(guī)溫度以表達(dá)目的蛋白。
根據(jù)第二方面，在步驟(3)中或之后可以誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文中將詳細(xì)描述本發(fā)明。
如本文所使用的，“區(qū)域”指核酸區(qū)域(DNA或RNA)。如本文所使用的，“mRNA的5′-非翻譯區(qū)”指不編碼蛋白的區(qū)域，并位于由于轉(zhuǎn)錄DNA所合成的mRNA的5′側(cè)。下文中，該區(qū)域還可以稱為“5′-UTR(5′-非翻譯區(qū))”。除非另外指明，5′-UTR指大腸桿菌cspA基因mRNA的5′-非翻譯區(qū)或其修飾。
如本文所使用的，“冷休克蛋白基因”指編碼在將生物的生長(zhǎng)溫度從其生理溫度下調(diào)后誘導(dǎo)發(fā)生表達(dá)蛋白的基因。
根據(jù)本發(fā)明所使用的編碼冷休克蛋白mRNA 5′-UTR的部分是編碼該基因mRNA中起始密碼子5′側(cè)區(qū)域的部分。這樣的部分特有地發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌冷休克蛋白基因(cspA、cspB、cspG、csdA等)中(J.Bacteriol.，1784919-4925(1996)；J.Bacteriol.，1782994-2997(1996))。在從這樣一個(gè)基因所轉(zhuǎn)錄的mRNA中自5′末端的100個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的部分不翻譯成蛋白。這一部分對(duì)基因表達(dá)的冷應(yīng)答是重要的。如果將這一5′-非翻譯區(qū)加到任意蛋白mRNA的5′末端，則在低溫條件下mRNA會(huì)翻譯成蛋白。
根據(jù)本發(fā)明所使用的“mRNA 5′-非翻譯區(qū)”不限于源自上述特定基因的mRNA 5′-非翻譯區(qū)。根據(jù)本發(fā)明可應(yīng)用源自冷休克蛋白基因并能夠形成兩個(gè)或更多個(gè)莖結(jié)構(gòu)的5′-非翻譯區(qū)。
可以將如上所列的來(lái)源于冷休克蛋白基因的5′-UTR的編碼部分用于本發(fā)明的載體。尤其優(yōu)選地可以使用源自大腸桿菌cspA基因的5′-UTR編碼部分。大腸桿菌cspA基因的核苷酸序列根據(jù)登錄號(hào)M30139登記在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，且公眾可以獲得。核苷酸序列示于SEQ ID NO1中。此外，根據(jù)本發(fā)明還可以使用核苷酸序列已經(jīng)過(guò)部分修飾過(guò)的5′UTR。例如，可以使用如WO 99/27117中所述包含在質(zhì)粒pMM047或pMM048中、來(lái)自cspA基因的5′-UTR-編碼部分。包含在質(zhì)粒pMM048中、來(lái)自大腸桿菌cspA基因的5′UTR-編碼部分的核苷酸序列示于SEQ ID NO5。該序列與本說(shuō)明書(shū)實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒pCold08NC2中所包含的5′-UTR編碼部分的核苷酸序列相同。
本發(fā)明的特征在于，將突變導(dǎo)入5′-UTR-編碼部分從而使得該突變調(diào)節(jié)莖(推測(cè)在5′-UTR內(nèi)所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu))之間的距離。例如，通過(guò)向?qū)?yīng)于莖間區(qū)域的部分中插入核苷酸、或者通過(guò)缺失這樣的部分中的一部分核苷酸，可以增大或者減小莖間的距離。對(duì)于導(dǎo)入突變的位置、或突變中所插入或缺失的核苷酸數(shù)目沒(méi)有特定的限制，只要由于這一突變而導(dǎo)致下游所連接基因的表達(dá)水平與不帶有該突變的基因相比被提高。不必說(shuō)，該突變優(yōu)選不干擾5′-UTR實(shí)現(xiàn)冷特異性基因表達(dá)的能力。
預(yù)計(jì)，源自大腸桿菌cspA基因的5′-UTR在核苷酸序列SEQ IDNO1中自584至593位核苷酸之間的區(qū)域內(nèi)和自598至608位核苷酸之間的區(qū)域內(nèi)形成莖結(jié)構(gòu)。因此，可以通過(guò)向上述區(qū)域之間的部分(從核苷酸593至核苷酸598)中、或者向被引入了突變的5′-UTR中對(duì)應(yīng)于所述部分的部分中引入核苷酸插入或缺失來(lái)調(diào)節(jié)莖間的距離。本發(fā)明不限于上述的莖間距離調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的缺失突變包括莖間的部分中一至全部核苷酸的缺失。插入突變的例子有插入1至100個(gè)核苷酸、優(yōu)選3至60個(gè)核苷酸、更優(yōu)選8至40個(gè)核苷酸。
盡管無(wú)意限制本發(fā)明，但實(shí)施例所述質(zhì)粒載體pCold08s2、pCold08s12和pCold08s32中所包含的5′-UTR例示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。質(zhì)粒載體中所包含的5′-UTR的核苷酸序列分別示于SEQID NOS2、3和4。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以用編碼5′-UTR的部分來(lái)制備，該5′-UTR是根據(jù)本發(fā)明制備的而且其中莖間的距離做了如上所述的調(diào)節(jié)。具體地說(shuō)，它可以按照下述進(jìn)行制備。假定以由5′-UTR-編碼DNA編碼的mRNA形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)為起始材料。用已知方法將插入或缺失突變導(dǎo)入被推定對(duì)應(yīng)于莖間部分的部分。將由此獲得的DNA與適宜的啟動(dòng)子一同整合進(jìn)載體。
