專利名稱：一種原核表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種原核表達(dá)載體及包含 該載體的宿主細(xì)胞與該載體在重組表達(dá)生物活性蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是目前生產(chǎn)重組外源蛋白的主要工程菌。然而，目前利用原核系統(tǒng)表達(dá) 生產(chǎn)重組蛋白，重組蛋白常出現(xiàn)以不溶的包含體(inclusion body)的形式存在、表達(dá)量 低、生物活性不高等問題。將分子伴侶(molecular chaperone或chaperone ；也稱融合伴 侶，fusion partner或融合標(biāo)簽，fusion tag)和目標(biāo)蛋白連接成為一個融合蛋白進(jìn)行表 達(dá)是增加目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)的常用策略之一。目前最常用的分子伴侶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移 酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、NusA蛋白、二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶 (Dsb家族，如DsbA、DsbC)、小泛素修飾蛋白(SUMO)及熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006,17353-358 ；Betiku E. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2006，1 :66_75)。對生產(chǎn)重組蛋白而 言，不僅要獲得高產(chǎn)量可溶性重組蛋白，更重要的是要保證重組蛋白的生物學(xué)活性。特別 對于許多含二硫鍵的蛋白質(zhì)，正確的二硫鍵折疊在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性方面起著重要 的作用。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，融合表達(dá)不僅可以提高蛋白表達(dá)量及可溶性，部分分子伴侶 還可以幫助目標(biāo)蛋白正確折疊，從而保持較好生物活性。如，二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶(Dsb 家族，如DsbA、DsbC)、硫氧還蛋白(Trx)及小泛素修飾蛋白(SUMO)等能促進(jìn)表達(dá)的目標(biāo) 蛋白的二硫鍵的正確連接，從而使表達(dá)的目標(biāo)蛋白保持天然生物活性(Marblestone JG et al.Protein Sci. 2006,15 182-189 ；Panavas T et al. Methods Mol Biol. 2009,497 303-317 ；Yasukawa T et al, J Biol Chem. 1995,270 25328-25331 ；Lauber T et al, Protein Expr Purif. 2001. 22 108-112)。為純化的方便，可在目標(biāo)蛋白融合相應(yīng)親和純化 標(biāo)簽(affinity purification tags)，如 6Xhis_tag、GST、MBP、FLAG，BAP、Str印-II 及 CBP 等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006，17 :353_358)。然而，融合 表達(dá)不足之處是在融合表達(dá)后往往要通過特異的蛋白酶，如腸激酶、fXa等的酶切或化學(xué)裂 解除去融合標(biāo)簽和分子伴侶。這就可能需要二次純化，并且引入酶切的蛋白酶價格昂貴，會 帶來成本的增加，并且可能導(dǎo)致非特異性切割(謝浩等.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.2009， 36 1364-1369) 0另外，還存在切除融合標(biāo)簽后目標(biāo)蛋白重新聚集形成沉淀現(xiàn)象。內(nèi)含肽(intein)是存在于前體蛋白中的一段序列，在前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋 白質(zhì)的過程中，依靠自我剪切作用從前體蛋白中釋放出來，同時將兩端的蛋白質(zhì)外顯肽 (extein)連接在一起。內(nèi)含肽經(jīng)誘導(dǎo)能夠介導(dǎo)N端或C端單側(cè)肽鍵斷裂。在蛋白質(zhì)工程 方面，內(nèi)含肽具有自我剪切特性的這種特性可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與親和標(biāo)簽分離的目的。