抗體表達載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，以構(gòu)建一個適用于大容量抗體庫的噬菌體抗體表達載體，通過插入人工合成寡核昔酸、PCR介導(dǎo)的定位突變等技術(shù)，將載體p3MH進行改造，使之更適于構(gòu)建大容量抗體庫。
【專利說明】抗體表達載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種表達載體的構(gòu)建方法，具體涉及一種抗體表達載體的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，治療性抗體的研發(fā)取得了突破性的進展，使得治療性人單抗的研制成為生物【技術(shù)領(lǐng)域】的熱點。大容量抗體庫是制備人單抗的重要技術(shù)平臺，一個具有良好多樣性的大容量噬菌體抗體庫可以提供有效的獲取各種人源抗體的可靠手段。但構(gòu)建性能良好的大容量抗體庫具有很高難度，需采取更好的技術(shù)路線并具備性能優(yōu)越的表達載體。在抗體庫技術(shù)應(yīng)用過程中，人們認識到以下因素對抗體庫的構(gòu)建至關(guān)重要，首先由于細菌轉(zhuǎn)化效率的限制，達到109以上的庫容需很大的工作量，為決這一難題，有人提出了利用定位重組系統(tǒng)構(gòu)建大容量抗體庫的技術(shù)，因此需要適用于此系統(tǒng)的載體，而且不同的抗體基因在大腸桿菌的本底表達對細菌的生長有不同的毒性作用，影響細菌的生長，從而使抗體庫在擴增過程中多樣性越來越差，此外，在克隆抗體基因的過程中，如選用的限制性內(nèi)切酶不當(dāng)，也可因?qū)⒖贵w基因切斷而影響抗體庫的多樣性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提出了一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，不但能夠保證抗體庫大的庫容量，并且避免了抗體庫擴增過程中的多樣性喪失。
[0004]為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，在將表達載體？3冊！改造為？八1過程中，使用兩種0嫩操作，其特征在于，包括以下步驟:
[0006](1)表達載體的構(gòu)建；
[0007](2)噬菌體的制備和滴定；
[0008](3)抗體基因的細胞內(nèi)重組；
[0009](4)酶聯(lián)免疫吸附劑測定。
[0010]進一步，所述表達載體冊I為本實驗室在^0183?的基礎(chǔ)上改造而成。
[0011]進一步，所述步驟⑴具體包括:在載體中插入人工合成的寡核苷酸和通過？(?介導(dǎo)的定位突變改造載體中的特定序列。
[0012]進一步，所述步驟⑵具體包括:挑選含有適當(dāng)載體的單集落菌，接種到含氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)基中。
[0013]進一步，所述步驟(3)具體包括:挑選單集落831365菌，在含有卡那霉素和葡萄糖的培養(yǎng)液中生長至對數(shù)增長期，通過稀釋鋪盤計數(shù)每毫升所含細菌數(shù)，將兩種噬菌體混合。
[0014]進一步，所述步驟(4)具體包括:將冊8^用碳酸鹽溶液稀釋，擱置12小時，假如待測噬菌體樣本，在37度下孵育一小時，加0？0底物顯色，讀取八490值。
[0015]進一步，介導(dǎo)的定位突變的操作步驟為:設(shè)計合成含有預(yù)期突變序列和適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化后，與相同內(nèi)切酶消化的載體常規(guī)連接，連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪盤選單集落提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶分析鑒定正確。
[0016]本發(fā)明提出了一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，不但能夠保證抗體庫大的庫容量，并且避免了抗體庫擴增過程中的多樣性喪失。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0018]圖1是載體改造所合成的中藥引物列表；
[0019]圖2是冊I和13從載體的比較示意圖；
[0020]圖3是]3從的內(nèi)切酶圖譜鑒定圖；
[0021]圖4是所表達的噬菌體抗體的￡13八檢測結(jié)果。
[0022]圖5是和擬在(^1365菌中的重組結(jié)果。
[0023]圖中數(shù)字和字母所表示的相應(yīng)部件名稱:

【具體實施方式】
