本發(fā)明涉及一種組成型啟動子及其用途，特別是涉及一種來自油菜actin基因的組成型啟動子及其用途。

背景技術(shù)：

1、植物基因工程的目標(biāo)之一是產(chǎn)生具有農(nóng)業(yè)所需特征或性狀的植物，通常期望的性狀包括提高營養(yǎng)價值品質(zhì)、增加產(chǎn)量、賦予病蟲害抗性、提高干旱和脅迫耐受性、提高園藝品質(zhì)和賦予除草劑抗性等。目前的技術(shù)進展已使研究人員能夠獲取外源多核苷酸分子(例如異源或天然來源的基因)，并將該多核苷酸分子整合到植物基因組中，該基因在植物細(xì)胞中表達以表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀。重要的是適當(dāng)?shù)恼{(diào)控信號必須以合適的結(jié)構(gòu)存在才能在植物細(xì)胞中獲得新插入基因的編碼序列的表達。這些調(diào)控信號典型地包括啟動子區(qū)域、5’非翻譯引導(dǎo)序列和3’轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化序列。

2、某些啟動子能夠在植物大部分或全部組織和/或生長發(fā)育階段以一定程度的表達水平指導(dǎo)rna合成，這些啟動子被稱為“組成型啟動子”。組成型啟動子根據(jù)其指導(dǎo)rna合成的效果可以被劃分為強、中和弱啟動子。由于在許多情況下需要同時在植物的不同組織中表達目的基因以獲得所需的基因功能，而組成型啟動子在上述情況下特別有利。

3、現(xiàn)有文獻技術(shù)中已經(jīng)描述了一些在植物細(xì)胞中起作用的組成型啟動子，這些啟動子包括大豆細(xì)胞延伸因子基因的啟動子gm17gtsf1、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)腫瘤誘導(dǎo)性質(zhì)粒上攜帶的胭脂氨酸(nos)啟動子、章魚氨酸合酶(ocs)啟動子和花椰菜花葉病毒(caulimovirus)啟動子，例如花椰菜花葉病毒(camv)19s或35s啟動子，具有重復(fù)增強子的camv?35s啟動子以及玄參花葉病毒(fmv)35s啟動子，上述啟動子已經(jīng)應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因表達的植物構(gòu)建體中。盡管目前已獲得了一些組成型啟動子，但是分離更多新穎的組成型啟動子仍然倍受關(guān)注，這些啟動子能夠控制重組dna構(gòu)建體(或基因)以不同水平進行表達，以及應(yīng)用于基因疊加在相同轉(zhuǎn)基因植物中多基因的表達。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種新的組成型啟動子及其用途，該啟動子能夠使異源核苷酸序列在植物組織中高效表達。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種組成型啟動子，其核苷酸序列包括seq?idno:4，所述組成型啟動子源自seq?id?no:1。

3、進一步地，本發(fā)明提供一種組成型啟動子，其核苷酸序列包括seq?id?no:4，并選自seq?id?no:1的至少一部分。

4、進一步地，本發(fā)明提供了一種組成型啟動子，其核苷酸序列如seq?id?no:1、seqid?no:2、seq?id?no:3或seq?id?no:4所示。

5、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含與目的異源核苷酸序列可操作地連接的上述組成型啟動子的重組dna構(gòu)建體。

6、進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。

7、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含上述重組dna構(gòu)建體的表達盒。

8、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含上述表達盒的重組載體。

9、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種在植物中表達目的異源核苷酸序列的方法，包括：將與上述組成型啟動子可操作地連接的目的異源核苷酸序列穩(wěn)定地整合進植物細(xì)胞中。