如 將編碼親和標(biāo)簽、內(nèi)含肽及目標(biāo)蛋白的基因序列連接在一起，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出 一個親和標(biāo)簽(Tag)-內(nèi)含肽_目標(biāo)蛋白的三聯(lián)體，再利用親和層析吸附標(biāo)簽而截留融合 蛋白，隨后在理化因素作用下(如PH、溫度的變化或者巰基化合物的加入)該三聯(lián)體從內(nèi)含肽的N-端或者C-端發(fā)生自我剪切釋放目標(biāo)蛋白。新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs, NEB)根據(jù)此原理已經(jīng)構(gòu)建IMPACT ，如pTWim表達(dá)載體，該系統(tǒng)不需用蛋白酶 酶切。IMPACT 系統(tǒng)表達(dá)的目標(biāo)蛋白與內(nèi)含肽及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白形成融合蛋白，通過幾丁 質(zhì)柱親和純化融合蛋白。然后誘導(dǎo)純化融合蛋白中的內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質(zhì) 介質(zhì)上將目標(biāo)蛋白釋放出來，而內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBD)仍結(jié)合在幾丁質(zhì)介質(zhì)上， 達(dá)到單柱分離純化蛋白的目的。這種通過引入內(nèi)含肽自我剪切親和純化而避免了外源蛋 白酶的加入以 及后期對蛋白酶的清除步驟。而且內(nèi)含肽介導(dǎo)的裂解僅發(fā)生在剪接位點(diǎn)， 與目標(biāo)蛋白上的蛋白酶敏感位點(diǎn)無關(guān)，也避免了蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解(Chong S et al. Gene. 1997，192 :277_281 ；Sharma SS et al. J Biotechnol. 2006，125 48-56)。但目前通過內(nèi)含肽介導(dǎo)生產(chǎn)重組蛋白均是先分離、純化融合蛋白，然后再對在親 和介質(zhì)上的融合蛋白(如用鎳柱親和帶his-tag的融合蛋白，幾丁質(zhì)介質(zhì)親和帶CBD的融 合蛋白)進(jìn)行誘導(dǎo)剪切，以獲得目標(biāo)蛋白(Chong S et al. Gene. 1997，192 :277_281 ；Sharma SS et al. J Biotechnol. 2006，125 :48-56)。該法往往造成在融合蛋白表達(dá)過程中及其分 離純化過程中發(fā)生的提前剪切的目標(biāo)蛋白大量損失。同時，內(nèi)含肽也不能有效提高目標(biāo)蛋 白的產(chǎn)量、可溶性表達(dá)及促進(jìn)其二硫鍵的有效折疊。鉤蟲抗凝肽是從吸血寄生鉤蟲發(fā)現(xiàn)的一類具有顯著抗凝活性的多肽，通常由80 個氨基酸組成，含5對二硫鍵，可能開發(fā)為抗凝抗栓新藥或試劑(彭禮飛等.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué) 報.2006,24 624-627)。其中，本發(fā)明人課題組發(fā)現(xiàn)的源自犬鉤蟲的抗凝肽AcaNAPlO具有 很強(qiáng)的抗凝活性，是凝血途徑啟動階段關(guān)鍵凝血因子-組織因子與活化的凝血因子VII復(fù) 合物(TF/fVIIa)及凝血途徑放大階段關(guān)鍵因子-活化的凝血因子XI (fXIa)的高效抑制劑 (Li Det al. Biochem Biophys Res Commun. 2010，392 155-159)，是目前唯一既能抑制 TF/ fVIIa又能抑制fXIa的抗凝物質(zhì)，其作為抗凝抗栓新藥或試劑開發(fā)值得期待。為了重組表達(dá)商用蛋白，特別是希望通過原核表達(dá)系統(tǒng)高效地表達(dá)可溶性、保持 天然生物活性的目標(biāo)蛋白，減少分離目標(biāo)蛋白與融合標(biāo)簽和分子伴侶所帶來的生產(chǎn)成本以 及較大量的獲得目標(biāo)蛋白，本發(fā)明人研制了一種原核表達(dá)載體，并提供了對表達(dá)的融合蛋 白首先進(jìn)行有效誘導(dǎo)剪切使目標(biāo)蛋白與融合蛋白分離，然后再對與融合蛋白分離的目標(biāo)蛋 白進(jìn)行分離純化的方法，并進(jìn)一步揭示了該表達(dá)載體在表達(dá)含二硫鍵的蛋白，特別是鉤蟲 抗凝肽AcaNAPlO的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種原核表達(dá)載體及其應(yīng)用。