本發(fā)明屬于生物酶，涉及定向制備?κ-卡拉膠二糖的?κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478。

背景技術(shù)：

1、卡拉膠作為一種硫酸多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用?？ɡz寡糖是其降解產(chǎn)物，與卡拉膠相比，具有分子量更低、溶解度更高的優(yōu)點，同時因其活性基團充分暴露，較降解前活性顯著提高，在生物醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。由于卡拉膠的結(jié)構(gòu)類型多樣，存在多種連接方式和分支形式，經(jīng)過一定的生物技術(shù)處理（如物理降解、氧化降解、酸降解、酶降解、分子修飾）制得的卡拉膠寡糖，其寡糖的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，不同的制備方式所得的寡糖結(jié)構(gòu)、活性各不相同。

2、現(xiàn)有技術(shù)多采用化學(xué)水解制得卡拉膠寡糖，由于化學(xué)水解反應(yīng)過程往往過于劇烈，以至于在水解過程中會造成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的破壞，因此其應(yīng)用受到了極大的限制。而利用卡拉膠酶進行特異性降解的方式由于具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物特異性好等特點，被認為是一種具有廣闊前景的制備方法。目前酶解卡拉膠制備卡拉膠寡糖的產(chǎn)物多為二糖、四糖及六糖，甚至含有少量的八糖。因此，開發(fā)卡拉膠酶解制備產(chǎn)物單一的酶解技術(shù)具有重要的研究價值和廣闊的開發(fā)前景，也是卡拉膠工業(yè)高值化發(fā)展的重要方向。

3、本發(fā)明以2023.12.19日公開號為cn117247877a的一株盧氏發(fā)光桿菌及其在制備卡拉膠寡糖中的應(yīng)用公開的盧氏發(fā)光桿菌（ photobacterium?rosenbergii）gdsx-4基因組為模板，對其產(chǎn)酶基因進行pcr擴增。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種可以降解κ-卡拉膠并產(chǎn)生κ-卡拉膠二糖的κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478。該酶能夠定向制備κ-卡拉膠二糖，對κ-卡拉膠二糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

2、為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，一方面，本發(fā)明提供了一種編碼κ-卡拉膠酶的基因，所述基因為 cgk-gdsx478，所述的基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

3、進一步地，本發(fā)明所述基因 cgk-gdsx478來源于盧氏發(fā)光桿菌gdsx-4。

4、進一步地，本發(fā)明提供了一種重組表達載體，本發(fā)明對 cgk-gdsx478和大腸桿菌表達載體pet-28a（+）分別用限制性內(nèi)切酶（ndei-xhoi）雙酶切，將回收的片段連接相同位點酶切的大腸桿菌表達載體得到重組表達載體。

5、另一方面，本發(fā)明請求保護一種重組工程菌，包含上述編碼κ-卡拉膠酶的基因或重組表達載體，重組工程菌的宿主為大腸桿菌，所述大腸桿菌為bl21（de3）。

6、進一步地，本發(fā)明用重組表達載體轉(zhuǎn)化bl21（de3）感受態(tài)細胞，涂布于帶有卡那抗性的lb瓊脂平板，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進行陽性驗證并鑒定測序。將測序正確的的單克隆重新接菌至帶有卡那抗性的lb瓊脂平板，獲得重組工程菌。

7、另一方面，本發(fā)明請求保護一種κ-卡拉膠酶，由上述產(chǎn)κ-卡拉膠酶的基因編碼，或由重組工程菌產(chǎn)生?？ɡz酶為cgk-gdsx478，其氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

8、進一步地，本發(fā)明將重組工程菌于活化后，按體積比1%的接種量接入100ml的含50μg/ml卡那霉素的lb無菌液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，37℃、220rpm，當菌液od600為0.5時，加入0.1mm的iptg，25℃誘導(dǎo)12h。發(fā)酵結(jié)束后，收集培養(yǎng)液于8000rpm/min，離心10min，收集菌體，取上清過0.45μm濾膜，收集粗酶液用ni-nta親和層析進行蛋白純化。純化后的蛋白氨基酸序列如seq?id?no:2所示，經(jīng)sds-page檢測相對分子量約為35kda。