本發(fā)明的載體可以是任何一個(gè)常用載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體)，只要可以用它實(shí)現(xiàn)作為載體的目的。本發(fā)明的載體在轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主中后如果可能整合進(jìn)基因組DNA，就不會(huì)帶來(lái)不方便。
5′-UTR在本發(fā)明的載體中插入在啟動(dòng)子和編碼目的蛋白的區(qū)域之間。根據(jù)本發(fā)明所使用的啟動(dòng)子例子包括但不限于源自冷休克蛋白基因(例如，cspA、cspB、cspG和cspA)的啟動(dòng)子，預(yù)計(jì)這些啟動(dòng)子在低溫下具有高啟動(dòng)子活性。啟動(dòng)子可以是任何一個(gè)在所使用的宿主中具有起始轉(zhuǎn)錄成RNA活性的啟動(dòng)子。如果用大腸桿菌作為宿主，可以使用比如lac、trp、tac、gal或ara這樣的啟動(dòng)子。
除了以上所提及的元件之外，關(guān)于所包含的區(qū)域，本發(fā)明的載體還可以具有，例如，復(fù)制起點(diǎn)、用作選擇標(biāo)記的藥物抗性基因或調(diào)節(jié)序列比如操縱基因或終止子。
根據(jù)本發(fā)明可以使用存在于各種基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域中的操縱基因，比如來(lái)自大腸桿菌乳糖操縱子的lac操縱基因?？梢酝ㄟ^(guò)利用合適的誘導(dǎo)物比如乳糖或其類似物(優(yōu)選異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))來(lái)取消lac操縱基因的功能來(lái)使得啟動(dòng)子起作用。這樣的操縱基因序列通常位于啟動(dòng)子下游以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近。
本發(fā)明的載體還可以具有為操縱基因功能所必需的調(diào)節(jié)基因(例如，lac操縱基因的lacIq基因)。
通過(guò)在5′-非翻譯區(qū)下游除包含上述元件之外還包含一個(gè)互補(bǔ)于所使用宿主的核糖體RNA中的反義-下游盒序列的核苷酸序列，有可能提高表達(dá)效率。例如，對(duì)于大腸桿菌而言，反義-下游盒序列位于16S核糖體RNA的第1467位至第1481位(The EMBO Journal，15665-674(1996))。有可能利用冷休克蛋白N-末端肽的編碼區(qū)域，它包含了與所述序列高度互補(bǔ)的核苷酸序列。使反義-下游盒序列的互補(bǔ)序列從距離起始密碼子約一至十五個(gè)核苷酸附近起始，這樣的放置是有效的?？梢詫⒕幋a目的蛋白的基因整合進(jìn)載體，這樣該蛋白表達(dá)為具有N-末端肽的融合蛋白。作為選擇，可以利用定點(diǎn)誘變導(dǎo)入堿基置換，從而使編碼目的蛋白的基因互補(bǔ)于反義-下游盒序列。如果將編碼目的蛋白的基因整合進(jìn)載體從而使得目的蛋白表達(dá)為融合蛋白，則該肽可以是任意長(zhǎng)度的肽，只要目的蛋白不喪失活性。用于表達(dá)融合蛋白的載體可以，例如，在連接位點(diǎn)進(jìn)行遺傳操作，由此可以用適宜的蛋白酶從融合蛋白中分離目的蛋白。作為選擇，也可以進(jìn)行這樣的遺傳操作，從而使得融合蛋白表達(dá)為與可以用于純化或檢測(cè)的肽融合的蛋白?？捎糜诩兓磉_(dá)蛋白的肽的例子包括但不限于組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
例如，利用按照下述被構(gòu)建為質(zhì)粒的本發(fā)明載體來(lái)表達(dá)目的蛋白。表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)化體可以通過(guò)將編碼該蛋白的基因克隆進(jìn)本發(fā)明的質(zhì)粒載體、并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適宜的宿主來(lái)獲得。通過(guò)降低培養(yǎng)溫度，該轉(zhuǎn)化體特異性表達(dá)目的蛋白。如果該載體帶有一個(gè)操縱基因，則可以通過(guò)適宜的方法取消這一操縱基因的功能來(lái)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
如果用本發(fā)明的載體表達(dá)蛋白，則目的蛋白優(yōu)選由于上述LACE效應(yīng)而翻譯。結(jié)果，培養(yǎng)物中的目的蛋白含量高于常規(guī)的重組蛋白表達(dá)，且因此，有可能制備高純度的目的蛋白。在適宜同位素存在下表達(dá)目的蛋白可以制備同位素標(biāo)記的蛋白。由此獲得的高純度標(biāo)記蛋白適于利用NMR做結(jié)構(gòu)分析。例如，培養(yǎng)的培養(yǎng)物或裂解物可以直接進(jìn)行NMR分析。
實(shí)施例以下實(shí)施例更詳細(xì)地闡述了本發(fā)明，但是不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
在本文所述的方法中，基本方法包括質(zhì)粒制備和限制酶消化，其根據(jù)T.Maniatis等人(eds.)，Molecular CloningA LaboratoryManual第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法來(lái)實(shí)施。除非另外指明，使用大腸桿菌JM109作為如下述質(zhì)粒構(gòu)建的宿主，并使用包含50pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.0)、或使用向LB培養(yǎng)基中添加濃度為1.5％的瓊脂并固化所得混合物而制備的LB瓊脂培養(yǎng)基。
