專利名稱：一種便于外源蛋白純化的原核表達載體及構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種便于進行外源蛋白表達純化的原核 表達載體的構建方法及應用示范。
背景技術：
利用原核表達系統體外表達某些特定的蛋白是常用的蛋白生產手段之一，其最大 的優(yōu)點為蛋白產量高、操作簡便，目前已有不少成熟的原核表達系統。傳統的重組蛋白表達 與純化通常是在目的蛋白前或后加上特定的標簽(如GST tag、His tag等)，形成的融合蛋 白可借助蛋白標簽進行親和層析，層析柱價格昂貴，使得蛋白純化成本較高，且純化的融合 蛋白往往需進行體外裂解去除蛋白標簽后才能獲得很好生物學活性的目的蛋白，常用的裂 解方法主要有化學裂解法(如溴化氰、羥胺、BNPS-3-甲基吲哚等)和酶解法(如fe因子、凝 血酶、腸激酶、膠原酶、凝乳酶等)?；瘜W裂解雖價廉、有效，但由于裂解位點特異性低，還可 能對目的蛋白產生不必要的修飾，該方法逐漸被酶解法代替，而酶解去除標簽，所用的裂解 酶價格不但高，還不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白純化更加復雜。由 于上述原因，最終獲得均一的目的蛋白成本高、周期長，成為制約體外規(guī)?；a目的蛋白 的瓶頸性問題。內含肽(Intein)是蛋白質前體內的肽段，在蛋白質成熟過程中通過精準的自我剪 切以及兩側序列的拼接，從而實現宿主蛋白的成熟。1987年號Neurospora crassa液泡ATP 酶中最早被發(fā)現，1989年以后才被Anraku實驗室逐漸證實其功能，目前已經發(fā)現210個以 上的內含肽，主要分布在低等真核生物、細菌以及病毒的蛋白質中。隨著對內含肽剪接機 制的深入研究，在蛋白質工程及其他生物技術領域表現出越來越廣闊的應用前景，尤其蛋 白純化方面，內含肽的發(fā)現和應用使得重組蛋白的表達和純化得到大大改進，將其與其它 蛋白標簽，如CBD (Chitin-binding dimain)融合，可通過親和層析等方法獲得融合蛋白， 再利用內含肽的自我剪切功能獲得不含任何外源序列的目的蛋白。目前已構建成功多個 內含肽的突變體，可以使得其在特定的條件下(如特定溫度，加入硫醇等)發(fā)生一側性剪切， 大大提高蛋白純化效率和純度，通過親和層析和內含肽介導的方法，Mills等人成功純化出 QACA蛋白，^iao等人成功純化出綠色熒光蛋白。雖然該方法操作簡便，但仍需要使用價格 較高的親和層析柱，這將重組蛋白的生產成本又推至一定的高度。

發(fā)明內容
為了解決現有技術的問題，本發(fā)明提供一種新的原核表達載體，該載體適用于外 源重組蛋白的表達、純化，且純化操作簡便、純化成本低，對重組蛋白的規(guī)?；a有著很 好的應用前景。本發(fā)明所說的原核表達載體是pET-EM，它是在pET30a基礎上引入合適的多克隆 位點及Mxe gyrA內含肽、ELP基因，構建得到的新原核表達載體，pET_EM結構如圖1所示。本發(fā)明還公開了 pET-EM的構建方法，具體包括以下步驟1)用限制性核酸內切酶酶切載體pET30a，大片段連接后，獲得載體 pET30a'；
2)引物設計及基因擴增
a.根據MxegyrA內含肽設計一對正反向引物Pl和P2，
Pl 5' -TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA TCACGGGA-3，(SEQ ID NO. 1)；
P2 :5，-TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3‘ (SEQ ID NO. 2)； 其中Pl的5’端引入MfeI、^/7l、Afc0I、MeI、i^I、5^7l限制性核酸內切酶酶切位點， 該些酶切位點構成一多克隆位點，供外源基因的插入；P2的5’端引入feoRV限制性核酸內 切酶酶切位點，為構建質粒提供連接端；
b.在P1、P2的作用下，以pYTBll質粒為模板擴增出MxegyrA基因；
3)將擴增的MxegyrA基因，經Ndel、Ecom限制性內切酶酶切后連入載體pET_30a’ 相應的位點，構建載體pET-M ；