9、本發(fā)明還請求保護κ-卡拉膠酶在定向制備κ-卡拉膠二糖中的應(yīng)用。κ-卡拉膠酶的酶解溫度為4~60℃，酶解ph為3.0~11.0，酶解時間為30~1440min；優(yōu)選地，κ-卡拉膠酶的酶解溫度為40℃，酶解ph為8.0，酶解時間為420min。

10、進一步地，本發(fā)明將κ-卡拉膠酶在4~60℃條件下檢測酶活發(fā)現(xiàn)，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478在4~60℃下均具有較好的相對活性，其最適反應(yīng)溫度為40℃。本發(fā)明使用ph為3.0~11.0的緩沖液溶解卡拉膠后，加入κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478檢測酶活發(fā)現(xiàn)，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478在ph?3.0~11.0的緩沖液體系中較為穩(wěn)定，均能發(fā)揮酶解作用，其最適反應(yīng)ph為8.0。

11、進一步地，本發(fā)明用上述κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478酶解κ-卡拉膠制備κ-卡拉膠寡糖，通過薄層色譜法和液相質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478酶解κ-卡拉膠后的酶解產(chǎn)物為κ-卡拉膠二糖。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具備下述的有益效果或優(yōu)點：

13、本發(fā)明提供的κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478，經(jīng)試驗研究，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478在4~60℃下均具有較好的相對活性，其最適反應(yīng)溫度為40℃。κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478在ph3.0~11.0的緩沖液體系中較為穩(wěn)定，均能發(fā)揮酶解作用，其最適反應(yīng)ph為8.0。本發(fā)明通過薄層色譜法和液相質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478酶解κ-卡拉膠后的酶解產(chǎn)物為κ-卡拉膠二糖。上述結(jié)果表明，κ-卡拉膠酶cgk-gdsx478對κ-卡拉膠具有高的降解活性，且產(chǎn)物具有高度的單一性。本發(fā)明對對κ-卡拉膠二糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種編碼κ-卡拉膠酶的基因，其特征在于，所述基因為cgk-gdsx478，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述cgk-gdsx478來源于盧氏發(fā)光桿菌gdsx-4。

3.一種重組表達載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的編碼κ-卡拉膠酶的基因，將所述編碼κ-卡拉膠酶的基因連接到表達載體上，得到重組表達載體。

4.一種重組工程菌，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的編碼κ-卡拉膠酶的基因或權(quán)利要求3所述的重組表達載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主為大腸桿菌；

6.一種κ-卡拉膠酶，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的編碼κ-卡拉膠酶的基因，或由權(quán)利要求4所述的重組工程菌產(chǎn)生；

7.權(quán)利要求6所述的κ-卡拉膠酶在制備κ-卡拉膠二糖中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述κ-卡拉膠酶的酶解溫度為4~60℃，酶解ph為3.0~11.0，酶解時間為30~1440min。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述κ-卡拉膠酶的酶解溫度為40℃，酶解ph為8.0，酶解時間為420min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了定向制備?κ?卡拉膠二糖的?κ?卡拉膠酶Cgk?GDSX478，屬于生物酶技術(shù)領(lǐng)域。編碼κ?卡拉膠酶的基因Cgk?GDSX478的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其編碼的κ?卡拉膠酶Cgk?GDSX478的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。本發(fā)明還提供了制備κ?卡拉膠二糖的方法：將κ?卡拉膠酶Cgk?GDSX478加入到κ?卡拉膠溶液中，酶解得到κ?卡拉膠二糖，酶解反應(yīng)條件為：溫度為4~70℃，pH為3.0~11.0，時間為30~1440min。本發(fā)明所述κ?卡拉膠酶降解κ?卡拉膠獲得的κ?卡拉膠二糖具有高度單一性，對κ?卡拉膠二糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：鐘賽意,陳菁,劉喚明,曾志飛,蔣亮,劉會平,張學(xué)武,汪卓,張杰良,潘明雪
受保護的技術(shù)使用者：廣東海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21