參考實(shí)施例質(zhì)粒pCold08NC2的構(gòu)建根據(jù)WO99/27117的描述利用大腸桿菌JM109/pMM047(FERMBP-6523)(于1997年10月31日保藏(原始保藏日期)在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，特許生物寄托中心，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)中所含的質(zhì)粒pMM047為起始材料構(gòu)建pCold08NC2。按照從上游至下游的順序，質(zhì)粒pCold08NC2中含有以下元件lac啟動(dòng)子、經(jīng)過(guò)修飾的大腸桿菌cspA基因-來(lái)源的5′-UTR和多克隆位點(diǎn)。此外，該質(zhì)粒還帶有l(wèi)acI基因、與大腸桿菌16S核糖體RNA中的反義-下游盒序列完全互補(bǔ)的下游盒序列、由六個(gè)組氨酸殘基組成的組氨酸標(biāo)簽和編碼由因子X(jué)a識(shí)別的氨基酸序列的核苷酸序列。
實(shí)施例1載體pCold08s2的構(gòu)建和蛋白表達(dá)水平研究(1)質(zhì)粒載體pCold08s2的構(gòu)建按照下述向獲自參考實(shí)施例1的質(zhì)粒pCold08NC2中的5′-UTR-編碼部分中導(dǎo)入20個(gè)核苷酸的插入突變。
利用作為模板的質(zhì)粒pCold08NC2和合成的引物Sp20F(SEQ IDNO6)和引物CSPterR(SEQ ID NO7)實(shí)施PCR。將含有50ngpCold08NC2、5μl Ex Taq緩沖液、8μl dNTP混合物、5pmol引物Sp20、5pmol引物CSPterR、0.5μl Takara Ex Taq(Takara Bio)和無(wú)菌水且總體積為50μl的反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94℃1分鐘(變性)，55℃1分鐘(引物退火)和72℃1分鐘(合成反應(yīng)))。將全部PCR反應(yīng)混合物在3％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出約300-bp的擴(kuò)增的DNA片段，將其懸浮于5μl無(wú)菌水中，并用作擴(kuò)增的片段SC。
用合成的引物Sp20R(SEQ ID NO8)和引物NheF2(SEQ IDNO9)，以及以pCold08為模板在相似的條件下實(shí)施PCR。將全部PCR反應(yīng)混合物在3％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出約150-bp的擴(kuò)增的DNA片段，將其懸浮于5μl無(wú)菌水中，并用作擴(kuò)增的片段SN。
將總體積為50μl，含有擴(kuò)增的片段SC和SN各1μl、5μl Ex Taq緩沖液、5μl dNTP混合物和無(wú)菌水的混合物于94℃加熱10分鐘，在60分鐘內(nèi)冷卻至37℃，并在37℃溫育15分鐘。向其中加入0.5μlTakara Ex Taq，并于72℃下加熱混合物3分鐘。
向反應(yīng)混合物中添加引物NheF2和CSPterR各5pmol、5μl ExTaq緩沖液、5μl dNTP混合物和無(wú)菌水至總體積100μl。將所得反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘和72℃ 2分鐘)。將全部PCR反應(yīng)混合物在3％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出約400-bp的擴(kuò)增的DNA片段，將其懸浮于5μl無(wú)菌水中，并用作擴(kuò)增的片段Sp20-1。
Sp20-1用限制酶NheI和EcoRI(都來(lái)自Takara Bio)做雙重消化。在1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離所得DNA片段，然后提取和純化。將純化的DNA片段和經(jīng)過(guò)NheI和EcoRI消化的pCold08混合，并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將二者連接。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并使轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從所得克隆制備質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇其中已經(jīng)正確插入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，并命名為pCold08s2。在pCold08s2中，在pCold08NC25′-UTR(SEQ ID NO5)的第+120和+121之間插入了核苷酸序列5′-GAGCGGATAACAATTTCACA-3′(SEQ ID NO11)。將lac操縱基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定義為+1。如SEQ ID NO1所示，該位置對(duì)應(yīng)于cspA基因核苷酸序列核苷酸597和核苷酸598間的位置。包含在pCold08s2中的5′-UTR的核苷酸序列示于SEQ ID NO2。