該載體能通過分子伴侶促進(jìn) 高效可溶性地表達(dá)目標(biāo)蛋白并使目標(biāo)蛋白，特別是含有二硫鍵的目標(biāo)蛋白保持天然生物活 性。應(yīng)用該載體表達(dá)的目標(biāo)蛋白能通過內(nèi)含肽的自我剪切作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與融合蛋白經(jīng) 濟(jì)高效地分離，分離后的目標(biāo)蛋白進(jìn)一步分離純化，可經(jīng)濟(jì)高效獲得大量目的蛋白。本發(fā)明提供了一種原核表達(dá)載體，構(gòu)建本發(fā)明中所述表達(dá)載體的出發(fā)載體可為基 因工程領(lǐng)域中所述各種原核表達(dá)載體，如PET系列表達(dá)載體。通過基因工程常規(guī)方法可把 能促進(jìn)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶和能在C端自我剪切的內(nèi)含 肽編碼核苷酸序列連接入出發(fā)載體中。該載體通過分子伴侶促進(jìn)高效可溶性表達(dá)目標(biāo)蛋白 或/和目標(biāo)蛋白的二硫鍵正確折疊以提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量并保持天然活性，并通過融合在分子伴侶的內(nèi)含肽的C末端的自我剪切作用使目標(biāo)蛋白與融合蛋白分離。所述的分子伴侶與 內(nèi)含肽之間可由或長或短一段序列(編碼柔性氨基酸區(qū))連接。該載體也可基于根據(jù)純 化需要在融合伴侶中設(shè)計親和標(biāo)簽，如6Xhis-tag、GST、MBP, FLAG, BAP、Strep-II, CBD及 CBP等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006，17 :353_358)，用于簡單 快捷親和層析除去還沒有剪切完的融合蛋白，如可用幾丁質(zhì)柱親和除去帶CBD的沒有剪切 完的融合蛋白。常見的能促進(jìn)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)或/和二硫鍵正確折疊地方融合的融合 伴侶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、NusA蛋白、二硫 鍵還原酶及異構(gòu)酶(Dsb家族，如DsbA、DsbC)、小泛素修飾蛋白(SUMO)及熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)等，但不僅限于上述蛋白。能在C端自我剪切的內(nèi)含肽包括mini Ssp DnaB(Mathys S et al. Gene. 1999，231 1-13)及See VMA(Chong S et al. Gene. 1997,192 277-281)等，以mini Ssp DnaB為佳，但不僅限于上述蛋白 。利用發(fā)明載體高效融合表達(dá)的目標(biāo)蛋白與融合蛋白的通過自我剪切分離，可在 0°C 40°C下，較佳的是在低溫條件下，如0°C 20°C下，PH為6. 0 8. 0的緩沖液中進(jìn)行。 在低溫下進(jìn)行自我剪切能避免或減少對目的蛋白的降解。與融合蛋白分離后的目標(biāo)蛋白的 分離、純化方法有可以根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小、帶電荷及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，用相應(yīng)的常規(guī) 純化技術(shù)進(jìn)行分離純化；為純化方便，也可在表達(dá)的目標(biāo)蛋白中設(shè)計親和標(biāo)簽，如在目標(biāo)蛋 白的N末端或C末端融合His-tag后，可用鎳親和層析進(jìn)行快速方便純化目標(biāo)蛋白；還可利 用目標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行親和純化。對于還沒有切割完的融合蛋白需要除去，可在融合伴侶 中設(shè)計不同于目標(biāo)蛋白帶有的親和標(biāo)簽的親和標(biāo)簽，通過親和層析除去沒有切割完的融合 蛋白，也可以根據(jù)分子伴侶及融合蛋白的大小、帶電荷及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，用常規(guī)的層析 技術(shù)、分子篩技術(shù)等除去沒有切割完的融合蛋白。本發(fā)明的一個應(yīng)用在于應(yīng)用發(fā)明的表達(dá)載體經(jīng)濟(jì)高效地獲得保持天然生物活性 的目標(biāo)蛋白，特別是含二硫鍵的生物活性蛋白，如水蛭素、鉤蟲抗凝肽、蛋白酶抑制劑等。