10、進一步地，所述植物為擬南芥、油菜、煙草、大豆、棉花、辣椒、甜菜、南瓜、茄子、大白菜、胡蘿卜、番茄、豌豆、菠菜、馬鈴薯或花生。

11、優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列在植物組織中組成型的表達。

12、進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。

13、優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼除草劑耐性蛋白質(zhì)。

14、優(yōu)選地，所述目的異源核苷酸序列編碼昆蟲抗性蛋白質(zhì)。

15、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種植物或部分，包含上述組成型啟動子。

16、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種獲得加工農(nóng)產(chǎn)品的方法，包括將上述植物或部分的收獲物進行處理以獲得加工農(nóng)產(chǎn)品。

17、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種上述組成型啟動子用于在植物組織中組成型的表達目的異源核苷酸序列的用途。

18、優(yōu)選地，所述植物為擬南芥、油菜、煙草、大豆、棉花、辣椒、甜菜、南瓜、茄子、大白菜、胡蘿卜、番茄、豌豆、菠菜、馬鈴薯或花生。

19、進一步地，所述目的異源核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)。

20、本發(fā)明中術(shù)語“包含”、“包括”是指“包括但不限于”。

21、本發(fā)明中術(shù)語“啟動子”是指dna調(diào)節(jié)區(qū)，通常含有能夠引導(dǎo)rna聚合酶ii在特定編碼序列的適合轉(zhuǎn)錄起始位點啟動rna合成的tata盒。本發(fā)明中術(shù)語“基因”是指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達性啟動子區(qū)域)控制下在細(xì)胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成rna分子(例如mrna)的dna區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域”)的任何dna片段。因此，基因可能含有幾種可操作性連接的dna片段，例如啟動子、5’非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和含有多聚腺苷酸化位點的3’非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。重組dna構(gòu)建體是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動子與部分或全部轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域或者與該基因的至少另一調(diào)控區(qū)域無關(guān)的任何基因。

22、本發(fā)明中術(shù)語“組成型啟動子”是指一類特殊的基因調(diào)控序列。在該類啟動子的控制下，生物體的大部分或全部組織和/或生長發(fā)育階段表現(xiàn)出一定程度的基因表達。組成型啟動子用于可操作連接的基因、目的異源核苷酸序列或基因編輯系統(tǒng)guide?rna(grna)在生物體的大多數(shù)細(xì)胞中表達，啟動的表達具有一定的持續(xù)性?？梢岳斫獾氖?，對于術(shù)語“組成型啟動子”，在生物體的不同組織和發(fā)育階段之間可能存在表達或活性絕對水平的一些變化。所述組織為植物體中由來源相同和執(zhí)行同一功能的一種或多種類型細(xì)胞集合而成的結(jié)構(gòu)單位，例如，保護組織、輸導(dǎo)組織、營養(yǎng)組織、機械組織、分生組織，幾種不同的組織有機配合、緊密聯(lián)系，形成不同的器官(organ)，不同的器官之間互相配合，更有效地完成有機體的整個生命活動過程。所述生長發(fā)育階段可根據(jù)植物形態(tài)、機能的差異劃分為胚胎階段、幼苗階段、成熟階段和衰老階段。

23、本發(fā)明中術(shù)語“組成型的表達”是指基因或目的異源核苷酸序列在植物的大部分或全部的組織和/或生長發(fā)育階段表現(xiàn)出相對穩(wěn)定和持續(xù)的表達，例如，花椰菜花葉病毒camv35s啟動子，它能夠在植物中啟動外源基因在大多數(shù)器官和不同的發(fā)育時期高強度的表達；組成型啟動子亦能夠確保grna在宿主細(xì)胞中的廣泛表達，提高基因編輯的效率和精確度。具有啟動子活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明啟動子序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。