(2)構(gòu)建表達(dá)蛋白的質(zhì)粒(2)-1質(zhì)粒載體pCold08s2-GFP的構(gòu)建如下所述將編碼源自維多利亞水母(Aequorea victoria)的GFP蛋白的基因整合進(jìn)pCold082。利用作為模板的質(zhì)粒pQBI63(TakaraBio)和合成的引物GFP-F(SEQ ID NO11)和引物GFP-R(SEQ IDNO12)實(shí)施PCR。將含有50ng pQBI63、5μl Ex Taq緩沖液、8μldNTP混合物、引物GFP-F和GFP-R各5pmol、0.5μl Takara Ex Taq(Takara Bio)和無(wú)菌水且總體積為50μl的反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘)。將全部PCR反應(yīng)混合物在3％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出含GFP基因的約700-bp的擴(kuò)增的DNA片段，將其懸浮于5μl無(wú)菌水中。用EcoRI和XbaI(Takara Bio)雙重消化該DNA片段。在1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離所得DNA片段，然后提取和純化。將純化的DNA片段和經(jīng)過(guò)EcoRI和XbaI消化的pCold08s2混合，并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將二者連接。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并使轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從所得克隆制備質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇其中已經(jīng)正確插入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，并命名為pCold08s2-GFP。此外，以類似的方式將含有GFP基因的擴(kuò)增的DNA片段整合進(jìn)在其5′-UTR中不帶有插入序列的pCold08NC2，獲得pCold08-GFP。
(2)-2質(zhì)粒載體pCold08s2-H296的構(gòu)建H296片段蛋白是衍生自纖連蛋白的肝素結(jié)合多肽，按照下述將其編碼基因整合進(jìn)pCold082。
利用作為模板的質(zhì)粒pCH102(美國(guó)專利號(hào)5198423)和合成的引物H296-F(SEQ ID NO13)和引物H296-R(SEQ ID NO14)實(shí)施PCR。將含有50ng pCH102、5μl Ex Taq緩沖液、8μl dNTP混合物、引物H296-F和H296-R各5pmol、0.5μl Takara Ex Taq和無(wú)菌水且總體積為50μl的反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR(30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘)。將全部PCR反應(yīng)混合物在3％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出約1-kbp的擴(kuò)增的DNA片段并將其懸浮于5μl無(wú)菌水中。用EcoRI和BamHI(Takara Bio)雙重消化該DNA片段。在1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離所消化的DNA片段，然后提取和純化。將含有H296基因的純化的DNA片段和經(jīng)過(guò)EcoRI和BamHI消化的pCold08s2混合，并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將二者連接。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并使轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從所得克隆制備質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇其中已經(jīng)正確插入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，并命名為pCold08s2-H296。此外，以類似的方式將含有H296基因的擴(kuò)增的DNA片段整合進(jìn)在其5′-UTR中不帶有插入序列的pCold08NC2，獲得pCold08-H296。
(2)-3質(zhì)粒載體pCold08s2-lac的構(gòu)建用BamHI和SalI(Takara Bio)消化包含了β-半乳糖苷酶(lacZ)基因(M.Inouye(ed.)，Experimental Manipulation of GeneExpression，第15-32頁(yè)，1983，New York Academic Press)的質(zhì)粒pKM005。將反應(yīng)混合物在1％(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠中純化出含有l(wèi)acZ基因的DNA片段并將其懸浮于5μl無(wú)菌水中。將純化的DNA片段和經(jīng)過(guò)BamHI和SalI消化的pCold08s2混合，并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將二者連接。用10μl連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并使轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從所得克隆制備質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇其中已經(jīng)正確插入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，并命名為pCold08s2-lac。此外，以類似的方式將含有l(wèi)acZ基因的擴(kuò)增的DNA片段整合進(jìn)在其5′-UTR中不帶有插入序列的pCold08NC2，獲得pCold08-lac。
