一種原核融合表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種原核融合表達(dá)載體，其含有下述核苷酸片段，該核苷酸片段由啟動子、編碼PDI伴體蛋白的基因、連接區(qū)串聯(lián)構(gòu)成，其中所述的連接區(qū)含有腸激酶切割位點和多克隆位點。該發(fā)明構(gòu)建載體能以融合蛋白的形式高效表達(dá)外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可溶性好，純化簡易，且具有外源蛋白的天然生物活性。此表達(dá)載體不僅適用于重組蛋白的大量生產(chǎn)，也適用于基因工程產(chǎn)品及生物制劑的研究及生產(chǎn)，同時也可用于對蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系的研究。
【專利說明】一種原核融合表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種原核融合表達(dá)載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]常規(guī)的基因工程的表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)是令克隆的外源基因在原核細(xì)胞中以發(fā)酵的方式快速、高效地合成外源基因表達(dá)產(chǎn)物。原核表達(dá)系統(tǒng)是目前了解最深入、實際應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。
[0003]在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因時，由于實驗設(shè)計的不同，總的來說可產(chǎn)生融合型和非融合型重組蛋白。當(dāng)以非融合方式(即所得重組蛋白的氨基酸序列與目的產(chǎn)物一致)表達(dá)外源基因時，為了避免表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌蛋白酶降解，表達(dá)產(chǎn)物通常以不溶的包涵體形式存在。因為包涵體中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進行變復(fù)性處理。蛋白的復(fù)性是一個極其復(fù)雜的過程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主要制約因素。采用分泌表達(dá)方式可部分克服這一問題，但表達(dá)量卻偏低，實際應(yīng)用也有較大難度。另外，當(dāng)表達(dá)一些分子量較小、二硫鍵較多的蛋白時，非融合表達(dá)系統(tǒng)很難得到有生物學(xué)活性的蛋白。非融合表達(dá)的另一個不利因素就是表達(dá)量差異很大。用相同表達(dá)載體表達(dá)不同的外源蛋白時，表達(dá)量可能有10倍的差異。大量的研究表明，翻譯起始序列(TIR)二級結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)是影響基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之一(Thanaraj TA, Pandit MW.NucleicAcids Res, 1989; 17 (8):2973)。一些外源基因只有通過優(yōu)化TIR的二級結(jié)構(gòu)才能達(dá)到高效表達(dá)(Calvez HL etal.Gene, 1996; 170:51)。這無疑加大了實驗的難度和工作量。為了克服這些困難，融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)運而生。即利用一些特定的融合伴體使之與外源蛋白融合，在原核細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。這些融合伴體包括GST，TRX，lacZ，trpE，DsBA等(Smithetal, Gene, 1988,67:31-40)。融合表達(dá)系統(tǒng)都采用了優(yōu)化的TIR，在表達(dá)量方面高效穩(wěn)定。由于采用的融合伴體多為 來自細(xì)菌的分子伴侶，既可以保護外源蛋白免受細(xì)菌蛋白酶的降解，又能協(xié)助外源蛋白的正確折疊。因此，表達(dá)的融合蛋白的溶解性好，外源蛋白的構(gòu)象更接近于天然蛋白，對于保證其生物學(xué)活性具有極為重要的作用，非常適合于基因的功能研究和重組蛋白的大量生產(chǎn)。當(dāng)然，如想獲得外源蛋白單體，就必須將融合伴體切除。切除融合伴體可采用酶解和化學(xué)裂解法。酶解可供選擇的酶有凝血酶，蛋白酶3C，胰蛋白酶，Xa因子等；化學(xué)裂解常采用澳化氰裂解。