24、本發(fā)明提供了一種組成型啟動子，其核苷酸序列包括seq?id?no:4，并選自seq?idno:1的至少一部分。seq?id?no:4是seq?id?no:1的一個片段，參照seq?id?no:1，本發(fā)明的組成型啟動子可以在seq?id?no:4的基礎(chǔ)上單獨向其5’端或3’端延伸或同時向其5’端和3’端延伸，但其向兩端延伸的核苷酸序列的長度不能超過seq?id?no:1本身的5’端或3’端。換言之，核苷酸序列如seq?id?no:4所示的組成型啟動子，或參照seq?id?no:1，通過在seq?idno:4的兩端任意延伸，且其延伸長度不超過seq?id?no:1本身的5’端或3’端所得到的組成型啟動子均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。而且，對于這樣的組成型啟動子(參照seq?id?no:1，通過在seq?id?no:4的兩端任意延伸，且其延伸長度不超過seq?id?no:1本身的5’端或3’端所得到的組成型啟動子)，該組成型啟動子中所包括的除seq?id?no:4之外的其他核苷酸序列并不影響seq?id?no:4序列本身的活性。本發(fā)明的第二實施例也證明了這一結(jié)論：prbnact8-04啟動子(seq?id?no:4)具有活性，同時包含seq?id?no:4的prbnact8-01啟動子(seq?id?no:1)、prbnact8-02啟動子(seq?id?no:2)和prbnact8-03啟動子(seq?id?no:3)均具有活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本技術(shù)記載的內(nèi)容能夠合理預(yù)測，其核苷酸序列包括seqid?no:4，并選自seq?id?no:1的至少一部分的組成型啟動子均具有與seq?id?no:4相同或相似的活性。

25、本發(fā)明所述的啟動子序列及其片段，當(dāng)組裝進dna結(jié)構(gòu)使啟動子序列與目的異源核苷酸序列可操作地連接時，用于遺傳性操控任何植物。所述“可操作地連接”是指本發(fā)明的啟動子序列與第二個序列之間的功能性連接，其中啟動子序列啟動和調(diào)節(jié)對應(yīng)于第二個序列的dna序列的轉(zhuǎn)錄。一般地，可操作地連接是指被連接的核酸序列是連續(xù)的，必要時相鄰地結(jié)合兩個蛋白編碼區(qū)，并在同一個閱讀框內(nèi)。以此方式，啟動子核苷酸序列與目的異源核苷酸序列構(gòu)成所述重組dna構(gòu)建體在表達盒中一起提供，以在目的植物中表達。這種表達盒提供了大量限制性位點以插入目的異源核苷酸序列，所述目的異源核苷酸序列將受到包含本發(fā)明啟動子序列的調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。表達盒可另外含有至少一個將共轉(zhuǎn)化進生物體的附加基因?？蛇x擇地，附加基因可以在多個表達盒上被提供。

26、表達盒可另外含有可選擇的標(biāo)記基因。一般地，表達盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。所述選擇性標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ii(npt))和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-d)抗性基因。

27、表達盒包括沿5’-3’方向轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的啟動子序列、翻譯起始區(qū)、目的異源核苷酸序列、和在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。目的異源核苷酸序列可以是天然的或?qū)χ参锼拗魍庠吹幕虍愒吹摹？蛇x擇地，目的異源核苷酸序列可以是天然序列或選擇性合成序列?！巴庠础笔侵冈趯?dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的天然植物中不存在所述的導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。例如，重組dna構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟動子序列，本發(fā)明的啟動子序列可操作地與不同于本發(fā)明的啟動子序列的編碼序列連接。

28、終止區(qū)可來源于本發(fā)明的啟動子序列，也可來源于可操作連接的目的異源核苷酸序列，或可來源于另外的來源。傳統(tǒng)的終止區(qū)可從土壤農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒獲得，如肉堿合成酶和胭脂堿合成酶(nos)終止區(qū)。

29、在表達盒制備中，可以操控不同的dna片段以提供適當(dāng)方向的dna序列，并在適合的時候提供適當(dāng)?shù)拈喿x框。所以，可應(yīng)用接受子或連接子結(jié)合dna片段，或可進行其它操控以提供方便的限制性位點、去除多余的dna、去除限制性位點等。為此目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再取代，如轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)換。