(3)評(píng)估表達(dá)水平(3)-1評(píng)估利用pCold08s2-GFP和pCold08s2-H296的表達(dá)水平用pCold08s2-GFP(實(shí)施例1-(2)-1中制備)或pCold08s2-H296(實(shí)施例1-(2)-2中制備)或作為對(duì)照的pCold08-GFP或pCold08-H296轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(Novagen)或CL83(J.Bacteriol.，18090-95(1998))。在2.5ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種各轉(zhuǎn)化體，并于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物以1％(v/v)的濃度接種于3ml相同的培養(yǎng)基中，并于37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)混濁度(OD600am)達(dá)到0.2時(shí)，將培養(yǎng)溫度下調(diào)至15℃，并在該溫度下繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。然后，向其中添加終濃度為1mM的IPTG，將培養(yǎng)溫度保持在15℃時(shí)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)定混濁度(OD600am)后，將從2ml培養(yǎng)物離心收集的細(xì)胞懸浮于100μl細(xì)胞懸浮液(50mM tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)，150mM氯化鈉)中。將對(duì)應(yīng)于約3.75×106細(xì)胞(根據(jù)混濁度計(jì)算)的懸浮液在10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色，然后脫色。根據(jù)“Seibutsukagaku Jikken No Tebiki 2”(Kagakudojin)中所述的實(shí)施SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。用Total Lab ver.1.11(NonlinearDynamics)對(duì)凝膠做圖像分析，以定量GFP和H296的表達(dá)水平。對(duì)帶有pCold08s2-GFP和pCold08s2-H296的重組體測(cè)定的蛋白表達(dá)水平和對(duì)帶有在其5′-UTR中沒(méi)有插入片段的pCold08-GFP和pCold08-H296的重組體測(cè)定的蛋白表達(dá)水平之間的比率示于表1。
表1

*表達(dá)率pCold08s2克隆的表達(dá)水平/pCold08克隆的表達(dá)水平，根據(jù)圖像分析結(jié)果計(jì)算。
根據(jù)表1顯示的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，用在其5′-UTR中插入有20個(gè)核苷酸的載體pCold08s2制備的克隆的表達(dá)水平，高于用pCold08NC2制備的克隆的表達(dá)水平。
(3)-2評(píng)估利用pCold08s2-lac的表達(dá)水平用pCold08s2-lac(實(shí)施例1-(2)-3中制備的)或作為對(duì)照的pCold08-lac轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21或CL83。在2.5ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種各轉(zhuǎn)化體，并于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物以1％(v/v)的濃度接種于3ml相同的培養(yǎng)基中，并于37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)混濁度(OD600nm)達(dá)到0.2時(shí)，從培養(yǎng)物中提取樣品，將培養(yǎng)溫度下調(diào)至15℃，并在該溫度下繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。然后，向其中添加終濃度為1mM的IPTG以誘導(dǎo)表達(dá)，將培養(yǎng)溫度保持在15℃時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)J.H.Miller，Experiments in MolecularGenetics，pp.352-355，1972，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法，將從臨誘導(dǎo)前37℃的培養(yǎng)物以及誘導(dǎo)后3或24個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)物中提取的樣品進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的測(cè)量。結(jié)果示于表2。
表2β-半乳糖苷酶活性(單位)

如表2所示，誘導(dǎo)后24小時(shí)，包含在5′-UTR中插入有20個(gè)核苷酸的pCold08s2-lac的轉(zhuǎn)化體的β-半乳糖苷酶活性高于(1.4倍(宿主BL21)或2.3倍(宿主CL83))包含pCold08-lac的轉(zhuǎn)化體的β-半乳糖苷酶活性。
實(shí)施例2載體pCold08s12和pCold08s32的構(gòu)建以及蛋白表達(dá)水平的研究(1)質(zhì)粒載體pCold08s12的構(gòu)建除了用引物Sp12F(SEQ ID NO15)和Sp12R(SEQ ID NO16)替代引物Sp20F和CSPterR之外，按照實(shí)施例1-(1)所述構(gòu)建質(zhì)粒pCold08s12。在質(zhì)粒pCold08s12中，向來(lái)自參考實(shí)施例1的質(zhì)粒pCold08NC25′-UTR-編碼部分中導(dǎo)入了12個(gè)核苷酸的插入突變。
在pCold08s12中，在pCold08NC25′-UTR(SEQ ID NO5)的+120和+121間插入了核苷酸序列5′-ATGTTTTGTAGA-3′(SEQ IDNO17)。包含在pCold08s12中的5′-UTR核苷酸序列示于SEQ IDNO3。
