一種治療hpv16和hpv18病毒的融合蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白及其制備方法，旨在提供一種制備方法簡單，可有效治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白；其技術(shù)要點：所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPV18基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPV161-3的基因序列如SEQ ID NO：2-4所示；其制備方法為：1)靶位點的篩選；2)PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18和PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV161-3原核表達載體的構(gòu)建；3)TALEs-ScPvuII-HPV18和TALEs-ScPvuII-HPV161-3蛋白的表達與純化。
【專利說明】-種治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種融合蛋白，具體地說，是一種治療HPV16和HPV18病毒的融合 蛋白，本發(fā)明該公開了該融合蛋白的制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 99%以上的宮頸癌是由人乳頭狀瘤病毒（HPV)引起。人乳頭狀瘤病毒（HPV)的持 續(xù)感染是婦女患宮頸癌的主要原因。在118種HPV亞型中，共有14種高風(fēng)險的HPV病毒株 被認為是造成宮頸癌及其癌前病變的高風(fēng)險HPV亞型，其中兩種病毒株風(fēng)險最高HPV16和 HPV18,可導(dǎo)致70%-85%的宮頸癌病例。開發(fā)出針對HPV16和HPV18兩個型別的治療 藥物對預(yù)防宮頸癌的發(fā)生有著重要意義。
[0003] TALE蛋白N端和C端分別是核定位信號（Nuclearlocalizationsignal，NLS) 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activationdomain,AD)，而中部則是介導(dǎo)其與DNA特異識別與結(jié)合的 重復(fù)單位（或稱重復(fù)單元）構(gòu)成，重復(fù)單位的部分由長度為33?35個氨基酸殘基的，在每 個重復(fù)單位中，+12和+13位的氨基酸殘基是實現(xiàn)靶向識別特異DNA堿基的關(guān)鍵位點，隨靶 點核苷酸序列的不同而異，被稱作重復(fù)可變雙殘基（Repeatvariabledi-residue，RVD)。 不同的RVD能夠相對特異地分別識別A、T、C、G4種堿基中的一種。ScPvuII限制性內(nèi)切酶 是一種常見的限制性核酸內(nèi)切酶，特異的識別CAGCTG位點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡單，用于HPV16和HPV18 病毒的融合蛋白及其制備方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的：該治療HPV16和 HPV 18病毒的融合蛋白，所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPV18基因序列如SEQ ID N0:1 所示；所述的融合蛋白TALEs-ScPvuII-HPVie^的基因序列如SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 和SEQ ID NO :4所示。
[0006] 進一步的，上述的治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白，所述的融合蛋白依次由 下述方法制得：
[0007] 1)靶位點的篩選
[0008] 以HPV16的E6基因和E7基因，HPV18的E7基因為靶基因，TALEs識別的位點加上 限制性內(nèi)切酶ScPvuII的識別位點構(gòu)成TALEs-ScPvuII的靶位點；
[0009] 其中：
[0010] HPV18的E7基因上的靶基因TALEs-ScPvuII-HPV18的靶位點為：
[0011] TCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTG；
[0012] HPV16的E6和E7基因TALEs-ScPvuII-HPV16的靶位點為：
[0013] TCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTG,
[0014] TAGGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTG,
[0015] TGGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTG。
[0016] 2)PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18 和PETieb-TALEs-ScPvuII-HPVieu原核表達載 體的構(gòu)建
[0017] 將TALEs-ScPvuII-HPV18 和TALES-SCPVUII-HPV16H克隆到原核表達載體 PET-16b的Ndel和BamHI位點，獲得TALEs-ScPvuII-HPV18 和
[0018] TALES-SCPVUII-HPV16M原核表達載體，最后同時轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0019] 3)TALEs-ScPvuII-HPV18 和TALES-SCPVUII-HPV16H蛋白的表達與純化
[0020] 將帶有重組質(zhì)粒TALEs-ScPvuII-HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPV16H的大腸桿菌 BL21菌種擴大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的
[0021] TALEs-ScPvuII-HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPVie^ 蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離 心獲得可溶性的上清，進行Ni柱親和層析，待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌， 再用洗脫緩沖液，利用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的PBS溶 液，最后進行SDS-PAGE的檢測，即為純化的
[0022] TALEs-ScPvuII_HPV18 和TALES-SCPVUII-HPV16H蛋白。
[0023] 為制備該治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白，本發(fā)明該提供了該融合蛋白的 制備方法，該方法依次包括下述步驟：
[0024] 1)靶位點的篩選
