本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的藥物分析系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、類器官3d培養(yǎng)是一種新興的用來(lái)研究組織成體干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、器官形成的體外研究系統(tǒng)。腸道類器官的3d培養(yǎng)是將分離的腸道隱窩或干細(xì)胞植入含有多種生長(zhǎng)因子的基質(zhì)膠中，在基質(zhì)3d支撐下生成具有腸道上皮樣結(jié)構(gòu)的微型空心球體，這些球體被稱為腸道類器官。此外，還可以利用腫瘤干細(xì)胞或腫瘤前體細(xì)胞得到腸腫瘤類器官。這些腸道類器官被廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病、腸道損傷再生、腸癌等多種腸道疾病的研究。

2、目前許多用作細(xì)胞系的細(xì)胞為永生化細(xì)胞，即在理化刺激、基因突變、病毒感染等外界刺激下，可以在體外無(wú)限增殖的不衰老細(xì)胞株。因此，雖然二維培養(yǎng)的細(xì)胞系具有可操作性高、培養(yǎng)周期短和高通量等優(yōu)點(diǎn)，但是當(dāng)其應(yīng)用至藥物篩選時(shí)，某個(gè)具體細(xì)胞系對(duì)某種藥物的敏感性，難以代表其他細(xì)胞系，更是難以代表人體組織。此外，二維培養(yǎng)的細(xì)胞系還無(wú)法模擬正常組織和腫瘤組織的三維生長(zhǎng)環(huán)境，因此難以模擬藥物的浸潤(rùn)過(guò)程，這也說(shuō)明基于二維培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生的藥物篩選結(jié)果參考價(jià)值較低。

3、與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)相比，類器官來(lái)源于機(jī)體自身組織或干細(xì)胞，是通過(guò)體外3d培養(yǎng)形成的具有原始組織及器官的三維（3d）結(jié)構(gòu)模型，在組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能等方面與來(lái)源組織高度相似，即類器官可以表現(xiàn)出接近生理狀態(tài)的細(xì)胞組成和生理功能。因此，類器官在藥物篩選中展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)，能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)的作用效果以及藥物的毒副作用，從而提高藥物開發(fā)的效率和藥物臨床試驗(yàn)的成功率。

4、盡管類器官在藥物篩選方面展現(xiàn)了特有優(yōu)勢(shì)，但其發(fā)展依然面臨巨大的挑戰(zhàn)，例如類器官的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性存在不可控的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的藥物分析系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括：

2、a）鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒；

3、b）構(gòu)建的腸道類器官，所述腸道類器官包括正常腸類器官；

4、c）鉑類藥物；

5、其中所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的濃度包括5?–?20?μg/ml，所述構(gòu)建的腸道類器官為類器官細(xì)胞懸液的形式，所述類器官細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度包括1?-?5×104個(gè)腸道類器官細(xì)胞/ml；所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒先于或與所述鉑類藥物同時(shí)加入到所述構(gòu)建的腸道類器官中。

6、在一些實(shí)施例中，所述腸道類器官的傳代代次為p6代至p15代。

7、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的平均粒徑為50-120?nm。

8、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒與所述腸道類器官的比例為1?–?5?μg/100個(gè)腸道類器官細(xì)胞。

9、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的濃度為10?μg/ml。

10、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物的濃度包括0.01?–?1000?μm。

11、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物包括順鉑或奧沙利鉑。

12、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒通過(guò)以下方法制備得到：

13、s101?當(dāng)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)懸液的菌種密度達(dá)到2×109?cfu/ml時(shí)，將所述培養(yǎng)懸液在2000?g下離心10~15分鐘，得到上清液a；

14、s102?將所述上清液a在5000?g下離心20~30分鐘，得到上清液b；

15、s103?將所述上清液b在10000?g下離心30~40分鐘，得到上清液c；

16、s104?將所述上清液c使用0.45?μm過(guò)濾器過(guò)濾，將過(guò)濾后的所述上清液c在10000~150000?g下超速離心70分鐘，得到沉淀d；

17、s105?將所述沉淀d重懸并使用0.22?μm過(guò)濾器過(guò)濾，得到濾液e，將所述濾液e在10000~150000?g下超速離心70~120分鐘，得到沉淀f，即所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒。