(2)質(zhì)粒載體pCold08s32的構(gòu)建除了用引物Sp32F(SEQ ID NO18)和Sp32R(SEQ ID NO19)替代引物Sp20F和Sp20R之外，按照實(shí)施例1-(1)所述構(gòu)建質(zhì)粒pCold08s32。在質(zhì)粒pCold08s32中，向來(lái)自參考實(shí)施例1的質(zhì)粒pCold08NC25′-UTR-編碼部分中導(dǎo)入了32個(gè)核苷酸的插入突變。
在pCold08s32中，在pCold08NC25′-UTR(SEQ ID NO5)的+120和+121間插入了核苷酸序列5′-ATGTTTTGTAGATTTGAAAGAGTAGATTAGTA-3′(SEQ IDNO20)。包含在pCold08s32中的5′-UTR核苷酸序列示于SEQ IDNO5。
(3)質(zhì)粒載體pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的構(gòu)建用EcoRI和BamHI雙重消化如實(shí)施例1-(2)-1所述制備的、含有H296基因的約1-kbp的DNA片段。在1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離所消化的DNA片段，然后提取和純化。將純化的DNA片段和經(jīng)過(guò)EcoRI和BamHI消化的pCold08s12或pCold08s32混合，并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將二者連接。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并使轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從所得克隆制備質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序。選擇其中已經(jīng)正確插入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，并命名為pCold08s12-H296和pCold08s32-H296。
(4)評(píng)估使用pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的表達(dá)水平用上述(3)中制備的pCold08s12-H296或pCold08s32-H296或作為對(duì)照的pCold08-H296轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21或CL83。在2.5ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種各轉(zhuǎn)化體，并于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物以1％(v/v)的濃度接種于3ml相同的培養(yǎng)基中，并于37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)混濁度(OD600nm)達(dá)到0.2時(shí)，將培養(yǎng)溫度下調(diào)至15℃，并在該溫度下繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。然后，向其中添加終濃度為1mM的IPTG，將培養(yǎng)溫度保持在15℃時(shí)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。為如實(shí)施例1-(3)-1中所述獲得的培養(yǎng)物定量各重組體的H296表達(dá)水平。對(duì)帶有pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的重組體測(cè)定的蛋白表達(dá)水平和對(duì)帶有在其5′-UTR中沒(méi)有插入片段的pCold08-H296的重組體測(cè)定的蛋白表達(dá)水平之間的比率示于表3。
表3

*表達(dá)率pCold08s12或pColds32克隆的表達(dá)水平/pCold08克隆的表達(dá)水平，根據(jù)圖像分析結(jié)果計(jì)算。
SDS聚丙烯酰胺凝膠分析結(jié)果證實(shí)，與用不帶插入片段的載體觀察到的表達(dá)水平相比，用在其5′-UTR中插入有12或32個(gè)核苷酸的載體觀察到的表達(dá)水平得到提高。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種在低溫條件下導(dǎo)致高表達(dá)效率的表達(dá)載體。利用該載體有可能特異性表達(dá)目的蛋白從而制備高純度的蛋白制劑。此外，通過(guò)利用該載體在低溫條件下表達(dá)蛋白，有可能有效地獲得保持其活性的蛋白。
序列表說(shuō)明SEQ ID NO2修飾的cspA基因5′非翻譯區(qū)SEQ ID NO3修飾的cspA基因5′非翻譯區(qū)SEQ ID NO4修飾的cspA基因5′非翻譯區(qū)SEQ ID NO5修飾的cspA基因5′非翻譯區(qū)SEQ ID NO6合成的PCR引物SEQ ID NO7合成的PCR引物SEQ ID NO8合成的PCR引物SEQ ID NO9合成的PCR引物SEQ ID NO10插入cspA基因5′非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸SEQ ID NO11合成的PCR引物SEQ ID NO12合成的PCR引物