[0024]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。
[0025]本發(fā)明提高了一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，在將表達載體？3冊！改造為？八1過程中，使用兩種0嫩操作，包括以下步驟:
[0026](1)表達載體的構(gòu)建；
[0027](2)噬菌體的制備和滴定；
[0028](3)抗體基因的細胞內(nèi)重組；
[0029](4)酶聯(lián)免疫吸附劑測定。
[0030]所述表達載體冊I為本實驗室在^0183?的基礎(chǔ)上改造而成；步驟(1)具體包括:在載體中插入人工合成的寡核苷酸和通過？⑶介導(dǎo)的定位突變改造載體中的特定序列；步驟(2)具體包括:挑選含有適當(dāng)載體的單集落菌，接種到含氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)基中；步驟(3)具體包括:挑選單集落831365菌，在含有卡那霉素和葡萄糖的培養(yǎng)液中生長至對數(shù)增長期，通過稀釋鋪盤計數(shù)每毫升所含細菌數(shù)，將兩種噬菌體混合；步驟(4)具體包括:將冊8^用碳酸鹽溶液稀釋，擱置12小時，假如待測噬菌體樣本，在37度下孵育一小時，加0？0底物顯色，讀取八490值介導(dǎo)的定位突變的操作步驟為:設(shè)計合成含有預(yù)期突變序列和適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化后，與相同內(nèi)切酶消化的載體常規(guī)連接，連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪盤選單集落提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶分析鑒定正確。
[0031]為了獲得能用于定位重組系統(tǒng)，適合于構(gòu)建大容量抗體庫的噬菌體抗體表達載體，我們對？3冊！載體進行了重大改良，所構(gòu)建的載體命名為？八I，見圖1，其主要特點如下:在？3冊！輕鏈3’端克隆位點處插入了人工合成的10耶8511序列，在基因III下游的恥111位點處插入了 10鄧序列，這二段序列在蛋白存在的情況下可介導(dǎo)不同載體之間％片段的重組交換；根據(jù)我們對人抗體可變區(qū)胚系基因組內(nèi)切酶譜的分析，選擇了胚系抗體基因中不存在的內(nèi)切酶位點1、#1 I和價^ I作為抗體基因的克隆位點，通過？⑶介導(dǎo)的定位突變，將？3冊I中輕鏈5’端的克隆位點由&^ I改為888? II，將？(1段5’和3’端的克隆位點由乂110 1和邰6 I改為I和價^ I ；？3冊！中克隆輕鏈和％段的5’端內(nèi)切酶位點均位于可變區(qū)的第一骨架區(qū)，造成抗體分子氨基端某些序列的固定化。而抗體可變區(qū)氨基端的序列有時可對抗體的結(jié)合活性產(chǎn)生重要影響因此我們將這2個克隆位點轉(zhuǎn)移到了細菌前導(dǎo)序列的3’端；為增加啟動子調(diào)控的嚴密性以降低抗體基因的本底表達，增加抗體庫的穩(wěn)定性，我們從載體1^1^88上切下含有阿拉伯糖啟動子的1/20 01？ I片段，取代？3冊！中含有啟動子的？VII 11/2001？ I工片段，更換了驅(qū)動抗體分子表達的啟動子。由于阿拉伯糖啟動子序列中有1個888? II位點，可對將來輕鏈的克隆帶來干擾，我們又用介導(dǎo)的定點突變消除了這個內(nèi)切酶位點。
[0032]為鑒定？從載體，在對？3冊I作了多處重大改動后是否還能表達功能性噬菌體抗體，我們設(shè)計相應(yīng)引物，將一株抗耶8^的人段基因擴增加人適當(dāng)內(nèi)切酶位點后克隆到？從中，得到用其表達噬菌體抗體，21“檢測其與耶8^的結(jié)合活性，結(jié)果見圖5。
[0033]如圖5所示，？31耶可以在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下產(chǎn)生具有抗體活性的噬菌體抗體顆粒，其最佳誘導(dǎo)濃度在知/1左右，如不加人啟動子誘導(dǎo)劑阿拉伯糖，則表達很低，顯示了阿拉伯糖啟動子的控制具有較高的嚴密性。
[0034]大容量抗體庫是研制人源抗體的重要技術(shù)平臺，我們在國外抗體庫技術(shù)進展和自己前期工作體會的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個適用于構(gòu)建大容量抗體庫的表達載體-1，它具有以下特點:在％段的兩端設(shè)計插人了 10^511和10耶序列，這2個序列只有1個堿基的差另I」，在(^6蛋白的介導(dǎo)下，相同序列之間可以發(fā)生重組，而10耶511和10耶之間不發(fā)生重組。由于細菌轉(zhuǎn)化效率低是影響庫容的關(guān)鍵因素，等在1994年就應(yīng)用定位重組系統(tǒng)，通過輕重鏈可變區(qū)基因的組合配對，構(gòu)建大容量抗體庫，他們使用的雙載體系統(tǒng)穩(wěn)定性差，抗體基因缺失的頻率較高。在此基礎(chǔ)上，我們首次構(gòu)建了可用于單載體單細胞內(nèi)重組的表達載體？4，并通過功能試驗和重組試驗證明？從具有預(yù)期的功能；