[0004]融合表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢明顯，但也有待完善的地方。如在純化方面，需要有針對融合蛋白的簡易高效的純化措施；在融合伴體的選擇方面，需要有能更好地協(xié)助目的蛋白折疊的分子伴侶；在切割融合伴體的方法上，需要有更高效、切割條件溫和、低成本的切割試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種新型高效的原核融合表達(dá)載體，用于高效地表達(dá)外源基因，使表達(dá)產(chǎn)物可溶性好、純化簡易，且具有外源蛋白的天然生物活性。[0006]為此，本發(fā)明提供了一種原核融合表達(dá)載體，其含有下述核苷酸片段，該核苷酸片段由啟動子、編碼PDI伴體蛋白的基因、連接區(qū)(包括2A區(qū)、腸激酶切割位點和多克隆位點)串聯(lián)構(gòu)成，其中所述的連接區(qū)含有腸激酶切割位點和多克隆位點。
[0007]根據(jù)本發(fā)明提供的表達(dá)載體，所述的核苷酸片段的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]根據(jù)本發(fā)明提供的表達(dá)載體，其采用質(zhì)粒pPDI構(gòu)建。
[0009]本發(fā)明還提供了所述表達(dá)載體在基因工程蛋白重組表達(dá)中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供了上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其步驟如下:
[0011](I)PDI基因的PCR擴增
[0012]利用PCR方法，以線紋芋螺cDNA為模板擴增PDI基因，根據(jù)計算機軟件對RACE結(jié)果分析，設(shè)計并合成了一對引物:
[0013]上游引物為5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3，，
[0014]下游引物為5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’。
[0015]在上下游引物中加入Nhel、BamH I酶切識別序列，進行PCR反應(yīng)；
[0016]PCR反應(yīng)參照Takara系統(tǒng)方法進行。
[0017](2)含PDI基因的轉(zhuǎn)移載體pGEM-PDI的構(gòu)建
[0018]將上述PCR擴增`的PDI基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，再經(jīng)Nhe I和BamH I雙切后插入到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pGEM-easy的TA缺口，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pGEM-PDI ；
[0019](3)連接區(qū)LINKER的構(gòu)建
[0020]根據(jù)Linker區(qū)的序列:
[0021]SftICC Caa tgt act aac tac get ttg ttg aaa ctc get ggc gat gtt gaa agtaac ccc ggt cct gat gat gat gat aaa fiifiCTC
[0022]合成互補的4條寡聚核甘酸片段:
[0023]BamH-2A+EK-lF:GATCCCAATGTACTAACTACGCTTTGTTGAAACTCGCTGGCG ；
[0024]2A+EK-sacl-2R:ATGTTGAAAGTAACCCCGGTCCTGATGATGATGATAAAGAGCT ；
[0025]bamHl-2A+EK-3R:CAACATCGCCAGCGAGTTTCAACAAAGCGTAGTTAGTACATTGG ；
[0026]2A+EK-sacl-4F:CTTTATCATCATCATCAGGACCGGGGTTACTTT ；
[0027]上述寡聚核甘酸片段經(jīng)變性、退火、延伸得雙鏈Linker序列，二者同時插入到pET28a的Ndel和Sac I酶切窗口，構(gòu)建成融合表達(dá)載體pPDI。
[0028]本發(fā)明還采用RT-PCR的方法，從線紋芋螺cDNA中克隆到的二硫鍵異構(gòu)酶基因作為融合表達(dá)伴體在基因工程重組表達(dá)中的應(yīng)用，其DNA堿基序列如SEQ ID NO:2所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0029]本發(fā)明采用一種芋螺種屬分子伴侶F1DI (protein disulfide isomerase,蛋白二硫鍵異構(gòu)酶)作為融合伴體。PDI基因是通過PCR的方法，從線紋芋螺中擴增而得。PDI是大腸桿菌的一種分子伴侶，在細(xì)胞內(nèi)能協(xié)助蛋白的正確折疊。來自海洋生物芋螺的PDI分子量約為58kD，其構(gòu)象嚴(yán)緊，熱穩(wěn)定性好，甚至可耐受50°C的高溫。研究表明，PDI在細(xì)胞內(nèi)會以分子伴侶的形式協(xié)助目的蛋白折疊。2000年日本科學(xué)家在短芽孢桿菌內(nèi)使用PDI融合表達(dá)體系，提高了蛋白胞外表達(dá)(T.KajinO，etc2000)。PDI的這些特性非常適合于作為外源蛋白的融合表達(dá)伴體。[0030]本發(fā)明所述表達(dá)載體含有堿基序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸片段，其中的啟動子可以是T7啟動子，它是載體的一個結(jié)構(gòu)元件，也可用其它強啟動子如Tac、Lac等代替。