鉤 蟲抗凝肽AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)是目前唯一對凝血途徑啟動階段關(guān)鍵凝血因子-組織因 子與活化的凝血因子VII復(fù)合物(TF/fVIIa)及凝血途徑放大階段關(guān)鍵因子-活化的凝血 因子Xl(fXIa)的均有抑制作用的高效抑制劑。應(yīng)用本發(fā)明載體表達(dá)AcaNAPlO或其保守性 變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物，可以作為抗凝抗栓藥物或制劑進(jìn)行開 發(fā)應(yīng)用。本發(fā)明的其它方面由于本文技術(shù)內(nèi)容的公開，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是易于理解并實(shí) 施的。例如，利用線性連接技術(shù)或PCR技術(shù)等，把僅含目標(biāo)蛋白編碼核苷酸序列連接入本發(fā) 明載體，可以獲得沒有帶任何自身之外的氨基酸殘基序列的目標(biāo)蛋白；一種涉及分離純化 自我剪切后的目標(biāo)蛋白的方法，可根據(jù)目標(biāo)蛋白性質(zhì)進(jìn)行分離、純化等；利用本發(fā)明特點(diǎn)可 以涉及一種基于PET表達(dá)載體之外的其它原核表達(dá)載體出發(fā)構(gòu)建的具有本發(fā)明特點(diǎn)的原 核表達(dá)載體；一種用含有本發(fā)明表達(dá)載體表達(dá)生物活性蛋白的遺傳工程化的宿主細(xì)胞等。因此，本發(fā)明載體一方面通過分子伴侶提高表達(dá)目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量、可溶性及保持 目的蛋白天然生物活性；另外一方面，通過內(nèi)含肽的自我剪切實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與融合蛋白經(jīng) 濟(jì)高效地分離，減少使用腸激酶、fXa等的酶切或化學(xué)裂解除去融合標(biāo)簽和分子伴侶及進(jìn)行 二次純化帶來的成本；第三方面，通過內(nèi)含肽的自我剪切作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與融合蛋白經(jīng) 濟(jì)高效地分離后，再對與融合蛋白分離后的目標(biāo)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，可以減少在融合蛋白表達(dá)過程中及其分離純化過程中發(fā)生的提前剪切的目標(biāo)蛋白大量損失。


圖1表達(dá)載體pICET32質(zhì)粒圖。
圖2表達(dá)載體pICET32完整核酸序列。圖3在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中中，用pICET32表達(dá)含有5對二硫鍵的鉤蟲抗 凝肽 AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)的 SDS-PAGE 電泳圖。圖4在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中中，用pICET32表達(dá)含有3對二硫鍵的Kunitz 型絲氨酸蛋白酶抑制劑AduKuM的SDS-PAGE電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)([美]J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著.黃培堂等譯，科學(xué)出版 社，2002年)，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第5版)([美國]F.M.奧斯伯，R.布倫特編.金 由辛，包慧中，趙麗云譯.科學(xué)出版社，2008年)所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1表達(dá)載體pICET32的構(gòu)建以pET32a出發(fā)載體，pET32a具有T7高效啟動子，含硫氧還蛋白TrxA，是目前常用 促進(jìn)蛋白可溶性高效表達(dá)載體之一。設(shè)計上游引物DPl 5’-CATGGCCATATGAAAATCGAAGAAGG TAAAC-3’(下劃線即斜體部分為限制性內(nèi)切酶Msc I酶切位點(diǎn))及下游引物DP2 5'-GTCCA TGGCCGTTGTGTACAATGATGTCATTC-3，用pfu酶從表達(dá)載體pTWim (NEB公司產(chǎn)品)擴(kuò)增獲得 幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)及內(nèi)含肽mini SspDnaB編碼核苷酸序列，以此產(chǎn)物為模板，用上游引 物 DPl 與新設(shè)計引物 5’ -GTACACAACGGCCATGGACATCATCATCATCATCATGGATCC-3，擴(kuò)增獲得第 二輪產(chǎn)物。