30、在適合的情況下，目的異源核苷酸序列可被優(yōu)化以增加在轉(zhuǎn)化植物中的表達量。即可用植物優(yōu)選的密碼子合成基因以改善表達。

31、本領(lǐng)域公知的，另外的序列修飾可提高細(xì)胞宿主中的基因表達水平。這些包括但不限于，去除編碼假性聚腺苷信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表達的序列。序列的g-c含量可調(diào)節(jié)到指定宿主細(xì)胞的平均水平，引用宿主細(xì)胞中己知的基因表達水平進行計算?？赡艿?，修飾序列以避免預(yù)測的發(fā)夾式mrna二級結(jié)構(gòu)。

32、在表達盒或重組載體中，表達盒可另外含有5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以起改進轉(zhuǎn)錄效率的作用。所述前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯病毒組前導(dǎo)序列，例如煙草蝕刻病毒(tev)前導(dǎo)序列、玉米矮小花葉病毒(mdmv)前導(dǎo)序列和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(bip)；來自紫花苜蓿花葉病毒包被蛋白mrna(amv?rna4)的非翻譯前導(dǎo)序列；煙草花葉病毒(tmv)前導(dǎo)序列；和玉米萎黃病斑點病毒(mcmv)前導(dǎo)序列。還可以使用其它己知的改進轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如內(nèi)含子等。

33、本發(fā)明的啟動子序列可用來啟動與目的異源核苷酸序列的信使rna(mrna)至少部分互補的反義結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建反義核苷酸序列以與相應(yīng)的mrna雜交。只要反義序列長到可與相應(yīng)的mrna雜交并干擾其表達，就可進行反義序列的修飾。以此方式，可以使用與相應(yīng)的反義序列具有80％，優(yōu)選的90％，更優(yōu)選的95％序列同一性的反義結(jié)構(gòu)。此外，反義核苷酸序列的一部分可被用來破壞靶基因的表達。一般，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸或更多個核苷酸的序列。

34、本發(fā)明的啟動子序列被用于目的異源核苷酸序列的組成型的表達?！爱愒春塑账嵝蛄小笔侵阜翘烊坏嘏c啟動子序列一起存在的序列。雖然所述核苷酸序列與啟動子序列是異源的，但對植物宿主可能是同源的或天然的或異源的或外源的?？刹僮鞯嘏c本發(fā)明的啟動子連接的異源核苷酸序列可編碼目的蛋白質(zhì)。這種異源核苷酸序列的實例包括但不限于，編碼賦予以下抗性多肽的核苷酸序列：非生物應(yīng)激如干旱、溫度、鹽度、臭氧和除草劑，或生物應(yīng)激如病原體侵襲，包括昆蟲、病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲類，并防止產(chǎn)生這些生物體伴隨的疾病。

35、本發(fā)明中除草劑耐性蛋白質(zhì)可以表達對除草劑的抗性和/或耐受性。這些基因包括但不限于，羥基苯丙酮酸雙加氧酶(hppd)基因、原卟啉原氧化酶(ppo)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(epsps)基因、草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)基因、草甘膦氧化還原酶(gox)基因、gat基因等。

36、本發(fā)明中“昆蟲抗性”是指植物避免植物-昆蟲相互作用所致的癥狀和損害。即阻止昆蟲引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病，或可選擇地，將由昆蟲引起的植物損害、農(nóng)作物損害、植物損形和植物疾病減少到最小或減輕。所述昆蟲可以屬于鱗翅目(如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲蟲)、直翅目(如飛蝗)、同翅目(如蚜蟲)、雙翅目(如蠅)等。本領(lǐng)域公知的，目的昆蟲抗性蛋白質(zhì)包括但不限于，芽孢桿菌毒性蛋白；凝集素類，其中凝集素包括雪花蓮凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麥芽凝集素、馬鈴薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶類，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶1或大豆脂氧化酶；昆蟲殼多糖酶等。