[0025] 以HPV16的E6基因和E7基因，HPV18的E7基因為靶基因，TALEs識別的位點加上 限制性內(nèi)切酶ScPvuII的識別位點構(gòu)成TALEs-ScPvuII的靶位點；
[0026] 其中：
[0027] HPV18的E7基因上的靶基因TALEs-ScPvuII_HPV18的靶位點為：
[0028] TCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTG；
[0029] HPV16 的E6和E7 基因TALEs-ScPvuII_HPV16 的靶位點為：
[0030] TCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTG，
[0031] TAGGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTG,
[0032] TGGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTG。
[0033] 2)PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18 和PETieb-TALEs-ScPvuII-HPVieu原核表達載 體的構(gòu)建
[0034] 將TALEs-ScPvuII_HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPVieu克隆到原核表達載體 PET-16b的Ndel和BamHI位點，獲得TALEs-ScPvuII-HPV18 和
[0035] TALEs-ScPvuII-HPVie^原核表達載體，最后同時轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中；
[0036] 3)TALEs-ScPvuII-HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPV16卜3 蛋白的表達與純化
[0037] 將帶有重組質(zhì)粒TALEs-ScPvuII_HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPV16H的大腸桿菌 BL21菌種擴大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的
[0038] TALEs-ScPvuII_HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPVie^ 蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離 心獲得可溶性的上清，進行Ni柱親和層析，待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌， 再用洗脫緩沖液，利用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的PBS溶 液，最后進行SDS-PAGE的檢測，即為純化的
[0039] TALEs-ScPvuII_HPV18 和TALEs-ScPvuII-HPV16卜3 蛋白。
[0040]上述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，所述的漂洗液由下述 組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，60mM咪唑。
[0041] 進一步的，上述的治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白的制備方法，所述的漂洗 液pH8. 0。
[0042] 上述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，所述的洗脫緩沖液由 下述組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM咪唑。
[0043] 進一步的上述的治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白的制備方法，pH8.0。
[0044] 上述的治療HPV16和HPV18病毒的融合蛋白的制備方法，所述的脫鹽柱為用 PD-10脫鹽柱。
[0045] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，本發(fā)明以HPV16的E6基因和HPV18的 E7基因為靶點，篩選到特異切割這兩個基因的TALEs-ScPvuII的蛋白，這幾個蛋白可以用 來HPV16和HPV18感染的病毒治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1是熒光定量PCR檢測HPV18-E7的實驗結(jié)果；
[0047] 圖2是熒光定量檢測TALEs-ScPvuII-HPViei蛋白切割E6/E7基因的實驗結(jié)果；
[0048]

【具體實施方式】
[0049] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本 發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán) 利要求保護范圍之內(nèi)。
[0050] 實施例1
[0051] 本發(fā)明提供的一種治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白所述的融合蛋白 TALEs-ScPvuII-HPV18基因序列如SEQ ID N0 :1所示；所述的融合蛋白
[0052]TALEs-ScPvuII-HPView(即TALEs-ScPvuII-HPViei ;TALEs-ScPvuII-HPV162 ;
[0053] TALEs-ScPvuII-HPV163)的基因序列如SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3和SEQ IDN0 : 4所示。
[0054] 該融合蛋白依次通過下述方法制備：
[0055] 1)靶位點的篩選。
[0056]HPV16的E6和E7基因，HPV18的E6和E7基因為致病基因。因此，以這四個基因 為靶基因。TALEs識別的位點加上限制性內(nèi)切酶ScPvuII的識別位點構(gòu)成TALEs-ScPvuII 的靶位點。
[0057]HPV18的E6和E7基因上，由于E7基因上只有一個ScPvuII位點，這個靶基因 TALEs-ScPvuII-HPV18 的靶位點為TCAGCAGACGACCTTCGAGCAITCCAGCAGCTG;
[0058] HPV16的E6和E7基因TALEs-ScPvuII-HPV16的靶位點為：

【權(quán)利要求】