通過此輪擴(kuò)增引入限制性內(nèi)切酶NcoI酶切位點(diǎn)及6Xhis tag編碼序列。以第 二輪擴(kuò)增為模板，用引物DPl與新設(shè)計引物5’-TGCTCGAGTAAGCTTTGAATTCGGATCCATGATGATG ATG-3’(下劃線即斜體部分為限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn))擴(kuò)增獲得第三輪產(chǎn)物。通過 第三輪擴(kuò)增引入限制性內(nèi)切酶BamH I.EcoR I.Hind III及Xho I酶切位點(diǎn)。第三輪產(chǎn)物 經(jīng)Msc I及Xho I雙酶切后，連接入同樣經(jīng)Msc I及Xho I酶切的pET32a載體。連接的載 體轉(zhuǎn)入E. coli DH5 α，構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確，成功獲得構(gòu)建目標(biāo)載體pICET32。pICET32質(zhì)粒圖見附圖1，核酸序列見附圖2。該載體是基于pET32a出發(fā)的構(gòu)建的 載體，具有原核表達(dá)系統(tǒng)所需的基礎(chǔ)元件。具有T7高效啟動子，含有分子伴侶硫氧還蛋白 (TrxA)促進(jìn)目標(biāo)蛋白高效可溶性表達(dá)并使目標(biāo)蛋白保持天然生物活性，通過含肽mini Ssp DnaB的自我剪切內(nèi)可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與融合蛋白分離。為純化需要，在內(nèi)含肽中融合了親和 標(biāo)簽幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)，在硫氧還蛋白及Ssp DnaB相互之間連接區(qū)段均有相應(yīng)柔性區(qū)。 在mini Ssp DnaB編碼序列的3’端依次為多克隆位點(diǎn)、6Xhis tag編碼序列、多克隆位點(diǎn) 及6Xhis tag編碼序列。也可通過PCR實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與內(nèi)含肽的無縫連接，使獲得的目標(biāo) 蛋白不帶本身之外的氨基酸序列。實(shí)施例2用pICET32表達(dá)鉤蟲抗凝肽AcaNAPlO及其分離與純化根據(jù)犬鉤蟲抗凝肽AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)編碼序列設(shè)計引物從犬鉤蟲成蟲cDNA中擴(kuò)增編碼核酸序列，設(shè)計出引物序列為N10-3 :5，-GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3，( 含內(nèi)切酶位點(diǎn) BamH I) ；N11-2 :5，-CGAAGCTTGGTCATTTTCTATTAGGG-3，(含內(nèi)切酶位點(diǎn) Hind II I)。PCR產(chǎn)物回收純化后，用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒 PICET32過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。經(jīng)PCR及測序鑒定的重組克隆質(zhì)粒命名為AcaNAP10/pICET32。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)含重組表達(dá)質(zhì)粒 AcaNAP10/pICET32宿主菌BL21 (DE3)，1. Ommol/L終濃度的IPTG誘導(dǎo)。離心收集菌體，經(jīng)超 聲破碎后收集上清，以1 4(上清緩沖液)的比例加入不同pH值(分別為ρΗ6. 0、ρΗ6· 4、 ρΗ6· 8、ρΗ7. 2、ρΗ7. 6、ρΗ8. 0)的 IOX 磷酸鹽緩沖液置于 4°C、16°C、30°C、40°C裂解，分別于 48小時內(nèi)每間隔6小時取樣進(jìn)行SDS-PAGE觀察裂解效果，用軟件Quantity One 4. 52分 析裂解效率。取相應(yīng)裂解上清用Ni-IDA親和純化，經(jīng)幾丁質(zhì)柱親和除去還沒有裂解的融合 蛋白，流穿液即為目標(biāo)蛋白，可除咪唑濃縮后備用。純化目標(biāo)蛋白用PT及aPTT法檢測體外 抗凝活性(方法參照 Li D et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010，392 155-159)。同 時，用pTWim載體表達(dá)AcaNAPIO，按照說明書制備重組AcaNAPIO，制備好的蛋白用作對照。 用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定純化蛋白濃度。