mdel限制性內切酶酶切pET-EI-GFP質粒，末端補平后，用5^1酶切，獲得的DNA片 段與5^1和雙酶切的pET-M載體連接，構建攜帶多克隆位點、Mxe gyrA內含肽及ELP 基因的重組載體pET-EM。上述方法步驟1)中Sapl和/^_/1酶切后獲得的大片段及步驟4)中MfeI限制性 內切酶酶切產物用Klenow大片段DNA聚合酶補平其粘性突出端。上述方法中步驟1)、3)、4)連接時所用的DNA連接酶為T4 DNA連接酶。彈性蛋白樣多肽(Elastin-likepolyp印tide, ELP)是一 VPGXG (X 可為任何 氨基酸)五肽組成重復序列，當孵育溫度高于相變溫度(Phase transition temperature, Tt)時，可自發(fā)地從溶液中沉淀析出，而低于八時則呈現可溶狀態(tài)，當與其他蛋白融合在 一起時，仍具有該特性。本發(fā)明利用基因工程技術，將編碼目的蛋白基因、內含肽基因以及 ELP基因串聯，構建原核表達載體，在大腸桿菌宿主菌中誘導表達三聯融合蛋白，超聲波破 碎菌體后，低溫離心，去除菌體碎片及不溶性蛋白，通過升溫使ELP-內含肽-目的蛋白析 出，離心去除可溶性的菌體雜蛋白，重復此過程可獲得較純凈的重組融合蛋白。再利用內含 肽在特定條件下的自我剪切活性及ELP融合蛋白的生物特性，經溫控離心可將目的蛋白和 ELP-內含肽融合蛋白分離，從而獲得純化的目的蛋白。該過程操作簡單，不需要昂貴的親和 層析柱和裂解酶，有效避免去除蛋白標簽時酶蛋白的污染，大大降低了重組蛋白生產成本， 尤其是規(guī)模化生產。


圖1.載體PET-EM結構示意圖。圖2.載體pET-EM構建流程圖。圖 3. PCR 擴增 K205R 基因
M =DNA分子質量標準；1 :PVR產物。圖4.重組載體pET-EM-K205R的PCR鑒定，
M1、M2 =DNA分子質量標準；1 重組質粒；2 空載體對照；3 滅菌水對照。圖5. SDS-PAGE電泳分析蛋白表達、純化
4M 蛋白分子質量標準；1 未剪切前的蛋白前體；2 剪切后離心沉淀物；3 剪切離心上清液。圖 6. Western blotting 鑒定純化 K205R 蛋白
1 未裂解融合蛋白；2 裂解后的沉淀；3 裂解后的上清。
具體實施例方式本發(fā)明中所涉及的生物材料均為已公開或商品化的材料，具體可通過以下方式獲 得，由申請人保存的生物材料自申請日起向公眾提供20年
載體pET30a 購于Novagen公司；
載體 pYTBll 購于 NEW ENGLAND BioLabs 公司；
質粒 pET-EI-GFP 美國 Wu Wanyi 博 士 惠贈(B. A. Fong, W. Y. ffu, D. W. Wood. Optimization of ELP-intein mediated protein purification by salt substitution. Protein Expression and Purification, 2009，66(2) :198-202.),申請人保存；
質粒 pGEX-4T-l-K205R 英國 R. Μ. Ε. Parkhouse 博 士 惠贈(S. D. Kollnberger, B. Gutierrez-Castaneda, M. Foster-Cuevas, A. Corteyn and R. Μ. Ε. Parkhouse. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody. Journal of General Virology, 2002，83:1331-1342.)，申請人保存。實施例一 pET-EM的構建
pET-EM的構建流程如圖2，具體步驟如下
1)用限制性核酸內切酶5^I和勒·/〗酶切載體pET30a，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切 產物，膠中DNA回收試劑盒回收酶切大片段，回收產物末端用Klenow大片段DNA聚合酶補 平后，T4 DNA連接酶連接，獲得無酶切位點的載體pET30a’ ；
2)根據商品化載體pYTBll上MxegyrA內含肽編碼序列，設計合成一對引物 Pl 5' - TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA
TCACGGGA-3，(SEQ ID NO. 1)(引物 5，端引入MfeI、^ / I、AfcoI、船el、損aI、5 I 酶切 位點)；
P2 5' -TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3' (SEQ ID N0. 2)(下劃線處為引入的 feoRV位點)。以pYTBll質粒為模板，PCR擴增大小約660bp的Mxe gyrA內含肽基因，NdeY、 BcoRY限制性內切酶酶切PCR產物和載體pET-30a’，并用T4連接酶連接酶切產物，構建載 體 pET-M ；
3)NdeI限制性內切酶酶切pET-EI-GFP質粒，酶切后的粘性末端用Klenow大片段DNA 聚合酶補平，再用feci進行酶切，獲得一端為feci位點，另一端為平端的ELP基因片段；并 與5^1和雙酶切的pET-M載體連接，構建攜帶多克隆位點、Mxe gyrA內含肽及ELP 基因的重組載體PET-EM (圖1)。實施例二 非洲豬瘟病毒K205R基因的原核表達與純化