37、不同害蟲將病毒從感染的植物傳遞給健康植物的方式不同。所述病毒包括但不限于，水稻東格魯桿狀病毒、煙草花葉病毒、甘薯萎黃矮小病毒和甘薯羽狀斑點病毒等。因此，可以選擇在植物組織中組成型的表達具有抗致病原體活性或使病毒病原體的影響最小化的異源核苷酸序列。

38、本發(fā)明的啟動子序列和方法可用于任何目的異源核苷酸序列在植物宿主中的表達調(diào)節(jié)，以改變植物的表現(xiàn)型。各種目的表現(xiàn)型改變包括但不限于，改變植物的脂肪酸成分、改變植物的氨基酸含量、改變植物病原體防御機制等。上述改變可以通過提供異源產(chǎn)物的表達或增加植物內(nèi)源性產(chǎn)物的表達而得到?？蛇x擇地，上述改變可以通過減少植物中一個或多個內(nèi)源性產(chǎn)物的表達而得到，特別是酶或輔助因子。上述改變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表現(xiàn)型改變。

39、轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將dna攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的dna導(dǎo)入。

40、已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可按照常規(guī)的方式生長成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征?？膳嘤蚨啻员ＷC穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達的種子。

41、術(shù)語“植物”是指整株植物，包括全部植物和植物種群，例如需要的和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是通過傳統(tǒng)育種和優(yōu)化方法或通過生物技術(shù)和重組方法，或這些方法的組合而獲得的植物，包括轉(zhuǎn)基因植物。

42、術(shù)語“植物部分”包括植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢(plant?clumps)和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞。所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、莖稈、根、根尖、花藥等。應(yīng)理解為本發(fā)明范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物的部分包括但不限于植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚以及花、莖、果實、葉和根，以上植物部分源自事先用本發(fā)明的dna分子轉(zhuǎn)化的并因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)基因植物或其子代。

43、在一方面，植物部分是植物細(xì)胞。在又另一方面，植物部分是不可再生細(xì)胞或可再生細(xì)胞。在另一方面，植物細(xì)胞是體細(xì)胞。

44、不可再生細(xì)胞是指不能通過體外培養(yǎng)再生為整株植物的細(xì)胞。不可再生細(xì)胞可以在本發(fā)明的植物或植物部分(例如葉)中。不可再生細(xì)胞可以是種子或所述種子的種皮中的細(xì)胞。成熟的植物器官(包括成熟的葉、成熟的莖或成熟的根)包含至少一個不可再生細(xì)胞。

45、在另一方面，植物細(xì)胞是生殖細(xì)胞，如胚珠或作為花粉一部分的細(xì)胞。在一個方面，花粉細(xì)胞是營養(yǎng)(非生殖)細(xì)胞，或精子細(xì)胞。

46、本發(fā)明提供了由包含本發(fā)明所述組成型啟動子的植物或部分的收獲物進行處理以獲得加工農(nóng)產(chǎn)品。術(shù)語“加工農(nóng)產(chǎn)品”指的是由源自包含本發(fā)明組成型啟動子的植物、種子、植物細(xì)胞或植物部分的材料組成的任何組合物或產(chǎn)品。具體的，術(shù)語“加工農(nóng)產(chǎn)品”包括但不限于蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、淀粉、面粉、生物質(zhì)和種子油。

47、本發(fā)明提供了一種組成型啟動子及其用途，具有以下優(yōu)點：

48、1、本發(fā)明首次公開了來自油菜actin基因的組成型啟動子，所述組成型啟動子的核苷酸序列包括seq?id?no:4，且源自seq?id?no:1。

49、2、本發(fā)明組成型啟動子幾乎在植物的大多數(shù)組織和許多類型細(xì)胞中都顯示出活性，特別是在植物的根、莖、葉、花、莢皮、果實中。

50、3、本發(fā)明組成型啟動子可驅(qū)動外源基因在植物組織中組成型的表達。

51、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細(xì)描述。