結(jié)果表明重組質(zhì)粒pICET32/AcaNAP10在大腸桿菌中得到高效可溶性表達(dá)，95% 以上目標(biāo)蛋白(融合蛋白)為可溶蛋白，融合蛋白量可達(dá)宿主總蛋白的40%左右(圖3泳 道1)。在每升LB培養(yǎng)基中，獲得可溶性融合蛋白量可達(dá)250mg以上。用pICET32制備的 AcaNAPlO的可溶性及產(chǎn)出量均比pTWim顯著提高。純化獲得了 N末端帶6Xhis tag的 AcaNAPIO，蛋白分子量大小約為20Kda(形成了二聚體)(圖3泳道3)，沒有剪切及目標(biāo)蛋 白剪切后的融合蛋白大小分別約為49kDa，39kDa(圖3泳道1)，與理論預(yù)測相符。在LB培 養(yǎng)基中，最終獲得的純化rAcaNAPIO量可達(dá)70mg/L以上。用pICET32及pTWim表達(dá)的蛋 白在表達(dá)及宿主菌分離、裂解破碎過程均發(fā)生了提前自我剪切。如圖2泳道1，PICET32在 誘導(dǎo)表達(dá)及收集宿主菌進(jìn)行破碎裂解的過程中，有超過三分之一的融合蛋白已發(fā)生自我剪 切。在4°C放置12小時后，有80%以上的融合蛋白已完成自我剪切裂解，在4°C放置18小 時的融合蛋白已基本上完成自我剪切裂解(圖3泳道2)，在4°C放置36小時的融合蛋白幾 乎全部完成自我剪切裂解。在4°C中進(jìn)行自我剪切，放置至48小時內(nèi)的目標(biāo)蛋白及融合伴 侶均沒有明顯降解。隨機(jī)進(jìn)行5次蛋白表達(dá)純化及活性檢測對照表明，用PICET32載體制 備的重組AcaNAPIO (4°C，pH6. 4磷酸鹽緩沖液，自我剪切36小時后純化蛋白)延長2倍PT 所需濃度為30. 5 士4. 2nM,而用pTWim載體制備的重組AcaNAPIO延長2倍PT所需濃度為 58. 3士3. 8nM，即用pICET32載體制備的重組AcaNAPlO活性顯著要高。實(shí)施例3絲氨酸蛋白酶抑制劑AduKuM的表達(dá)及其分離純化AduKuH是發(fā)明人課題組從十二指腸鉤蟲分離出來的一種Kunitz型絲氨酸蛋 白酶抑制劑，含有3對二硫鍵，其成熟肽氨基酸序列為RNPHRKGRCGDDPAETGGECPDPETKYT YKFGDCHEVKYCGEQETRNLFDSYEKCSGKCVIF。根據(jù)AduKuI4成熟肽編碼序列，設(shè)計上游引物 5，-TAGGATCCCGCAATCCTCACAGAAAG -3，及下游引物5，-CCAAGCTTAGAAGATCACGCACTTTCC -3’，從十二指腸鉤蟲成蟲cDNA中擴(kuò)增獲得成熟肽編碼序列。擴(kuò)增產(chǎn)物連接入表達(dá)載體成 功構(gòu)建PICET32/AduKuI4表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收 集菌體，超聲破碎后收集上清，以1 4(上清緩沖液)的比例加入不同pH值(分別為ρΗ6· 0、ρΗ6· 4、ρΗ6· 8、ρΗ7· 2、ρΗ7· 6、ρΗ8· 0)的 IOX 磷酸鹽緩沖液置于 4°C、16°C、30°C、40°C 裂解，分別于48小時內(nèi)每間隔6小時取樣進(jìn)行SDS-PAGE觀察裂解效果。取相應(yīng)裂解上清 用Ni-NTA親和純化，經(jīng)幾丁質(zhì)柱親和除去還沒有裂解的融合蛋白，流穿液即為目標(biāo)蛋白。
結(jié)果表明AduKuI4得到高效可溶表達(dá)，目標(biāo)蛋白(融合蛋白)幾乎全部可溶，可 溶融合蛋白總量可達(dá)細(xì)菌總蛋白量50%以上。從裂解下來的融合伴侶可以看出，在誘導(dǎo)表 達(dá)及細(xì)菌破碎過程中即有50%以上可溶蛋白已發(fā)生提前自我剪切(圖4泳道2)。各溫度 下均能誘導(dǎo)剪切，24小時后，融合蛋白均絕大部分剪切(圖4泳道3、4分別為宿主菌上清 在4°C及40°C下經(jīng)內(nèi)含肽自我剪切后的裂解情況)，取相應(yīng)裂解上清用Ni-IDA親和純化，經(jīng) 幾丁質(zhì)柱親和除去還沒有裂解完的融合蛋白，獲得目標(biāo)蛋白，大小約為8kDa，與理論預(yù)測相 符(圖4泳道5、6、7)。在LB培養(yǎng)基中，最終獲得的純化rAduKuI4量可達(dá)80mg/L以上，即 AduKu14得到高效可溶表達(dá)。
權(quán)利要求