[0031]本發(fā)明PDI位點之后還設(shè)計了腸激酶的切割位點。融合蛋白表達(dá)體系必須面對的一個問題是如何有效切除伴體蛋白而獲得目的蛋白單體。腸激酶是一種絲氨酸蛋白酶，它能特異地識別肽鏈中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五個氨基酸殘基,切割點在Lys的梭基端。相對于其它切割酶，腸激酶具有識別特異性強、切割效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點。由于腸激酶的切割位點在識別位點的梭基末端，因而切割下來的外源蛋白在氨基端無額外的氨基酸，從而使其氨基酸序列與天然蛋白完全一致。
[0032]本發(fā)明在PDI序列的上游設(shè)計了 6個組氨酸的純化標(biāo)簽。組氨酸能提供配位電子和一些金屬離子如Ni2+鰲合位點。6個連續(xù)的組氨酸可以使蛋白吸附于含金屬Ni2+的層析填料上，因而可以利用金屬鰲和層析來純化融合蛋白，從而簡化蛋白純化工作。
[0033]實驗結(jié)果表明，本發(fā)明應(yīng)用pPDI構(gòu)建的pPDI_ltl4a載體，表達(dá)的融合蛋白95%以上可溶。本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白載體PPDI可應(yīng)用于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。該發(fā)明構(gòu)建載體能以融合蛋白的形式高效表達(dá)外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可溶性好，純化簡易，且具有外源蛋白的天然生物活性。此表達(dá)載體不僅適用于重組蛋白的大量生產(chǎn)，也適用于基因工程產(chǎn)品及生物制劑的研究及生產(chǎn)，同時也可用于對蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系的研究。
[0034]本發(fā)明的載體的復(fù)制方法:參照Sambrook (Sambrook, etal.1989.Molecularcloning.Cold spring Harbor Laboratory Press.USA)方法，按 CaC1:法在 E.coli DH5a或E.coli JMlOl菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含卡那霉素(30ug/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是本發(fā)明的載體從啟動子至多克隆位點的序列。其中，無下劃線為PDI基因序列，單下劃線“―”為6His序列，雙下劃線“_”為EK腸激酶酶切位點，曲線“―”為多克隆位點。
[0036]圖2是PDI基因的PCR擴增產(chǎn)物示意圖，其中泳道I是線紋芋螺cDNA模板所得的PCR產(chǎn)物，泳道2是Takara公司的DL200Marker。
[0037]圖3是融合表達(dá)載體pPDI的構(gòu)建示意圖。
[0038]圖4是母載體pET28a的物理圖譜。
[0039]圖5是利用pPDI表達(dá)pPDI_ltl4a融合蛋白及純化的SD S-PAGE示意圖，其中M為蛋白Marker，I為誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)后，3為超聲沉淀，4為超聲上清，5_9為用Ni2+ChelatingSepharose親和層析柱梯度洗脫的PDI_ltl4a融合蛋白。
[0040]圖6是pPDI_ltl4a酶切鑒定。I為進一步純化的pPDI_ltl4a融合蛋白，2為用腸激酶切割TRX/PLA2融合蛋白，3為無腸激酶的陰性對照，M為蛋白marker。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0042]實施例一、融合表達(dá)載體pPDI的構(gòu)建[0043]1.PDI基因的PCR擴增
[0044]PDI是從芋螺cDNA文庫中獲取，因此，利用PCR方法，以線紋芋螺cDNA為模板擴增PDI基因。根據(jù)計算機軟件對RACE結(jié)果分析，設(shè)計并合成了一對引物:
[0045]上游引物為5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3’，
[0046]下游引物為5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’。
[0047]為方便克隆，分別在上下游引物中加入Nhe1、BamH I酶切識別序列。
[0048]PCR反應(yīng)參照Takara系統(tǒng)方法進行。