SEQ ID NO13合成的PCR引物SEQ ID NO14合成的PCR引物SEQ ID NO15合成的PCR引物SEQ ID NO16合成的PCR引物SEQ ID NO17插入cspA基因5′非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸SEQ ID NO18合成的PCR引物SEQ ID NO19合成的PCR引物SEQ ID NO20插入cspA基因5′非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>冷誘導(dǎo)的表達(dá)載體<130>664200<150>JP 2002-359956<151>2002-12-11<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1209<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa 60agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca120gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg180gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa240ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat300tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc360tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata420attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc480attaaagcag tgtagtaagg caagtccctt caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg540cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta600attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg660ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact720tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca780ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg taatctctgc840ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag900gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg960gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct1020tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc1080aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact1140attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttgattt cacgagtatg1200tactgcacc1209
<210>2<211>164<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的cspA基因5’非翻譯區(qū)<400>2aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120cgagcggata acaatttcac attaattatt aaaggtaata cacc 164<210>3<211>156<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的cspA基因5’非翻譯區(qū)<400>3aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120catgttttgt agattaatta ttaaaggtaa tacacc 156<210>4<211>176<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的cspA基因5’非翻譯區(qū)<400>4aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120catgttttgt agatttgaaa gagtagatta gtattaatta ttaaaggtaa tacacc 176<210>5<211>144
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的cspA基因5’非翻譯區(qū)<400>5aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120cttaattatt aaaggtaata cacc144<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>6gtgcggataa caatttcaca ttaattatta aaggtaatac 40<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>7tgcgcattct cattgcaccc 20<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物