18、在一些實(shí)施例中，所述類器官細(xì)胞懸液通過(guò)將所述構(gòu)建的腸道類器官進(jìn)行消化后獲得。

19、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物的濃度包括0.01?–?1?μm。

20、在一些實(shí)施例中，所述正常腸類器官源自健康腸組織中的腸道干細(xì)胞或隱窩。

21、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒、所述鉑類藥物和所述構(gòu)建的腸道類器官至少共培養(yǎng)24小時(shí)。

22、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒先于所述鉑類藥物6-8小時(shí)加入到所述構(gòu)建的腸道類器官中。

23、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒、所述鉑類藥物和所述構(gòu)建的腸道類器官共培養(yǎng)72-120小時(shí)。

24、第二方面，本發(fā)明提供了一種鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒在制備藥物分析系統(tǒng)中的用途，所述系統(tǒng)包括：

25、a）鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒；

26、b）構(gòu)建的腸道類器官，所述腸道類器官包括正常腸類器官；

27、c）鉑類藥物；

28、其中所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的濃度包括5?–?20?μg/ml，所述構(gòu)建的腸道類器官為類器官細(xì)胞懸液的形式，所述類器官細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度包括1?-?5×104個(gè)腸道類器官細(xì)胞/ml；所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒先于或與所述鉑類藥物同時(shí)加入到所述構(gòu)建的腸道類器官中。

29、在一些實(shí)施例中，所述腸道類器官的傳代代次為p6代至p15代。

30、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的平均粒徑為50-120?nm。

31、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒與所述腸道類器官的比例為1?–?5?μg/100個(gè)腸道類器官細(xì)胞。

32、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的濃度為10?μg/ml。

33、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物的濃度包括0.01?–?1000?μm。

34、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物包括順鉑或奧沙利鉑。

35、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒通過(guò)以下方法制備得到：

36、s101?當(dāng)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)懸液的菌種密度達(dá)到2×109?cfu/ml時(shí)，將所述培養(yǎng)懸液在2000?g下離心10~15分鐘，得到上清液a；

37、s102?將所述上清液a在5000?g下離心20~30分鐘，得到上清液b；

38、s103?將所述上清液b在10000?g下離心30~40分鐘，得到上清液c；

39、s104?將所述上清液c使用0.45?μm過(guò)濾器過(guò)濾，將過(guò)濾后的所述上清液c在10000~150000?g下超速離心70分鐘，得到沉淀d；

40、s105?將所述沉淀d重懸并使用0.22?μm過(guò)濾器過(guò)濾，得到濾液e，將所述濾液e在10000~150000?g下超速離心70~120分鐘，得到沉淀f，即所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒。

41、在一些實(shí)施例中，所述類器官細(xì)胞懸液通過(guò)將所述構(gòu)建的腸道類器官進(jìn)行消化后獲得。

42、在一些實(shí)施例中，所述鉑類藥物的濃度包括0.01?–?1?μm。

43、在一些實(shí)施例中，所述正常腸類器官源自健康腸組織中的腸道干細(xì)胞或隱窩。

44、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒、所述鉑類藥物和所述構(gòu)建的腸道類器官至少共培養(yǎng)24小時(shí)。

45、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒先于所述鉑類藥物6-8小時(shí)加入到所述構(gòu)建的腸道類器官中。

46、在一些實(shí)施例中，所述鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒、所述鉑類藥物和所述構(gòu)建的腸道類器官共培養(yǎng)72-120小時(shí)。

47、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少包括以下方面：

48、雖然現(xiàn)有技術(shù)在利用類器官進(jìn)行藥物篩選方面取得了一定的進(jìn)展，但其仍面臨類器官的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的不可控等問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，上述問(wèn)題的原因可能出自類器官容易受到傳代代次的局限而對(duì)藥物篩選的結(jié)果造成不利影響上。雖然選擇低傳代代次（例如原代至p5代次）的類器官能夠一定程度克服這個(gè)問(wèn)題，但這不可避免地造成了類器官資源的極大浪費(fèi)并增加了構(gòu)建類器官的成本，并與利用類器官進(jìn)行高通量藥物篩選的實(shí)際嚴(yán)重背離。