[0035]用阿拉伯糖啟動子取代了 [狀啟動子現(xiàn)已公認，一些抗體基因的表達對細菌有不同程度的毒性作用，可抑制宿主菌的生長，而[化啟動子控制嚴密性差，在無誘導(dǎo)劑1？%時有較高的表達，從而抑細菌的生長，在抗體庫的生長擴增過程中可造成抗體庫多樣性的降低。我們的前期工作證明，阿拉伯糖啟動子控制嚴密性優(yōu)于玩啟動子，在抗體庫的生長擴增過程中對抗體庫多樣性的影響小得多，在本工作中，換用阿拉伯糖啟動子后，在培養(yǎng)液中不加阿拉伯糖時，表達很低，也進一步證明了阿拉伯糖啟動子控制的嚴密性；
[0036]選擇了更合理的抗體基因克隆位點，隨著抗體胚系可變區(qū)基因序列的闡明，使人們可以對其內(nèi)切酶譜進行分析，發(fā)現(xiàn)一些目前廣泛應(yīng)用的噬菌體抗體表達載體中內(nèi)切酶位點的選擇不盡合理，我們應(yīng)用％018系列載體就曾遇到過麻煩，因此在？從中選用了抗體胚系可變區(qū)基因中不存在的內(nèi)切酶位點，以保證抗體庫的多樣性。另外，我們在研究中多次發(fā)現(xiàn)抗體可變區(qū)第一骨架區(qū)氨基端的序列對抗體的活性有重要影響，將克隆位點設(shè)計在可變區(qū)第一骨架區(qū)無疑會影響抗體的性能，因此我們在？從中將抗體基因5’端的克隆位點改造到了細菌前導(dǎo)序列的3’端，由于抗體在分泌表達時前導(dǎo)序列被切除，從而克隆位點的內(nèi)切酶序列不會影響到成熟抗體分子氨基端的序列；
[0037]1)從在構(gòu)建后經(jīng)檢測，具有正常的噬菌體抗體表達功能，可在(^6細菌中發(fā)生10X15-01-6介導(dǎo)的定位重組，為大容量抗體庫的構(gòu)建提供了有效工具。
[0038]以上為對本發(fā)明所提出的一種抗體表達載體的構(gòu)建方法實施例的描述，對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗體表達載體的構(gòu)建方法，在將表達載體P3MH改造為PAL過程中，使用兩種DNA操作，其特征在于，包括以下步驟: (1)表達載體的構(gòu)建； (2)噬菌體的制備和滴定； (3)抗體基因的細胞內(nèi)重組； (4)酶聯(lián)免疫吸附劑測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達載體p3MH為本實驗室在PC0MB3H的基礎(chǔ)上改造而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括:在載體中插入人工合成的寡核苷酸和通過PCR介導(dǎo)的定位突變改造載體中的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括:挑選含有適當(dāng)載體的單集落XL1-BLUE菌，接種到含氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括:挑選單集落BS1365菌，在含有卡那霉素和葡萄糖的培養(yǎng)液中生長至對數(shù)增長期，通過稀釋鋪盤計數(shù)每毫升所含細菌數(shù)，將兩種噬菌體混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(4)具體包括:將HbsAg用碳酸鹽溶液稀釋，擱置12小時，假如待測噬菌體樣本，在37度下孵育一小時，加OPD底物顯色，讀取A490值。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR介導(dǎo)的定位突變的操作步驟為:設(shè)計合成含有預(yù)期突變序列和適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化后，與相同內(nèi)切酶消化的載體常規(guī)連接，連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪盤選單集落提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶分析鑒定正確。
【文檔編號】C12N15/63GK104342449SQ201310340307
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】吳晨衍 申請人:太倉美諾恒康生物技術(shù)有限公司