<400>8tgtgaaattg ttatccgctc gtgtgccttt cggcgatatg 40<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>9gttttcccgc tagccaaatt gtgagcggat a 31<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入cspA基因5’非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸<400>10gagcggataa caatttcaca20<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>11aagataacaa aggaattcga gtaaaggaga agaacttt38<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的PCR引物<400>12tctggacatt ctagattatt tgtatagttc atccatg 37<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>13ccatccatgg aattcggcta ttcctgcacc aactga 36<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>14gaaaacctag gatccttatg tggaaggaac atccaa 36<210>15<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>15catatcgccg aaaggcacac atgttttgta gattaattat taaaggtaat ac 52
<210>16<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>16gtattacctt taataattaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg 52<210>17<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入cspA基因5’非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸<400>17atgttttgta ga12<210>18<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物<400>18atgttttgta gatttgaaag agtagattag tattaattat taaaggtaat ac52<210>19<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的PCR引物
<400>19tactaatcta ctctttcaaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg52<210>20<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>插入cspA基因5’非翻譯區(qū)中的合成的核苷酸<400>20atgttttgta gatttgaaag agtagattag ta 3權(quán)利要求
1.具有編碼源自冷休克蛋白基因mRNA的5′-非翻譯區(qū)的部分的載體，其中向該5′-非翻譯區(qū)中導(dǎo)入了突變從而使得在所述區(qū)域中形成的莖結(jié)構(gòu)間的距離發(fā)生改變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所導(dǎo)入的突變是核苷酸插入或缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的載體，其中將突變導(dǎo)入對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO1的核苷酸593至核苷酸598的區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之中任一項(xiàng)的載體，其中編碼5′-非翻譯區(qū)的部分還具有操縱基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中編碼5′-非翻譯區(qū)的部分是編碼具有SEQ ID NO2、3或4的核苷酸序列的5′-非翻譯區(qū)的部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之中任一項(xiàng)的載體，它具有位于編碼5′-非翻譯區(qū)的部分的上游的啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之中任一項(xiàng)的載體，它具有一段與所使用宿主的核糖體RNA中的反義-下游盒序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于編碼5′-非翻譯區(qū)的部分的下游。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之中任一項(xiàng)的載體，它是質(zhì)粒載體。
9.表達(dá)目的蛋白的方法，該方法包括(1)用根據(jù)權(quán)利要求1至8之中任一項(xiàng)所定義的載體轉(zhuǎn)化宿主以獲得轉(zhuǎn)化體，在所述載體中已經(jīng)整合了編碼目的蛋白的基因；(2)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體；和(3)將培養(yǎng)溫度下調(diào)至低于常規(guī)溫度以表達(dá)目的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(3)中或在步驟(3)后誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
全文摘要
具有編碼冷休克蛋白基因mRNA－起源的5′－非翻譯區(qū)的區(qū)域的載體，其特征在于，該5′－非翻譯區(qū)具有一個(gè)轉(zhuǎn)移到其中的突變，從而改變由該區(qū)域所形成的莖結(jié)構(gòu)之間的距離。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1748027SQ20038010967
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者友野潤(rùn), H·上野, 岸本真幸, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社