[0049]2.含PDI基因的轉(zhuǎn)移載體pGEM-PDI的構(gòu)建
[0050]PCR擴增的PDI基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，再經(jīng)Nhe I和BamH I雙切后插入到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pGEM-easy的TA缺口，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pGEM_PDI，質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖3。
[0051]3.連接區(qū)LINKER的構(gòu)建
[0052]首先，根據(jù)Linker區(qū)的序列:
[0053]臟 TCC Caa tRt act aac tac Rct ttR ttR aaa ctc Rct rrc Rat Rtt Raa agtaac ccc ggt cct gat gat gat gat aaa 6A6CTC
[0054]合成互補的4條寡聚核甘酸片段: [0055]
【權(quán)利要求】
1.一種原核融合表達(dá)載體，其含有下述核苷酸片段，該核苷酸片段由啟動子、編碼F1DI伴體蛋白的基因、連接區(qū)串聯(lián)構(gòu)成，其中所述的連接區(qū)含有腸激酶切割位點和多克隆位點。
2.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的核苷酸片段的堿基序列如SEQID NO:1 所示。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于采用質(zhì)粒pPDI構(gòu)建。
4.構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述表達(dá)載體的方法，其步驟如下: (1)PDI基因的PCR擴增 利用PCR方法，以線紋芋螺cDNA為模板擴增PDI基因，根據(jù)計算機軟件對RACE結(jié)果分析，設(shè)計并合成了一對引物: 上游引物為 5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3，， 下游引物為 5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’ ； 在上下游引物中加入Nhel、BamH I酶切識別序列，進行PCR反應(yīng)； PCR反應(yīng)參照Takara系統(tǒng)方法進行； (2)含PDI基因的轉(zhuǎn)移載體pGEM-PDI的構(gòu)建 將上述PCR擴增的PDI基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，再經(jīng)Nhe I和BamH I雙切后插入到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pGEM-easy的TA缺口，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pGEM_PDI ； (3)連接區(qū)LINKER的構(gòu)建` 根據(jù)Linker區(qū)的序列:`
6ftTCC Caa tgt act aac tac get ttg ttg aaa ctc get ggc gat gtt gaa agt aacccc ggt cct gat gat gat gat aaa SSOC合成互補的4條寡聚核甘酸片段:
BamH-2A+EK-lF:GATCCCAATGTACTAACTACGCTTTGTTGAAACTCGCTGGCG ；
2A+EK-sacl-2R:ATGTTGAAAGTAACCCCGGTCCTGATGATGATGATAAAGAGCT ；
bamHl-2A+EK-3R:CAACATCGCCAGCGAGTTTCAACAAAGCGTAGTTAGTACATTGG ；
2A+EK-sacl-4F:CTTTATCATCATCATCAGGACCGGGGTTACTTT ； 上述寡聚核甘酸片段經(jīng)變性、退火、延伸得雙鏈Linker序列，二者同時插入到pET28a的Ndel和Sac I酶切窗口，構(gòu)建成融合表達(dá)載體pPDI。
5.權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體在基因工程蛋白重組表達(dá)中的應(yīng)用。
6.采用RT-PCR的方法，從線紋芋螺cDNA中克隆到的二硫鍵異構(gòu)酶基因作為融合表達(dá)伴體在基因工程重組表達(dá)中的應(yīng)用，其DNA堿基序列如SEQ ID NO:2所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
【文檔編號】C12N15/10GK103710373SQ201310754150
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】徐安龍, 王磊, 任政華, 王曉敏, 唐煒, 鄒帆, 陳尚武 申請人:中山大學(xué)