一種原核表達(dá)載體，其特征在于含有(a)促進(jìn)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶的編碼核苷酸序列；(b)能在C末端肽鍵斷裂的內(nèi)含肽的編碼核苷酸序列。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體，其特征在于，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體，其特征在于，所述分子伴侶能促進(jìn)目標(biāo)蛋 白可溶性表達(dá)或/和二硫鍵正確折疊，使表達(dá)的目標(biāo)蛋白保持有天然生物活性；所述內(nèi)含 肽能在一定條件下被有效誘導(dǎo)C末端的肽鍵裂解，使目標(biāo)蛋白與融合蛋白分離。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的一種原核表達(dá)載體，其特征在于，所述分子伴侶包括硫氧還蛋 白、二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶、小泛素修飾蛋白、NusA及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；所述的內(nèi)含肽 包括 mini Ssp DnaB、See VMA 等，以選用 mini Ssp DnaB 為佳。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，表達(dá)的目標(biāo)蛋白是具 有生物活性的蛋白或多肽，特別是含有二硫鍵的生物活性蛋白或多肽，包括鉤蟲抗凝肽及 其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物。
6.據(jù)權(quán)利要求2所述的一種原核表達(dá)載體，其特征在于，一種宿主細(xì)胞包含有權(quán)利要 求5所述的載體。
7.據(jù)權(quán)利要求5所述的一種原核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，目標(biāo)蛋白與融合蛋白 有效分離是在0°C 40°C下，較佳在0°C 20°C下，pH為6. O 8. O的緩沖液中進(jìn)行。
8.據(jù)權(quán)利要求7所述的一種原核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，從融合蛋白中分離出 來的目標(biāo)蛋白的分離、純化方法包括用親和層析純化融合有親和標(biāo)簽，如帶His-tag的目 標(biāo)蛋白，或用制備的抗體親和純化目標(biāo)蛋白，或根據(jù)目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行層析純化。
9.據(jù)權(quán)利要求5所述的一種原核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，(a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)據(jù)權(quán)利要求7所述條件下，進(jìn)行目標(biāo)蛋白與融合蛋白的有效分離；(c)據(jù)權(quán)利要求8所述方法進(jìn)行目標(biāo)蛋白的分離與純化。
10.據(jù)權(quán)利要求5—種原核表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，目標(biāo)蛋白包括由SEQ ID NO. 1氨基酸序列組成的多肽或其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生 物。
全文摘要
一種原核表達(dá)載體及其應(yīng)用，載體包含有(a)促進(jìn)目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶和(b)能在C末端肽鍵斷裂的內(nèi)含肽的編碼核苷酸序列。該載體通過分子伴侶促進(jìn)高效可溶性表達(dá)目標(biāo)蛋白并使目標(biāo)蛋白保持天然生物活性，而且，通過在一定條件下有效誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自我剪切作用使目標(biāo)蛋白與融合蛋白分離后，再分離、純化目標(biāo)蛋白，可以經(jīng)濟(jì)高效地獲得保持有天然生物活性的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明還涉及包含上述載體的宿主細(xì)胞及上述載體在重組表達(dá)生物活性蛋白中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/74GK101967493SQ20101020483
公開日2011年2月9日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者廖淑莉, 彭禮飛, 楊陳, 殷環(huán), 甘偉瓊, 鄧?yán)?申請人:廣東醫(yī)學(xué)院