49、基于類器官的藥物篩選體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性實(shí)際上非常重要，例如當(dāng)利用同一個(gè)體來(lái)源的類器官進(jìn)行治療藥物的高通量篩選時(shí)，需要較多數(shù)量的類器官細(xì)胞，此時(shí)不可避免地需要對(duì)類器官進(jìn)行多次傳代。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，隨著正常腸道類器官的傳代代次增加，正常腸道類器官對(duì)某類藥物（例如鉑類藥物）反而會(huì)展現(xiàn)出低傳代代次的正常腸道類器官并不會(huì)顯示的毒性，因此該藥物很可能被篩選掉。也就是說(shuō)，這種高傳代代次類器官所帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果可能使得本潛在地適合該個(gè)體的治療藥物被排除，因此對(duì)個(gè)體化給藥的實(shí)現(xiàn)非常不利。另外，如果用不同來(lái)源的正常腸道類器官對(duì)同一種藥物的毒性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)合類器官的資源有限的現(xiàn)實(shí)情況，可能無(wú)法使用相同代次且低代次的類器官進(jìn)行藥物篩選。因此，非常明顯的是，高傳代代次的類器官可能會(huì)展現(xiàn)出對(duì)低濃度（例如0.01-1?μm）的某類藥物（例如鉑類藥物）的毒性的放大。如果所使用的高傳代代次的類器官所占比例較大，基于其很可能得出該藥物對(duì)大部分類器官均有毒性的結(jié)論，進(jìn)而可能將有治療前景的藥物排除。

50、在本發(fā)明提供的藥物分析系統(tǒng)中，特定濃度的鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒的加入（例如5?–?20?μg/ml），恰好能夠?qū)⑹艿絺鞔斡绊懚鴮?duì)鉑類藥物的毒性造成放大的正常腸道類器官，恢復(fù)至低傳代代次（例如原代至p5代次）的正常腸道類器官的水平，進(jìn)而更真實(shí)地還原腸道類器官對(duì)藥物的反應(yīng)，使得期望分析的藥物在患者體內(nèi)的實(shí)際療效能夠被更準(zhǔn)確地反映出，并使得傳代代次為p6及以上的腸道類器官能夠適用于鉑類藥物的藥物篩選。而過(guò)高濃度的鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒反而會(huì)給藥物分析系統(tǒng)中的腸道類器官帶來(lái)假陰性的問(wèn)題（即并非低傳代代次的腸道類器官的水平），其使得期望分析的藥物所呈現(xiàn)的藥物毒性同樣失真，進(jìn)而無(wú)法準(zhǔn)確地反映出期望分析的藥物在患者體內(nèi)的實(shí)際療效。

51、在本發(fā)明提供的藥物分析系統(tǒng)中，通過(guò)控制鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒與腸道類器官細(xì)胞的比例，使得鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒不會(huì)促進(jìn)腸道類器官細(xì)胞增殖的同時(shí)，既不會(huì)給腸道類器官帶來(lái)額外的細(xì)胞毒性，也不會(huì)過(guò)度影響期望分析的藥物在本發(fā)明提供的藥物分析系統(tǒng)所呈現(xiàn)的細(xì)胞毒性，保證了藥物分析系統(tǒng)的可控性和準(zhǔn)確性。因此，可以利用本發(fā)明提供的藥物分析系統(tǒng)，根據(jù)腸道類器官細(xì)胞的細(xì)胞活力來(lái)對(duì)期望分析的藥物的腸道毒性進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估。此外，經(jīng)測(cè)試，上述比例適合于不同濃度的鉑類藥物（例如0.01?–?1000?μm）和不同傳代代次的腸道類器官的測(cè)試，滿足實(shí)際藥物篩選的需求，且不會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的問(wèn)題。

52、綜上所述，與常規(guī)的藥物篩選體系相比，本發(fā)明提供的藥物分析系統(tǒng)的可控性和準(zhǔn)確性明顯提升，并拓展了腸道類器官在藥物評(píng)估的應(yīng)用前景，且能夠更好地模擬患者腸道器官的動(dòng)態(tài)環(huán)境，為早期預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)環(huán)境中生理反應(yīng)和客觀指導(dǎo)患者個(gè)性化用藥方案提供了幫助。

53、如本文所使用，“納米顆?！笔侵钢睆皆?到150納米之間的物質(zhì)粒子。如本文所使用，“鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆?！笔侵甘罄钐侨闂U菌培養(yǎng)上清液來(lái)源的的納米級(jí)細(xì)胞外脂質(zhì)雙囊泡。在本發(fā)明中，鼠李糖乳桿菌來(lái)源的納米顆粒與鼠李糖乳桿菌外泌體（簡(jiǎn)稱為lgg外泌體或外泌體）具有相同含義，除非另有說(shuō)明。