1. 一種治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白，其特征在于，所述的融合 蛋白TALEs-ScPvuII-HPV18基因序列如SEQ ID NO :1所示；所述的融合蛋白 TALES-SCPVUII-HPV16H 的基因序列如 SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白，其特征在于，所述的 融合蛋白依次由下述方法制得： 1) 革E位點的篩選 以HPV16的E6基因和E7基因，HPV18的E7基因為靶基因，TALEs識別的位點加上限制 性內(nèi)切酶ScPvuII的識別位點構(gòu)成TALEs-ScPvuII的靶位點； 其中： HPV18 的 E7 基因上的靶基因 TALEs-ScPvuII-HPV18 的靶位點為：TCAGCAGACGACCTTCGA GCATTCCAGCAGCTG ； HPV16 的 E6 和 E7 基因 TALEs-ScPvuII-HPV16 的靶位點為： TCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTG， TAGGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTG, TGGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTG ； 2. PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18 和 PETieb-TALEs-ScPvuII-HPVieH 原核表達載體的 構(gòu)建 將 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVie^ 克隆到原核表達載體 PET-16b 的 Ndel 和 BamHI 位點，獲得 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVieu 原核表達載體， 最后同時轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中； 3. TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALES-SCPVUII-HPV16H 蛋白的表達與純化 將帶有重組質(zhì)粒 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVie^ 的大腸桿菌 BL21 菌種擴大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的TALEs-ScPvuII-HPV18和 TALEs-ScPvuII-HPVie^蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進行Ni柱親 和層析，待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，再用洗脫緩沖液，利用脫鹽柱將洗 脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的？85溶液，最后進行505^^6￡的檢測，即為 純化的 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALES-SCPVUII-HPV16H 蛋白。
3. 權(quán)利要求1所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，其特征在于， 依次包括下述步驟： 1)革E位點的篩選 以HPV16的E6基因和E7基因，HPV18的E7基因為靶基因，TALEs識別的位點加上限制 性內(nèi)切酶ScPvuII的識別位點構(gòu)成TALEs-ScPvuII的靶位點； 其中： HPV18 的 E7 基因上的靶基因 TALEs-ScPvuII-HPV18 的靶位點為：TCAGCAGACGACCTTCGA GCATTCCAGCAGCTG ； HPV16 的 E6 和 E7 基因 TALEs-ScPvuII-HPV16 的靶位點為： TCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTG， TAGGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTG, TGGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTG ； 2. PET16b-TALEs-ScPvuII-HPV18 和 PETieb-TALEs-ScPvuII-HPVieH 原核表達載體的 構(gòu)建 將 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVie^ 克隆到原核表達載體 PET-16b 的 Ndel 和 BamHI 位點，獲得 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVieu 原核表達載體， 最后同時轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中； 3. TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALES-SCPVUII-HPV16H 蛋白的表達與純化 將帶有重組質(zhì)粒 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALEs-ScPvuII-HPVie^ 的大腸桿菌 BL21 菌種擴大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的TALEs-ScPvuII-HPV18和 TALEs-ScPvuII-HPVie^蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進行Ni柱親 和層析，待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，再用洗脫緩沖液，利用脫鹽柱將洗 脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的？85溶液，最后進行505^^6￡的檢測，即為 純化的 TALEs-ScPvuII-HPV18 和 TALES-SCPVUII-HPV16H 蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，其特征 在于，所述的漂洗液由下述組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，60mM咪唑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或者4所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法， 其特征在于，所述的漂洗液PH8. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，其特征 在于，所述的洗脫緩沖液由下述組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM咪 唑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或者6所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法， 其特征在于，PH8. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療HPV 16和HPV 18病毒的融合蛋白的制備方法，其特征 在于，所述的脫鹽柱為用ro-io脫鹽柱。
【文檔編號】C12N15/62GK104387475SQ201410720308
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】覃啟紅, 溫華杰, 黃龍 申請人:覃啟紅