1.合成一對引物 Pl :5，-GGTCATATGGTTGAGCCACGCGAACAG-3，(SEQ ID N0. 3)， P2 5'-GGTTGCTCTTCCGCACTTCTTCATCATCTCTTTG-3' (SEQ ID NO. 4)，PCR 方法，從質粒PGEX-4T-1-K205R擴增K205R基因(圖3)，回收該DNA片段，限制性內切酶Mfe I和Sap I 雙酶切后，插入載體pET-EM，構建重組表達載體pET-EM-K205R (圖4)。2.將重組表達載體pET-EM-K205R轉化大腸桿菌BLR (DE3)感受態(tài)細胞，篩選出 陽性重組菌，接種50ug/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床(160rpm)中培養(yǎng)0D600為 0. 5時，加入IPTG至終濃度0. 4mM, 20°C誘導24h后，沉淀細菌，在0. 5ml裂解緩沖液(IOmM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0. lmg/ml Lysozyme, pH7. 2)反復凍融細菌3次，超聲波破碎細菌 (10W，裂解10s，停10s，共3次)，4°C 16000g離心6min，收集上清液。加入等體積0. 8M硫酸 銨，23°C孵育15min，同樣溫度下16000g離心6min，棄上清，保留沉淀。3.用 0. Iml 切割緩沖液(40mM DTT, 30Mm Hepes, 0. 5M NaCl)懸浮沉淀，4°C切割 40h后，加入等體積的0. 8M硫酸銨溶液，23°C孵育15min，同樣溫度下16000g離心6min，吸 出上清，4°C保存。4. SDS-PAGE電泳分析上述步驟中蛋白表達及純化效果，結果顯示切割后的上清 液中出現大小約23KD的單一蛋白條帶(圖5 )，用非洲豬瘟病毒K205R抗體進行Western blotting試驗，分析、鑒定該純化的蛋白，顯色后該處出現深棕色條帶(圖6)，表明該蛋白 與非洲豬瘟病毒K205R抗體發(fā)生特異免疫學反應，從而證實用構建的載體pET-EM可方便地 表達、純化K205R蛋白。
權利要求
1.一種原核表達載體pET-EM，其特征在于它的結構如圖1所示。
2.—種構建原核表達載體pET-EM的方法，其特征在于具體構建步驟包括1)用限制性核酸內切酶酶切載體pET30a，大片段連接后，獲得載體 pET30a'；2)引物設計及基因擴增a.根據MxegyrA內含肽設計一對正反向引物Pl和P2，Pl 5' TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCATCACGGGA3’ ；P2 :5’ TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG3，；其中Pl的5’端引入MfeI、^/7l、Afc0I、MeI、i^I、5^7l限制性核酸內切酶酶切位點， 該些酶切位點構成一多克隆位點，供外源基因的插入；P2的5’端引入feoRV限制性核酸內 切酶酶切位點，為構建質粒提供連接端；b.在P1、P2的作用下，以pYTBll質粒為模板擴增出MxegyrA基因；3)將擴增的MxegyrA基因，經Ndel、Ecom限制性內切酶酶切后連入載體pET_30a’ 相應的位點，構建載體pET-M ；mdel限制性內切酶酶切pET-EI-GFP質粒，末端補平后，用5^1酶切，獲得的DNA片 段與5^1和雙酶切的pET-M載體連接，構建攜帶多克隆位點、Mxe gyrA內含肽及ELP 基因的重組載體pET-EM。
3.按權利要求2所述的載體構建方法，其特征在于步驟1)中Seipl和/^_/1酶切后獲得 的大片段及步驟4)中MfeI限制性內切酶酶切產物用Klenow大片段DNA聚合酶補平其粘 性突出端。
4.按權利要求2所述的載體構建方法，其特征在于步驟1)、3)、4)連接時所用的DNA連 接酶為T4 DNA連接酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種便于外源蛋白純化的原核表達載體及構建方法。所說的天表達載體結構如圖1所示，它是在載體pET30a基礎上，插入多克隆位點及Mxe-ELP基因序列，構建而成。將欲表達得外源蛋白編碼基因插入多克隆位點，轉化感受態(tài)宿主細胞，誘導表達后，利用彈性蛋白樣多肽的生物學特點，再借助內含肽MxeGyrA在硫醇存在條件下能自我切割特點，從而分離、純化出表達的外源蛋白。該表達系統與其他原核表達系統相比，避免使用價格昂貴的層析技術，且操作簡單易行，在蛋白生產領域有著極其明顯的優(yōu)勢，特別適用于可溶性蛋白的表達純化。
文檔編號C12N15/66GK102080096SQ20101058535
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權日2010年12月13日
發(fā)明者劉文俊, 夏曉莉, 孫懷昌, 張鑫宇, 朱善元, 王健 申請人:揚州大學